產共軛亞油酸的食品級重組乳酸乳球菌及其構建方法與應用的制作方法

專利名稱：產共軛亞油酸的食品級重組乳酸乳球菌及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及產共軛亞油酸的食品級重組乳酸乳球菌及其構建方法與應用。
背景技術：
共軛亞油酸(CLA)屬于十八碳二烯酸，是亞油酸(LA)的異構體，包括二十余種組分。其中對順式_9，反式-11共軛亞油酸和反式-10，順式-12共軛亞油酸(trans-10，cis-12 ；tl0cl2-CLA)異構體的生物學活性比較清楚。對tl0cl2_CLA來說，它能夠促進身體的代謝，抑制脂肪的合成，能減少肥胖癥的發生概率。2008年，美國FDA頒發食品許可證，同意將CLA作為食品添加劑使用。目前，CLA已經被許多食品和制藥企業作為保健品生產并出售。自然界中，牛、羊體內的一些瘤胃微生物有合成CLA的能力，這些CLA能夠進入乳汁中，一升牛奶的CLA總量在1.4克左右，其中tl0cl2-CLA的比重小于10%。工業上，將亞油酸堿性異構化后生成CLA，產物是混合物的形式，除了上述兩種CLA組分外，還含有多種異構體雜質，雜質的含量甚至能達到30%以上，這些雜質如果進入人體，容易通過花生四烯酸代謝途徑衍生出多種有負面生物學效應的共軛類異構體。可以看出，如果食品中添加的CLA不含有雜質、成分單一的話，更有利于消費者的健康。在生物技術的支撐下，利用微生物大量生產CLA的單一組分，是一個比較理想的途徑。研究發現，自然界的一些低等菌類具有自身合成tl0cl2-CLA組分的能力，例如，痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)的亞油酸異構酶 PAI (Propionibacterium acnesisoenzyme)就能夠將亞油酸LA異構成tl0cl2_CLA。密碼子優化的pai基因，能夠在哺乳類細胞中異源表達，也可以將亞油酸轉化成tl0cl2-CLA成分(茍克勉，李世麗，亞油酸異構酶在脫氫和異構方面的雙重用途，專利申請號:201110112685.5)。但目前還未有tl0cl2_CLA轉化效率高的重組食品級微生物的報道。

發明內容
本發明所要解決的一個技術問題是提供tl0cl2_CLA轉化效率高的重組乳酸乳球菌及其構建方法與應用。本發明所提供的一株tl0cl2_CLA轉化效率高的重組乳酸乳球菌，是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-75,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.7148。本發明所提供的構建tl0cl2_CLA的轉化效率高重組乳酸乳球菌的方法，包括將蛋白質PAI的編碼基因導入作為 宿主菌的乳酸乳球菌中得到反式-10，順式-12共軛亞油酸的轉化效率高于所述宿主菌的重組乳酸乳球菌的步驟；所述蛋白質PAI為如下a)或b)的蛋白質:a)由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
b)將SEQ ID N0.2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有亞油酸異構酶活性，或具有亞油酸異構酶活性由a)衍生的蛋白質。其中，所述蛋白質PAI具有亞油酸異構酶活性。SEQ ID N0.2由424個氨基酸殘基組成。上述方法中，所述tl0cl2_CLA的轉化效率是指所述宿主菌或重組乳酸乳球菌以亞油酸為底物，培養得到的菌體中的反式-10，順式-12共軛亞油酸的質量與菌體中反式-10，順式-12共軛亞油酸和亞油酸質量之和的比值。所述蛋白質PAI的編碼基因具體可為如下I)或2)或3)的DNA分子:I)其編碼序列是SEQ ID N0.1的DNA分子；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質PAI的DNA分子；3)與I)限定的DNA分子具有90%以上的一致性且編碼所述蛋白質PAI的DNA分子。其中，SEQ ID N0.1由1275個核苷酸組成，其編碼序列是第1-1275位。上述方法中，所述宿主菌為食品級乳酸乳球菌和/或其衍生菌株。所述蛋白質PAI的編碼基因通過重組食品級表達載體導入所述宿主菌中。其中，所述食品級乳酸乳球菌是指可食用的乳酸乳球菌，可為乳酸乳球菌NZ3900或其衍生菌株、和/或乳酸乳球菌MG1363或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌LM0230或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌IL1403或其衍生菌等。所述重組食品級表達載體是篩選標記為食品級篩選標記的表達載體，所述食品級篩選標記具體可為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的IacF基因。