專利名稱：一種沙門菌熒光定量pcr檢測和分型的引物、探針及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及沙門菌分子診斷的熒光定量PCR檢測試劑和檢測方法。此發明有效擴增所有株的沙門菌(沙門菌ニ個種、腸道沙門菌的6個亞種)。此外，高分辨率熔解曲線技術方便地把沙門菌分成3組:i)重要的致病菌腸道亞種(熔解溫度69.5°C)，ii)豪頓亞種(64.20C )和雙亞利桑拉亞種(63.8°C), iii)邦戈爾沙門菌(54.8°C )、英迪加亞種(57°C )、薩拉姆亞種(55.5°C)、亞利桑那亞種(54.50O0
背景技術：
沙門菌(Salmonella spp.)能引起人和動物多種不同臨床表現的沙門菌病，也是人類食物中毒的主要病因之一，對醫學、獸醫學和公共衛生學均十分重要。沙門菌屬分為腸道沙門菌(S.enterica)和邦戈爾沙門菌(S.bongori)。腸道沙門菌又分為6個亞種:腸道亞種(S.enterica enterica簡寫為S.enterica),薩拉姆亞種(S.salamae),亞利桑那亞種(S.arizonae)，雙亞利桑那亞種(S.diarizonae)，豪頓亞種(S.houtanae)以及英迪加亞種(S.1ndica)。沙門菌感染的診斷主要依賴于細菌培養、血清凝集試驗以及分子診斷技木。但是，沒有単一的診斷方法可以方便地檢測和區分所有株的沙門菌(沙門菌ニ個種、腸道沙門菌的6個亞種)。
發明內容
本發明的目的在于提供ー種快速、特異性強、靈敏度高、適合臨床使用的檢測所有株沙門菌的定量PCR檢測技木。同時基于高靈敏度熔解曲線技術方便的區分邦戈爾沙門菌和腸道沙門菌的 不同亞種。本發明的原理和核心是科學地設計擴增和檢測沙門菌的特異、高效的引物和探針。在保證設計的引物高效擴增沙門菌、設計的探針特異檢測沙門菌的同吋，確保此引物和探針不擴增和檢測其它類似的細菌。此外，設計的探針同沙門菌的堿基序列吻合程度不同；因此，高分辨率熔點曲線技術會顯示沙門菌的不同熔解溫度，這可以方便的用于基因分型。從GenBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)獲取如下沙門菌(種和亞種的代表株)以及相關細菌的ttrRSBCA的序列后,用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法對所有序列進行對齊:邦戈爾沙門菌，基因序列號，AY578066;腸道沙門菌薩拉姆亞種，基因序列號，AY578070;腸道沙門菌亞利桑那亞種，基因序列號，CP000880;腸道沙門菌雙亞利桑那亞種，基因序列號，AY578069.1;腸道沙門菌豪頓亞種，基因序列號，AY578068;腸道沙門菌英迪加亞種，基因序列號，AY578065);腸道沙門菌腸道亞種的代表株:S.Gallinarum,基因序列號，AM933173; S.Enteritidis,基因序列號，AM933172;S.Weltevreden,基因序列號,FR775221;S.Paratyphi,基因序列號，CP000857; S.Typhi LT2,基因序列號，AF282268; S.Dublin,基因序列號，CPOO1144。圖1、圖2、圖3、圖4顯示設計的引物和探針如下:上游引物:5’-GATGTTYCTTAGCGCYTTACAGGC-3’ (SEQ ID N0.1)下游引物:5’-CCGACMGCGTAATATTTGGCTGAC-3’ (SEQ ID N0.2)探針-1:5，-ATACGCTTTCCGGCACGGCAAT-6-FAM-3，(SEQID N0.3)探針-2:5，-LCRED640-CGTCRGTGGATTWCCGTCGCCCT-Phosphate-3’(SEQ ID N0.4)本發明還公開了沙門菌的熒光定量PCR檢測和分型試劑盒，包括包括5倍定量PCR反應液22 μ l，以及22 μl的5倍引物和探針的混合液；所述引物和探針混合液含濃度為5uM的上游引物、5 μ M下游引物、1 μ M的探針-1、1 μ M的探針-2。