專利名稱：一株能提高木麻黃葉綠素含量的內生真菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株能提高木麻黃葉綠素含量的內生真菌。
背景技術：
植物內生菌的研究始于19世紀末,Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分離出第一株內生菌[1]。但真正開始大量研究植株中的內生菌起始于上世紀八十年代，主要是在溫帶地區、亞熱帶地區和熱帶地區的植被中開展研究。前人從大部分植物中都能分離出內生菌，因此可以推測內生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范圍內至少在80多個屬290多種的禾本科農作物中發現了內生菌[2]。目前從植物中分離的內生菌根據其具有的獨特功能可以分為:固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌[3_4]、具有抗病蟲害的生防菌[5_8]和具有促進植物對不良環境的修復能力的抗性菌。在促進光合作用方面的內生菌報道極少，僅有在水稻上發現一種具有光合作用能力的內生菌，它也被證明是豆莢Aeschynomene[9]莖瘤中固氮菌Bredyrhizobium的一個株系。木麻黃科植物是兼有Frankia菌、內生菌根菌和外生菌根菌的共生營養型植物，因此，關于木麻黃真菌學方面的研究方向目前較多涉及弗蘭克氏菌、叢枝狀菌根(簡稱AM菌根)、青枯菌、青枯假單胞桿菌等，雖然木麻黃人工接種菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是僅停滯于根瘤菌根菌的研究，木麻黃內生真菌方面的研究尚未見報道[1°-11]。前人的研究中應用菌株，多為外生真菌，同時也沒有從提高植株葉綠素含量的因素去尋找內生真菌，提高其科學性和可靠性[12]。證實能提高植株葉綠素的內生菌方面尚未見報道。
發明內容
本發明的目 的在于提供一株能提高木麻黃葉綠素含量的內生真菌。本發明提供的一株能提高木麻黃葉綠素含量的內生真菌，所述功能內生真菌為鐮孢(Fusarium sp.)木麻黃根際真菌46,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6310。該菌的分離、純化包括:
A、材料:將采集得到不同年份的根、枝條、鱗狀葉小枝分成三個部分，用自來水清洗干凈，分裝到自封袋內，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——無菌水浸洗一次——10%次氯酸鈉浸泡7min——無菌水浸洗一次。當樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對照，以檢驗樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續調整消毒方法[13_15]；
C、接種部位的選擇:鱗狀葉小枝:分取植株的上、中、下三個部分的鱗狀葉小枝，每個鱗狀葉小枝又分為枝尖部、枝中部和枝基部3個處理；枝條:上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處；根部:分為根尖和根基2個部分；
D、接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養基表面，于28°C恒溫培養箱內培養5— 7天后觀察菌落生長狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產生的菌株進行分離純化；生長緩慢且數量較少的菌株可延長觀察時間，直到其生長穩定后純化。固體培養:使用改良馬丁固體培養基，配方為蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，pH值
6.4±0.2，培養溫度為28°C，培養方式為平板培養，培養時間為48h ；
E、將分離繁殖出的不同種類的內生真菌接入平板培養基進行純化，經過2-3次點接純化、轉接后得到單一菌種的上述的Fusarium sp.功能菌株；
其在平面培養基上，菌落為黑色，整個菌落隆起且褶皺，外緣形狀不規則；背部為黑色。分生孢子梗細長，分枝不規則，在孢子座上單生；分生孢子(梗孢子)無色；分生孢子單胞，長圓形，單個著生；參照真菌鑒定手冊將其鑒定為鐮孢菌屬(Fusarium sp.),保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6310。上述的一種能提高木麻黃葉綠素含量的內生真菌應用菌液的制備方法，是將上述的菌株接入液體培養基，搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48 72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml即為成品備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0.2。上述的一種能提高木麻黃葉綠素含量的內生真菌應用菌液的應用方法，是應用該菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地澆根。