上述方法中，所述食品級乳酸乳球菌可為乳酸乳球菌NZ3900或其衍生菌株、和/或乳酸乳球菌MG1363或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌LM0230或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌IL1403或其衍生菌等，所述重組食品級表達載體可為表達所述蛋白質PAI的編碼基因的重組食品級表達載體。進一步，所述重組食品級表達載體具體可為將所述蛋白質PAI的編碼基因插入PNZ8149的多克隆位點得到的重組表達載體。上述任一所述方法構建的反式-10，順式-12共軛亞油酸的轉化效率高于所述宿主菌的重組乳酸乳球菌也屬于本發明的保護范圍。本發明還提供了表達所述蛋白質PAI的編碼基因的重組食品級表達載體。其中，所述重組食品級表達載體具體可為將所述蛋白質PAI的編碼基因插入PNZ8149的多克隆位點得到的重組表達載體。

本發明所提供的tl0cl2_CLA轉化效率高的重組乳酸乳球菌具體可為食品級乳酸乳球菌，優選為基因工程方法生產的重組型乳酸乳球菌，所述重組乳酸乳球菌整合了外源的亞油酸異構酶PAI基因，該菌株能夠表達亞油酸異構酶，該酶能夠將亞油酸生物催化成反式-10，順式-12共軛亞油酸。本發明的實驗證明，將已申請發明專利(茍克勉，李世麗，亞油酸異構酶在脫氫和異構方面的雙重用途，專利申請號:201110112685.5)所述的PAI的編碼基因，插入食品級表達載體pNZ8149中，然后轉化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900,進而獲得穩定表達PAI基因的食品級重組乳酸乳球菌，能夠有效地生產tl0cl2-CLA，產物tl0cl2_CLA的含量占菌體脂肪酸總量的15.19-23.91% ;其中，效果最好的重組菌株中，tl0cl2-CLA含量超過了菌體脂肪酸總量的23.91%，底物亞油酸異構成產物tl0cl2-CLA的轉化效率超過了37.6% ;本發明為利用重組乳酸乳球菌生產tl0cl2-CLA的相關應用提供了方法和菌株。生物材料信息分類命名:乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株編號:PA1-75保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱:CGMCC地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏日期:2013年01月18日保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.7148下面結合具體實施例詳細描述本發明，這些實施例用于理解而不是限制本發明。


圖1為各菌株的菌體中亞油酸和反式-10，順式-12共軛亞油酸占菌體總脂肪酸的
百分含量。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ3900 (購自德國Mo Bi Tec公司)，是食品級菌株，為乳糖缺陷型菌株，不能利用乳糖，只能在含葡萄糖的培養基中生長。pNZ8149 (購自德國Mo Bi Tec公司)，是食品級表達載體，含有代謝乳糖的基因。實施例1、構建tl0cl2_CLA轉化效率高的重組乳酸乳球菌本實施例以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900作為宿主菌，以PNZ8149-PAI作為重組食品級表達載體為例，闡明構建tl0cl2_CLA轉化效率高的重組乳酸乳球菌的方法。該方法將pNZ8149_PAI轉入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900菌后，利用乳糖培養基篩選重組菌株，能夠生長的重組菌體就可能攜帶外源的pai基因，這個基因表達的PAI異構酶會將亞油酸轉化成tl0cl2-CLA。這個表達系統避免了抗生素的使用，也不產生內毒素，是一種高效的食品級載體表達系統。在此，通過上述實驗原理和方法，將pai基因通過食品級表達載體導入食品級乳酸乳球菌中，獲得了能夠生產tl0cl2-CLA的食品級工程菌株。具體如下:1、表達蛋白質PAI的編碼基因的重組食品級表達載PNZ8149-PAI的構建為了將SEQ ID N0.1所示的優化pai基因插入pNZ8149質粒，設計PCR弓丨物(sense:5f _aaa act gca gcc atg age att agt aag gac age a_3，, ant1-sense:5f -eggggt acc tta gac aaa gaa ccg ggt cac ca_3’)，在上下游引物間分別引入了 Pst I 和Acc651酶切位點，以SEQ ID N0.1所示的優化pai基因為模板，用高保真pfu酶(天根生化科技有限公司)擴增SEQ ID N0.1所示的優化pai基因，PCR條件是:95°C，5min ;94°C，30sec，60°C，30sec, 72°C，150sec,共 32 個循環；72°C, IOmin0 獲得的 PCR 產物用 Pst I 和 Acc651雙酶切后，電泳回收片段通過Pst I和Acc651雙酶切位點連接到pNZ8149質粒(購自德國MoBiTec公司)上，構建成pNZ8149-PAI質粒，酶切鑒定和DNA測序證明，pNZ8149_PAI中的優化pai基因的核苷酸序列是SEQ ID N0.1。