本發明進一歩提供了沙門菌分型方法，該方法包括以下步驟:(1)用上述引物和探針PCR擴增待測樣本，擴增出210bp的條帶，且熒光檢測在640nm波長增強的為沙門菌陽性樣本；(2) PCR完成后，對步驟(1)沙門菌陽性樣本擴增產物進行高分辨率熔解曲線分析，根據熔解溫度對沙門菌進行分型，分型標準是:i)重要的致病菌腸道亞種(熔解溫度69.5°C), ii)豪頓亞種(熔解溫度64.2°C)和雙亞利桑拉亞種(熔解溫度63.8°C)，iii)邦戈爾沙門菌(熔解溫度54.8 ℃ )、英迪加亞種(熔解溫度57 ℃ )、薩拉姆亞種(熔解溫度55.5℃、亞利桑那亞種(熔解溫度54.5℃沙門菌PCR特異性的確定:本發明的PCR技術特異性從三個方面得到保證。i)由Intergrated DNA Technology公司合成如下6個沙門菌的代表株,此序列涵蓋PCR的擴增區域:邦戈爾沙門菌，腸道沙門菌薩拉姆亞種，腸道沙門菌亞利桑那亞種，腸道沙門菌雙亞利桑那亞種，腸道沙門菌豪頓亞種，腸道沙門菌英迪加亞種，腸道沙門菌腸道亞種的代表株傷寒沙門菌。用設計的PCR系統(上游引物、下游引物、探針-1、探針-2)對合成的沙門菌進行PCR擴增擴增；ii)對15株沙門菌陽性株的DNA進行PCR擴增；iii)對陰性對照和其它類似的格蘭氏陰性細菌的核酸(Escherichia coli, Pasteurella multocida andPseudomonas aeruginosa)進行PCR擴增；iv)觀察以上擴增對象在PCR過程中突光強度(640nm)的變化，以及PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶的大小。熒光在640nm波長出現或增強，顯示陽性；沙門菌的PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示預期的210bp的條帶；
iii)對擴增的PCR產物進行進行測序，測序的結果和GenBank的序列進行比較。結果顯示，設計的沙門菌PCR特異的擴增沙門菌的不同種和亞種，而不擴增其他類似的細菌。沙門菌PCR的靈敏度的確定:由Intergrated DNA Technology合成沙門菌及相關細菌的ttrRSBCA的序列。依據合成物的分子量和絕對重量以及PicoGreen的DNA定量技木，計算合成物所含的ttrRSBCA的基因拷貝的絕對數目。隨后，對合成物進行稀釋，制備每10 u l合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝的ttrRSBCA。用上述的PCR系統擴增含不同濃度ttrRSBCA的沙門菌，依此確定本發明檢測沙門菌的靈敏度。結果顯示，此發明可以擴增反應系統10拷貝的沙門菌ttrRSBCA。分型鑒別:PCR完成后，對沙門菌的不同種和亞種的擴增產物進行高分辨率熔解曲線分析，觀察不同株沙門菌的熔解溫度。由于設計的引物特異地擴增所有株的沙門菌，而設計的探針和不同種和亞種沙門菌有不同程度的差異(圖3、圖4)，這樣不同株的沙門菌會顯示不同的熔解溫度，而方便的用于基因分型。高分辨率熔解曲線技術方便地把沙門菌分成3組(圖5):i)重要的致病菌腸道亞種(熔解溫度69.5°C), ii)豪頓亞種(熔解溫度64.2°C)和雙亞利桑拉亞種(熔解溫度63.8°C)，iii)邦戈爾沙門菌(熔解溫度54.8で)、英迪加亞種(熔解溫度57°C)、薩拉姆亞種(熔解溫度55.5°C)、亞利桑那亞種(熔解溫度54.50O0與現有技術相比，本發明的優點在于快速、特異、靈敏地檢測所有株的沙門菌，而且方便地對沙門菌進行基本分子定型。