專利名稱：檢測牛無漿體的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于檢測動物血液病原菌的試劑盒，確切講本發明涉及一種用于檢測牛無漿體的試劑盒。
背景技術：
無衆體(anaplasma)是一類經蝶傳播的專性細胞內寄生菌,主要寄生于牛羊等反芻動物的血細胞中，其引起的疾病被稱為無漿體病。1910年在北非首次發現了牛無漿體病，后來發現該病廣泛分布于世界各地。無漿體病引起動物體重下降，流產，產奶量下降，嚴重者導致死亡，造成嚴重的經濟損失。鑒于此，世界動物衛生組織(OIE)將其列為必須通報的疫病。引起牛無衆體病的病原已證實的有邊緣無衆體(anaplasma marginale)、中央無衆體(anaplasma centrale)、牛無衆體(anaplasma bovis)和嗜吞卩遼細胞無衆體(anaplasmaphagocytophilum)ο牛無衆體(Anaplasma bovis)是無衆體屬(Anaplasma)的一個重要成員，牛無衆體有廣泛的宿主，已經證明它能寄生于牛、羊等反芻動物的體內，牛無漿體經節肢動物-蜱傳播后寄生于宿主動物的血液的單核細胞內。牛無漿體在世界各地廣泛流行，以前我國的牛無漿體病病原中并沒有牛無漿體感染的報道，但在最近我們的調查中發現在我國許多地區存在牛無漿體，并且在某些地區呈高陽性率狀態，應該引起高度重視，但目前針對該病原的檢測方法僅有血涂片染色法和套式PCR方法。血涂片染色法在感染率很低或在感染早期時很難在顯微鏡下檢查出病原，而且操作熟練程度將直接影響診斷結果的準確性。套式 PCR 檢測方法，參見:Kawahara M, et al.2006, Novel genetic variants ofAnaplasma phagocytophilum, Anaplasma bovis, Anaplasma centrale, and a novelEhrlichia sp.1n wild deer and ticks on two major islands in Japan,App1.Environ.Microbiol, 2006.72:1102_1109，但套式PCR檢測過程中容易造成環境污染，而且費時費力。因此，建立一種快速、靈敏、準確又操作方便的檢測方法十分必要。
發明內容
本發明提供一種可克服現有技術不足的用于檢測牛無漿體的試劑盒。本發明的檢測牛無漿體的試劑盒內至少有如下的三條引物探針序列:正向引物SEQ Ns 1，反向引物SEQ No 2和探針SEQ Na 3，其中的探針序列的5端結合有熒光發光基團FAM, 3端結合有連接MGB的非熒光淬滅基團。為方便使用，在本發明 的檢測牛無漿體的試劑盒中還包括有如下成分:熒光定量PCR反應液、標準陽性質粒模板pGEM-Teasy-16S rRNA、陰性質控標準品。其中的熒光定量PCR反應液是由Premix Ex Taq (2X) 12.5yL，正向引引物SEQ Ns I和反向引物SEQ Na 2 (10 μ M )各 0.5 μ L，熒光探針溶液(5 μ Μ) 1.0 μ L，ROX Reference Dye II (50 X )
0.5 μ L，滅菌蒸餾水8.0 μ L組成。另外，本發明檢測牛無漿體的試劑盒中的標準陽性質粒模板pGEM-Teasy-16S rRNA為由正向引物EEl和反向引物EE2擴增的DNA片段構建的pGEM-Teasy重組質粒；而陰性質控標準品可以是滅菌蒸餾水。本發明實際上是一種利用16S rRNA基因檢測牛無漿體的實時熒光定量PCR方法。實時突光定量PCR( real- time fluorescent quantitative polymerasechain reaction,real-time FQ-PCR)技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR技術相比它所具有的特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、自動化程度高、速度快、全封閉反應等優點，使其很快成為科研、臨床診斷的熱點技術。目前，國內外均未有檢測牛無漿體實時熒光定量PCR方法的報道，本發明利用牛無漿體16S rRNA基因作為實時熒光定量PCR檢測靶基因，設計針對牛無漿體16SrRNA基因的特異性引物和探針，從而提供了一種快速、靈敏、準確又操作方便的檢測牛無漿體的方法，填補了技術空白。本發明中，通過對實時熒光定量PCR反應條條件的優化，使本發明具有良好的敏感性、特異性、重復性，其敏感性比套式PCR高10倍，可以用于牛無漿體的快速定量檢測。