SEQ ID N0.1所示的優化pai基因編碼SEQID N0.2 的蛋白 PAI。常規的苯酚/氯仿/異戊醇抽提法純化pNZ8149-PAI質粒，用于轉化食品級乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900。2、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900普通培養和感受態細菌的準備參照德國MoBiTec公司產品說明書(http: //www.mobitec.com/download/handbook/VS-NICE Handbook, pdf )操作。具體地，_80°C冰箱解凍的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900,按1%稀釋接種至5毫升的基礎培養液(Ml7肉湯+0.5M蔗糖+2.5%甘氨酸+0.5%葡萄糖)中，30°C靜置培養；第二天將此5毫升溶液再用50毫升上述基礎培養液稀釋，30°C靜置培養；第三天將上述25毫升培養液稀釋到200毫升新鮮基礎培養液中，繼續培養，當菌液的OD6tltl值達到0.2-0.3時，收集菌體，4°C離心(6000Xg，20min)后，用200毫升的0.5M蔗糖+10%甘油溶液重懸沉淀菌體，繼續離心(6000 X g, 20min);再用100毫升的0.5M蔗糖+10%甘油+50mM EDTA溶液重懸菌體，冰浴15min ;4°C繼續離心(8000 X g，20min)，用50毫升0.5M蔗糖+10%甘油溶液洗滌沉淀的菌體，4°C離心(6000Xg，20min) 后，用2毫升0.5M蔗糖+10%甘油溶液重懸菌體，40微升分裝到預冷的1.5-mL的微型離心管中置于冰上待用，或液氮速凍后保存于_80°C冰箱。3、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900的電轉化及重組菌落的鑒定上述步驟2準備的40微升乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900感受態細胞中，加入步驟I制備的5微升pNZ8149-PAI純化質粒，輕輕混勻后，轉移到2_mm的電轉杯(美國Bio-Rad公司)中，冰浴5分鐘后，使用Gene pulser X-cell型電轉儀(美國Bio-Rad公司)進行電轉化，電轉參數是:2000V，200 Ω，25 μ F ;隨后，立即加入I毫升溶液(步驟2所述基礎培養液+20mM MgCl2+2mM CaCl2)中，冰浴5分鐘；然后，30°C靜置培養約I小時；吸取適量復蘇的菌液，涂布于Elliker固體培養基(含0.004%溴甲酚紫指示劑和0.5%乳糖)上，30°C恒溫培養36-48小時，篩選單克隆轉化菌落，其中，陽性菌落周圍培養基呈黃色。將上述的陽性單克隆菌落挑至I毫升溶液(M17肉湯+0.5%乳糖)中，30°C過夜培養；第二天，吸取其中的200微升溶液離心，再用50微升裂解液(4M鹽酸胍+50mMEDTA+50mM Tris-HCl+10mM DTT)重懸，沸水浴煮15分鐘，離心并用蒸餾水洗滌兩次，最后用20微升蒸餾水重懸，取I微升用作菌體PCR擴增pai基因的模板。設計pai基因內部一對特異性弓I物(sense:5，-caggattccacgattacac-3J , ant1-sense:5f -cagtcaggaccagcacat-3，)。PCR條件是:95°C, IOmin ；94°C, 30sec,60°C, 30sec, 72°C，lmin，共 35 個循環；72°C,IOmin0 PCR產物進行DNA凝膠電泳分析并拍照。PCR陽性的重組菌株，按照常規方法提取質粒，進行酶切鑒定，并且測序，對含有SEQ ID N0.1所示的優化pai基因的重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的菌株(命名為重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-22、PA1-45、PA1-75、PA1-76、PA1-80、PA1-91)繼續下面的步驟 4 操作。