i)傳統的的沙門菌的培養和分離(增值培養、選擇和篩選培養)、鑒定、生化試驗等的流程需要2-4天，本發明僅需2-4個小時(包括DNA提取約90分鐘、PCR約60分鐘、高分辨率熔解曲線分析5分鐘、結果判定10分鐘)；ii)傳統的細菌培養檢測沙門菌法，需要活的、可繁殖的細菌，而此方法僅需要沙門菌的核酸，不需要活的細菌；可以凍存樣品用于本發明的沙門菌檢測，對采樣的要求降低，而易于本技術的推廣；iii)本發明是定量的技木，而傳統的沙門菌分離技術只給與陽性或者陰性的定性結果；
iv)現有的沙門菌的PCR診斷方法主要擴增對象是腸道沙門菌腸道亞種，而本方法可以擴增沙門菌的2個種和腸道沙門菌的6個亞種；更有臨床意義的是，本發明可以方便的把主要病原菌(腸道沙門菌腸道亞種)和邦戈爾沙門菌、腸道沙門菌的其它亞種區分開。本發明的技術相比，可以方便地廣泛的用于診斷人畜沙門菌的感染和細菌性食物中毒。
圖1:沙門菌熒光定量PCR的上游引物。上游引物的序列為:5’-GATGTTYCTTAGCGCYTTACAGGC-3’，含 2 個 degenerate堿基設計(Y)，能有效地擴增邦戈爾沙門菌、腸道沙門菌的5個亞種(薩拉姆亞種，亞利桑那亞種，雙亞利桑那亞種，豪頓亞種，英迪加亞種)、腸道沙門菌腸道亞種的代表株(S.Gallinarum, S.Enteritidis, S.ffeltevreden, S.Paratyphi, S.Typhi LT2, S.Dublin)。
圖2:沙門菌熒光定量PCR的下游引物。下游游引物的序列為:5’-CCGACMGCGTAATATTTGGCTGAC-3’，含 I 個 degenerate 堿基設計(M)。引物和圖示的序列成反義關系。PCR擴增、凝膠電泳等確認，此序列能有效地擴增邦戈爾沙門菌、腸道沙門菌的5個亞種(薩拉姆亞種，亞利桑那亞種，雙亞利桑那亞種，豪頓亞種,英迪加亞種)、腸道沙門菌腸道亞種的代表株(S.Gallinarum, S.Enteritidis, S.ffeltevreden, S.Paratyphi, S.Typhi LT2, S.Dublin)。圖3:沙門菌熒光定量PCR的6-FAM探針。探針-1(6-FAM 探針)的序列為 5’ -ATACGCTTTCCGGCACGGCAAT-6-FAM-3，，和不同株的沙門菌ttrRSBCA基因有1-3個堿基的不吻合。PCR擴增、凝膠電泳等確認，探針和PCR產物較小程度的不吻合，能夠有效地檢測PCR產物，而顯示不同的熔解溫度，用于分子定型。此探針和探針_2能有效地檢測邦戈爾沙門菌、腸道沙門菌的5個亞種(薩拉姆亞種，亞利桑那亞種，雙亞利桑那亞種，豪頓亞種，英迪加亞種)、腸道沙門菌腸道亞種的代表株(S.Gallinarum, S.Enteritidis, S.ffeltevreden, S.Paratyphi, S.Typhi LT2, S.Dublin)。
圖4:沙門菌熒光定量PCR的LCRed-640探針。探針-2 (LCred-640探針)的序列為
5，-LCRED640-CGTCRGTGGATTWCCGTCGCCCT-Phosphate-3，，含ー個 degenerate 堿基，和不同株的沙門菌ttrRSBCA基因有1-2個堿基的不吻合。PCR擴增、凝膠電泳等確認，探針和PCR產物較小程度的不吻合，能夠有效地檢測PCR產物，而顯示不同的熔解溫度，用于分子定型。此探針和探針-1能有效地檢測邦戈爾沙門菌、腸道沙門菌的5個亞種(薩拉姆亞種，亞利桑那亞種，雙亞利桑那亞種，豪頓亞種，英迪加亞種)、腸道沙門菌腸道亞種的代表株(S.Gallinarum, S.Enteritidis, S.ffeltevreden, S.Paratyphi, S.Typhi LT2, S.Dublin)。