圖1為本發明的實時熒光定量PCR標準曲線。圖2為本發明的實時熒光定量PCR靈敏度試驗。從上到下依次為1.0X IO7 — 1.0X 10°拷貝/ μ L的質粒標準品及陰性對照的擴增 結果。圖3套式PCR檢測方法電泳圖。其中M 為 DNA 分子量標準 DL2000 ;1、2、3、4、5、6、7、分別為 1.0XlO6 -1.0XlO0 拷貝/μ L的質粒標準品；8為陰性對照；9陽性對照；10為正常牛全血基因組。圖4為本發明的實時熒光定量PCR特異性試驗。基線以上的為牛無漿體的擴增結果，基線以下的為綿羊無漿體、邊緣無漿體、嗜吞噬細胞無漿體、綿羊泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、中華泰勒蟲、羊巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、支原體、衣原體、螺旋體、弓形蟲和陰性對照的擴增結果。
具體實施例方式本發明以下結合附圖和實施例作詳細說明。本發明的試劑盒中最主要的是如下的三條引物探針序列，即:
ABRTFl (正向引物):5，-CACGCTGTAAACGATGAG-3’SEQNa I
ABRTRl (反向引物):5，-CGTCAATTCCTTTGAGTTTTAG-3， SEQNa 2 ABRTPb (熒光探針):5，(FAM)-ACCTCCGTGTTGTA - (NFQ) - (MGB) 3’ SEQ Na 3
其中的的熒光探針SEQ Ns 3的5端結合有熒光發光基團FAM，3端結合有連接MGB的非熒光淬滅基團。目的片段大小為117 bp。為方便使用，在實際應用的試劑盒內還可設有:熒光定量PCR反應液、標準陽性質粒模板pGEM-Teasy-16S rRNA、陰性質控標準品。在本實施例中熒光定量PCR反應液由Premix Ex Taq (2X >12.5 μ L, 10 μ M 的正向引物 SEQ Ns I 和反向引物 SEQ Ns 2 各 0.5μ L，熒光探針 SEQNs 3 溶液(5 μ Μ) 1.0 μ L，熒光校正液 ROX Reference Dye II (50 X )
0.5 μ L,滅菌蒸懼水8.0 μ L。本發明的實施例中上述的引物和探針委托美國Life Technologies公司合成。
本發明的試劑盒應用實例
1.構建重組質粒標準品。(I)參照文獻 Barlough JE, et al.1996, Nested polymerase chain reactionfor detection of Ehrlichia equi genomic DNA in horses and ticks (Ixodespacificus).Vet.Parasi to 1.63:319 - 329.中的引物 EEl 和 EE2 擴增 16s rRNA 基因，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。(2)以實驗室保存的牛無漿體菌株DNA為模板進行擴增，采用50yL的PCR反應體系，反應條件為94°C預變性3min，然后94°C 30s,54°C 30s,72°C 30s, 35個循環，72°C延伸5min。取5yL擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定為陽性的PCR產物用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒(Transgen,北京)進行純化回收，將回收產物連接到pGEM-Teasy載體(Promega, America)后轉化到大腸桿菌感受態細胞JM-109 (TaKaRa,大連)中，進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆(白斑)進行PCR和測序鑒定。(3)對鑒定為陽性的克隆提取質粒，使用NanoDrop 2000/2000C (ThermoScientific，America)超微量分光光度計測定質粒濃度，并將其換算成拷貝/ μ L，以此作為質粒標準品。