同時，按照上述方法將pNZ8149導入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ3900得到重組菌株作為空載體對照菌株(命名為重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) P8149)。4、乳酸乳球菌誘導表達，脂肪酸含量測定分別從5毫升過夜培養的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900、重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) P8149、PA1-22、PA1-45、PA1-75、PA1-76、PA1-80 和 PA1-91菌液中，取其中40微升接種到10毫升M17肉湯溶液中，30°C培養2_3小時，當0D_達到
0.4時，往菌液中同時添加誘導劑乳酸鏈球菌肽nisin (美國Sigma公司)和底物亞油酸(Sigma, L1012)，要求兩種試劑的終濃度分別達到每毫升50納克和0.5毫克，繼續培養48小時，離心收集菌體，參照標準方法進行脂肪酸甲酯化處理，測定菌體中包括tl0cl2-CLA和亞油酸在內的各種脂肪酸的百分含量。具體步驟是:將菌體轉移至帶聚四氟乙烯瓶蓋的玻璃甲基化管中，每份加4毫升氯乙酰甲醇(氯乙酰:甲醇=1:10)和2毫升正己烷，蓋緊管蓋，80°C水浴2小時，取出冷卻至室溫后，再加7%的K2CO3溶液5毫升，振蕩混勻后靜置10分鐘，離心(IOOOrpm, 5min)分離的上清直接進樣到HP-88型色譜柱(美國Agilent公司),使用HP7890全自動氣相色譜儀(Agilent)進行分析，具體氣相色譜程序是:初始溫度120°C，保持Imin ;以10°C/min的速度升溫至175°C，保持IOmin ;再以5°C/min的速度升溫至210°C，保持5min ;再以5°C /min的速度升溫至240°C，保持IOmin后結束。載氣為氦氣，分流比為10:1。采用外標法(標準曲線法)對脂肪酸進行定量。參照脂肪酸標準品(Sigma,47885-U和05632)的峰面積,將儀器檢測到的信號,用GC ChemStation Software (Agilent)軟件處理，計算相對含量，細胞培養和脂肪酸測定的實驗連續重復4次，實驗數據的顯著性分析采用t檢驗。上述條件下，標準品中的tl0cl2-CLA、亞油酸保留時間分別為31.166分鐘、28.239 分鐘。重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-22、PA1-45、PA1-75、PA1-76、PA1-80和PA1-91菌體中出現了保留時間分別為31.176分鐘、31.180分鐘、31.181分鐘、31.182分鐘、31.179分鐘、31.175分鐘的tl0cl2_CLA的層析峰；乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) NZ3900、重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) P8149、PA1-22、PA 1-45, PA1-75、PA1-76、PA1-80和PA1-91菌體中出現了保留時間分別為28.241分鐘、28.262分鐘、28.261分鐘、28.260分鐘、28.281分鐘、28.267分鐘、28.265分鐘、28.278分鐘的亞油酸層析峰。結果表明乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900 (宿主菌)、重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) p8149 (空載體對照菌株)亞油酸的含量占菌體脂肪酸總量的64%左右，沒有發生異構化過程，菌體內檢測不到產物tl0cl2-CLA ;相反，轉化PNZ8149-PAI質粒的所有菌株，包括重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-22、PA1-45、PA1-75、PA1-76、PA1-80和PA1-91等菌株，都能夠穩定表達pai基因，翻譯的異構酶PAI可以有效的生產tl0cl2-CLA，產物tl0cl2-CLA的含量占菌體脂肪酸總量的15.19-23.91% (質量百分含量)。從圖1也可以看出，不同菌株間，產物和底物的含量存在明顯的不同(圖1中，同一組分內，標注不同字母時，表示菌株間存在顯著差異，即P〈0.05)。其中，重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-75菌體中tl0cl2_CLA的含量最高，占菌體總脂肪酸含量的23.91%，顯著優于重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)PA1-22、PA1-45、PA1-76、PAI_80、PA1-90等其它重組菌株(p〈0.05)，它的tl0cl2-CLA轉 化效率(菌體中的反式-10，順式-12共軛亞油酸的質量與菌體中反式-10，順式-12共軛亞油酸和亞油酸質量之和的比值)，即tl0cl2-CLA與(tl0cl2-CLA+LA)質量的比值，達到了 37.62%。這些結果說明，PAI重組乳酸菌能夠有效的將亞油酸底物異構成tl0cl2-CLA產物，其中重組乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) PA1-75效果最好，為食品級的PAI重組乳酸菌的開發提供了依據和菌株。其中，重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-75已于2013年01月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號=CGMCCN0 .7148。