圖5:不同種和亞種沙門菌的高分辨率熔解曲線分析。PCR完成后，對沙門菌邦戈爾種和腸道沙門菌的6個亞種的DNA擴增產物進行高分辨率熔解曲線分析，觀察不同種和亞種的熔解溫度。設計的探針-1和探針_2和不同株沙門菌的序列有不同程度的堿基序列不吻合(圖3、圖4)。因此，高分辨率熔解曲線技術方便地把沙門菌分成3組:i)重要的致病菌腸道亞種(熔解溫度69.5°C )，ii )豪頓亞種(熔解溫度64.2V )和雙亞利桑拉亞種(熔解溫度63.8°C )，iii)邦戈爾沙門菌(熔解溫度54.8°C )、英迪加亞種(熔解溫度57で)、薩拉姆亞種(熔解溫度55.5で)、亞利桑那亞種(熔解溫度54.5°C)。陰性對照的樣品不顯示熔解峰。
具體實施例方式本發明的PCR檢測方法所用引物和探針的核苷酸序列如下:上游引物5 ‘-GATGTTYCTTAGCGCYTTACAGGC-3 ‘下游引物5 ‘-CCGACMGCGTAATATTTGGCTGAC-3 ‘探針-1:5‘-ATACGCTTTCCGGCACGGCAAT-6-FAM-3 ‘探針-25 <-LCRED640-CGTCRGTGGATTWCCGTCGCCCT-Phosphate-3 ‘本發明的檢測方法過程如下:(I)制備 PCR 用的標準定量試劑(standard)。由 Intergrated DNA Technology合成沙門菌ttrRSBCA的序列，此序列涵蓋PCR的擴增區域。依據合成物的分子量和絕對重量以及PicoGreen的DNA定量技術，計算合成物所含的ttrRSBCA的基因拷貝數目。隨后，對合成物進行稀釋，制備每10 U I合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝的ttrRSBCA，作為PCR用的標準定量試劑。(2)制備待檢樣品的DNAホ旲板。動物幾便、雞肉樣品等待測樣品保存于Eppendorf管(-20° C或者長期保存-80° C)，用于DNA純化，純化的DNA洗脫在IOOiU TltlEai (含IOmM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH8.5)作為 PCR 的擴增模板。(3)PCR擴增體系。20 U I的擴增體系包含10 U I的樣品DNA模板或者定量標準試劑(standard)、IxPCR緩沖液、I U M上游引物、I y M下游引物、0.2 y M的探針_1、0.2 y M的探針-2、2個單位的商業化Taq酶、200 ii M dNTP。(4) PCR擴增循環參數。PCR擴增包括18個溫度遞減的高嚴謹循環(high-stringency step-down)和 25 個欠嚴謹的突光獲得循環(relaxed-stringencyfluorescence acquisition)。18 個溫度遞減的高嚴謹循環:6xl5sec I 95。C，60sec I74° C;9xl5sec 95° C, 60sec 0 } 72 ° C; 3xl5sec I 95 ° C, IOsec 70 ° C, 15sec 72° C.25 個欠嚴謹的熒光獲得循環:25xl5sec 95 ° C，8sec I 58 ° C，IOsec Q65。C, andl5sec I 72° C。(5)高分辨率熔解曲線分析。PCR擴增結束后，立即實施高分辨率熔解曲線分析，溫度從38° C上升到80° C，以每秒0.2° C遞增。數據分析是分析640nm:530 nm(F2/Fl)的熒光強度的比例。F2/F1的第一衍生值(_d(F2/Fl)/dt)被讀為該DNA的熔解溫度。(6) PCR結果的判定和定量分析。