將構建好的質粒標準品，系列稀釋為終濃度為1.0X IO8 -1.0XlO0拷貝/ μ L，再進行定量PCR擴增，定量PCR反應體系為25 μ L =Premix Ex Taq (2X) 12.5 yL，正向引物SEQ I和反向引物SEQ 2 (10 μ M )各0.5 μ L，熒光探針SEQ 3 (5 μ Μ)1.0 μ L, ROX Reference Dye II (50 X) 0.5 μ L，DNA 模板 2 μ L，滅菌蒸餾水 8.0 μ L。反應條件為:95°C預變性30s，然后95°C 5s,59°C 15s、72°C 20s，40個循環。在每一循環的延伸溫度結束時設定熒光信號采集點進行實時檢測，每個模板濃度做3個重復，取平均值計算變異系數，實驗均設陰性對照。所建立的實時熒光定量PCR標準曲線參見圖1，模板量與對應的Ct值呈線性相關，相關系數為0.998，擴增效率為101.7%，標準曲線方程為y=-3.281X+41.43。實時熒光定量PCR方法特性分析。( I)敏感性分析
取濃度1.0X IO7 -1.0X 10°拷貝/ μ L的質粒標準品進行靈敏度試驗，結果顯示實時熒光定量PCR方法最低檢出限為IO1拷貝/ μ L，參見圖2，而套式PCR的最低檢出限為IO2拷貝/ μ L參見圖3，顯然本發明比套式PCR檢測方法靈敏度高10倍。(2)特異性分析
利用本文所建立實時熒光定量PCR方法，分別檢測了牛無漿體、綿羊無漿體、邊緣無漿體、嗜吞噬細胞無漿體、綿羊泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、中華泰勒蟲、羊巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、支原體、衣原體、螺旋體和弓形蟲，結果顯示只有牛無漿體呈陽性反應，其他病原體均呈陰性，參見圖4。(3)穩定性分析
取濃度為1.0Χ106 -1.0Χ101拷貝/μ L的5個濃度的標準品進行穩定性分析。先進行批內重復性試驗，對同一批次稀釋的標準品， 每個濃度重復檢測三次，經分析Ct值變異系數在0.10%-1.01%，小于5%。然后進行批間重復性試驗，對3個不同批次稀釋的標準品進行檢測，經分析Ct值變異系數在0.61%-1.88%，小于10%。由此說明本發明具有較好的穩定性。表一批內重復I試驗結果
權利要求
1.測牛無漿體的試劑盒，其特征在于試劑盒至少有如下的三條引物探針序列:正向引物SEQ Ns 1，反向引物SEQ Na 2和探針SEQ Na 3，其中的探針序列的5’端結合有熒光發光基團FAM，3’端結合有連接MGB的非熒光淬滅基團。
2.權利要求1所述的檢測牛無漿體的試劑盒，其特征在于試劑盒中還包括有如下成分:熒光定量PCR反應液、標準陽性質粒模板pGEM-Teasy-16S rRNA、陰性質控標準品。
3.權利要求2所述的檢測牛無漿體的試劑盒，其特征在于熒光定量PCR反應液由Premix Ex Taq (2X >12.5 μ L, 10 μ M 的正向引物 SEQ Ns I 和反向引物 SEQ Ns 2 各 0.5μ L,5 μ M 的熒 光探針 SEQ Ns 3 溶液 1.0 μ L, ROX Reference Dye II (50X ) 0.5 yL，滅菌蒸餾水8.0 μ L組成。
4.權利要求3所述的檢測牛無漿體的試劑盒，其特征在于陰性質控標準品為滅菌蒸餾水。
全文摘要
本發明公開一種用于檢測牛無漿體的試劑盒。本發明的檢測牛無漿體的試劑盒內至少有如下的三條引物探針序列正向引物SEQ №1，反向引物SEQ №2和探針SEQ №3，其中的探針序列的5端結合有熒光發光基團FAM，3端結合有連接MGB的非熒光淬滅基團。本發明應用是一種利用16srRNA基因檢測牛無漿體的實時熒光定量PCR方法。本發明具有良好的敏感性、特異性、重復性，其敏感性比套式PCR高10倍，可以用于牛無漿體的快速定量檢測。
文檔編號C12R1/01GK103088149SQ20131006273
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月28日 優先權日2013年2月28日
發明者殷宏, 遲慶安, 劉志杰, 李有全, 楊吉飛, 陳澤 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所