權利要求
1.重組乳酸乳球菌，其特征在于:所述重組乳酸乳球菌是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) PA1-75，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.7148。
2.構建重組乳酸乳球菌的方法，包括將蛋白質PAI的編碼基因導入作為宿主菌的乳酸乳球菌中得到反式-10，順式-12共軛亞油酸的轉化效率高于所述宿主菌的重組乳酸乳球菌的步驟； 所述蛋白質PAI為如下a)或b)的蛋白質: a)由SEQID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； b)將SEQID N0.2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有亞油酸異構酶活性，或具有亞油酸異構酶活性由a)衍生的蛋白質。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述蛋白質PAI的編碼基因為如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)其編碼序列是SEQID N0.1的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質PAI的DNA分子； 3)與I)限定的DNA分 子具有90%以上的一致性且編碼所述蛋白質PAI的DNA分子。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述宿主菌為食品級乳酸乳球菌和/或其衍生菌； 所述蛋白質PAI的編碼基因通過重組食品級表達載體導入所述宿主菌中。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述食品級乳酸乳球菌為乳酸乳球菌NZ3900或其衍生菌株、和/或乳酸乳球菌MG1363或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌LM0230或其衍生菌、和/或乳酸乳球菌IL1403或其衍生菌，所述重組食品級表達載體為權利要求8或9所述的重組食品級表達載體。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:所述重組乳酸乳球菌為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) PA1-75,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.7148。
7.由權利要求2-5中任一所述方法構建的反式-10，順式-12共軛亞油酸的轉化效率高于所述宿主菌的重組乳酸乳球菌。
8.表達權利要求2或3所述蛋白質PAI的編碼基因的重組食品級表達載體。
9.根據權利要求8所述的重組食品級表達載體，其特征在于:所述重組食品級表達載體是將權利要求2或3所述蛋白質PAI的編碼基因插入PNZ8149的多克隆位點得到的重組表達載體。
10.權利要求1所述的重組乳酸乳球菌或權利要求2-5中任一所述方法構建的重組乳酸乳球菌在生產反式-10，順式-12共軛亞油酸中的應用。
全文摘要
本發明公開了產共軛亞油酸的食品級重組乳酸乳球菌及其構建方法與應用。該構建重組乳酸乳球菌的方法，包括將蛋白質PAI的編碼基因導入作為宿主菌的乳酸乳球菌中得到反式-10，順式-12共軛亞油酸的轉化效率高于所述宿主菌的重組乳酸乳球菌的步驟；所述蛋白質PAI為如下a)或b)的蛋白質a)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將SEQ ID No.2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有亞油酸異構酶活性，或具有亞油酸異構酶活性由a)衍生的蛋白質。本發明的食品級重組乳酸乳球菌能夠有效地生產t10c12-CLA，t10c12-CLA的含量占菌體脂肪酸總量的15.19-23.91%。
文檔編號C12N15/74GK103146628SQ20131006610
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月1日 優先權日2013年3月1日
發明者茍克勉, 李世麗 申請人:茍克勉