DNA模板的制備過程均設有DNA提取的陰性和陽性對照，隨后的PCR擴增對象包括待測樣品的DNA模板、DNA提取的陰性和陽性對照、定量的標準試劑(每10 u I standard含IO4, IO3, IO2, IO1拷貝的沙門菌ttrRSBCA)。本發明的PCR擴增效率高，有效地擴增含IO1拷貝的沙門菌ttrRSBCA的standard。實施例1:沙門菌標準株的PCR擴增用血平板復蘇15株保存的腸道沙門菌腸道亞種傷寒血清型，進行培養。細菌菌落放置于IXPBS緩沖液中，置于100°C水中水浴5分鐘，4°C 10000rpm/min離心10分鐘，取IOiU作為PCR模板。用本發明技術進行PCR擴增以及高分辨率熔解曲線分析(具體技術細節如上所迷)。結果顯示，PCR能特異高效的擴增腸道沙門菌腸道亞種傷寒血清型，且出現69° C的熔解溫度。 實施例2:健康犬糞便攜帯沙門菌的檢測收集的新鮮糞便立即凍存于_80°C冰箱，后取出200mg用于核酸提取(用FastDNA Kit方法)，取IOyl作為PCR模板。用本發明技術進行PCR擴增以及高分辨率熔解曲線分析(具體技術細節和參數如上所述)。待測的127個糞便樣品中，10個為陽性(10/127，7.9%)。熔解曲線分析表明并經基因測序證實，其中7例為腸道沙門菌腸道亞種(熔解溫度69°C，2例為腸道沙門菌豪頓亞種(熔解溫度64.2°C), I例為腸道沙門菌亞利桑那亞種(熔解溫度54.5℃。
權利要求
1.一種沙門菌的熒光定量PCR檢測和分型的引物及探針，其特征在于檢測引物為: 上游引物:5’ -GATGTTYCTTAGCGCYTTACAGGC-3， 下游引物:5 ’ -CCGACMGCGTAATATTTGGCTGAC-3， 所述探針為:探針-1:5’ -ATACGCTTTCCGGCACGGCAAT-6-FAM-3’探針-2:5，-LCRED640-CGTCRGTGGATTWCCGTCGCCCT-Phosphate-3，。
2.一種沙門菌的熒光定量PCR檢測和分型試劑盒，包括5倍定量PCR反應液22 U I,以及22 的5倍引物和探針的混合液；所述引物和探針混合液含濃度為5 PM的上游引物、5 PM下游引物、1 PM的探針-1、1 PM的探針-2。
3.一種沙門菌分型方法，該方法包括以下步驟: (1)用權利要求1引物和探針PCR擴增待測樣本，擴增出210bp的條帶，且熒光檢測在640nm波長增強的為沙門菌陽性樣本； (2)PCR完成后，對步驟(I)沙門菌陽性樣本擴增產物進行高分辨率熔解曲線分析，根據熔解溫度對沙門菌進行分型，分型標準是:i)重要的致病菌腸道亞種熔解溫度69.5°C，ii)豪頓亞種，熔解溫度64.2°C;雙亞利桑拉亞種熔解溫度63.8°C，iii)邦戈爾沙門菌熔解溫度54.8°C、英迪加亞種熔解溫度57°C、薩拉姆亞種熔解溫度55.5°C、亞利桑那亞種熔解溫度 54.5 0C o
全文摘要
一種沙門菌的熒光定量PCR檢測和分型的引物、探針及試劑盒。所述引物序列如SEQIDNO.1和2所示，所述探針為SEQIDNO.3和4。用上述引物和探針PCR擴增待測菌，擴增出210bp條帶，且熒光檢測在640nm波長增強的為沙門菌陽性樣本；再根據熔解溫度可對沙門菌進行分型。本發明的技術優勢明顯，具有很高的特異性和敏感,可以方便的把主要病原菌(腸道沙門菌腸道亞種)和邦戈爾沙門菌、腸道沙門菌的其它亞種區分開。本發明的技術相比，可以方便地廣泛的用于診斷人畜沙門菌的感染和細菌性食物中毒。
文檔編號C12Q1/68GK103114148SQ201310068510
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者王成明, 徐步, 王志強, 許傳靈, 危藍菁, 張繼壘 申請人:揚州大學