上述的一種能提高木麻黃葉綠素含量的內生真菌應用菌液的應用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株IOOml在林地澆于每株木麻黃的根際。上述的一種能提高木麻黃葉綠素含量的內生真菌應用菌液的應用方法，是應用該菌株的菌液5.0X 105Cfu/ml在水培苗栽植前將苗蘸根lOmin。本發明涉及的菌株是從木麻黃植株中分離純化得到的，目標菌株為鐮孢(Fusarium sp.)木麻黃根際真菌46,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為 CGMCC N0.6310。將木麻黃根際真菌46接種于木麻黃水培苗，根據葉綠素的各項指標綜合評判，進一步證實其對提高木麻黃葉綠素含量具有促進作用以及實際對木麻黃的葉綠素的增效作用，尋找到提高木麻黃葉綠素含量有益的功能內生真菌可應用于生產。菌株46處理下，苗木葉綠素相對含量(SPAD值)為對照的1.31倍。表明其對于提高植株的葉綠素含量具有極顯著效果。
具體實施方式
`1、根際土壤澆施應用
試驗材料為惠安一號水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建農林大學森林生態研究所田間試驗地。水培苗根系長齊后，將其移入黃心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分裝于約500個直徑22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等質量的3.36KG混合土壤，為了保證后期苗木接菌的準確性，往每盆土壤中滴入1(Γ15滴甲醛(福爾馬林)消毒液，并用塑料薄膜封蓋盆口，消毒時間為24h。待土壤內甲醛滲透消毒完全，除去塑料薄膜，將剩余的甲醛蒸發，以免影響幼苗的移植成活率。經過一個月的恢復性生長，在木麻黃根際施入菌株濃度為
9.0X 105cfu/ml的菌液100ml，重復3次，用蒸餾水溶液處理作為空白對照。2、水培繁殖中的應用(水培接菌)
取配制好的內生真菌應用菌液，制成5.0X105cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根lOmin，可提高植苗成活率10%以上。對照為空白處理。菌液的制備:將木麻黃根際真菌46 (菌株46)接入液體培養基，培養基為改良馬丁培養基，每L含蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀1.0g、硫酸鎂
0.5g，其它為無菌水，pH值6.4±0.2。經過24h的培養，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0X 106cfu/ml至9.0X 106cfu/ml備用。接種后30天后進行葉綠素指標的測定，檢測方法和結果如下:
2.1菌株澆施后木麻葉綠素指標分析
應用便攜式葉綠素含量測定儀(SPAD-502，Minolta，Tokyo，Japan)，測定葉中部的SPAD計數值代表葉綠素的相對含量。每個處理測定10株，每株選取整個植株中間部位，同一朝向(東南方向)的枝條，采取5根枝條并排壓平的方式測量取平均值[16]。所有數據處理以及圖表制作均采用Excel和SPSS軟件處理。3測定結果:方差分析及多重比較
葉綠素相對含量的方差分析表明，S (水培浸泡)接菌方式下，菌株46處理與對照處理之間的苗木葉綠素相對含量存在顯著差異。與對照CK木麻黃苗木相比，菌株46號處理苗木的葉綠素相對含量有顯著提高，增加了 31.34%。表I水培接菌方式菌株處理下葉綠素相對含量的多重比較分析
權利要求
1.一株能提高木麻黃葉綠素含量的內生真菌，其特征在于:所述內生真菌為鐮孢(.Fusarium sp.)木麻黃根際真菌46,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6310。
2.一種如權利要求1所述的內生真菌的應用菌液，其特征在于:所述應用菌液的制備方法，是將所述的鐮孢(Fusarium sp.)木麻黃根際真菌46接入液體培養基,搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48 72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml，備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值 6.4±0.2。
3.—種如權利要求2所述的應用菌液的用途，其特征在于:所述應用菌液用于林地澆根或苗木栽植前期蘸 根。
全文摘要
本發明涉及一株能提高木麻黃葉綠素含量的內生真菌。所述內生真菌為鐮孢(Fusariumsp.)木麻黃根際真菌46，已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No.6310。將木麻黃根際真菌46接種于木麻黃水培苗，根據葉綠素的各項指標綜合評判，進一步證實其對提高木麻黃葉綠素含量具有促進作用以及實際對木麻黃的葉綠素的增效作用，尋找到提高木麻黃葉綠素含量有益的功能內生真菌可應用于生產。
文檔編號C12N1/14GK103173360SQ201310068759
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者吳承禎, 洪偉, 謝安強, 林燕青, 范海蘭 申請人:福建農林大學