專利名稱：一種谷氨酸棒桿菌基因及其突變基因的原核表達方法
技術領域：
本發明涉及一種高新生物技術，尤其涉及一種谷氨酸棒桿菌基因及其突變基因的原核表達方法。
背景技術：
在細菌和植物中，由公共途徑莽草酸途徑以及三個專一性途徑分別合成色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸三種芳香族氨基酸，公共途徑第一步反應，被認為是芳香族氨基酸合成的限速步驟，由DAHP合成酶催化。目前，對谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)DAHPSCgTyr的立體結構還未見報道，但大腸桿菌Escherichia col1、海棲熱袍菌Thermotoga maritima、啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae的(β /a )8立體桶狀結構均以報道，這些來源不同的DAHPS高度同源，功能相同，只是受不同底物的反饋抑制，但底物抑制的結合位點基本相同，表明它們可能是由同一個桶狀結構的祖先進化而來，或者是由不定的結構收斂進化到同一種穩定的三維結構的結果，或者是二者兼有的結果。1991年的大腸桿菌中進化高度保守的苯丙氨酸反饋抑制的DAHPS的(DAHPSEcPhe)金屬離子結合位點Cys61、Glu302、Asp326、Lys97中的Cys61進行突變研究，結果該氨基酸的突變導致酶活性喪失，推測谷氨酸棒桿菌酪氨酸反饋抑制的DAHPSCgTyr活性同樣對金屬離子也有依賴性，保守N末端Cys69的突變，可能也會導致酶活性喪失。1999,2002年，研究人員根據AroG-PEP-(Pb2+、Mn2+)共結晶的晶體結構指出了 Glu24、Lys25、Argl24、His217對DAHPSEcPhe的四連體結構起到重要的作用，從DAHPSCgTyr氨基酸序列分析發現這幾個氨基酸進化過程中并不保守，預示DAHPSCgTyr不是四連體結構，可能是以緊密的二聚體結構存在。研究人員確定了 DAHPSEcPhe的活性中心位于(β/α)8桶的C末端，由于PEP和Ε4Ρ都是帶有負電的反應底物，所以在活性中心附近帶正電荷的氨基酸比負電荷的多，在距離Pb2+8A范圍內多為Arg和Lys，而DAHPSCgTyr中這些帶電的氨基酸都是高度保守的，說明D AHPSCgTyr的活性中心位置與DAHPSEcPhe基本相同，但對這些帶正電的Arg和Lys的突變研究鮮見報道。研究人員還認為DAHPSEcPhe反饋抑制子苯丙氨酸的苯環結合在氨基酸Phel44、Prol50、Leul75和Leul79的側鏈形成疏水“pocket”的底部，苯丙氨酸結合這些氨基酸以后，引起一些氨基酸殘基間的新接觸的形成以及原有接觸的破壞，引起酶催化活性的降低，而在DAHPSCgTyr氨基酸序列中沒有保守的Leul79 (E.Coli)，而對應為Met，其余幾個氨基酸均保守，固推測是該位氨基酸在進化過程中的改變，導致反饋抑制子的不同。我國研究人員確定大腸桿菌DAHPSEcPhe Leul75的所有突變體的比活都比野生型高，并部分或完全解除反饋抑制。本研究對與大腸桿菌AroG基因Leul75相對應的谷氨酸棒桿菌aro I基因Leul83進行突變，所得突變體L183Q比活同樣比野生型高，分析原因可能是該氨基酸殘基的突變使得反饋抑制子酪氨酸不易結合，或是底物PEP更容易結合到活性位點，或是另一個底物E4P更容易與已結合在活性位點的PEP發生反應，但具體原因還有待于深入研究。
發明內容
本發明要解決的技術問題在于提供了一種谷氨酸棒桿菌AroI基因及突變基因AroI*的原核表達方法。為解決上述技術問題，本發明通過以下方案來實現:谷氨酸棒桿菌基因及其突變基因的原核表達方法，所述方法所使用的材料為菌株大腸桿菌BL21及pET-28a(+)原核表達載體，由以下步驟實現:I)、DAHP合成酶基因及突變基因的原核表達載體構建；2)、目的基因與表達載體pET_28a(+)的酶切，限制性內切酶Nde I和XhoI雙酶切重組質粒pMD18T-simple_Aro ]^PpMD18T-simple-Aro I*,回收目的基因片段，分別按照下表中體系進行加樣，對目的基因和pET-28a(+)載體于37°C恒溫4h進行雙酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結果，回收目的基因和載體的目的片段；
權利要求
1.谷氨酸棒桿菌基因及其突變基因的原核表達方法，其特征在于:所述方法所使用的材料為菌株大腸桿菌BL21及pET-28a(+)原核表達載體，由以下步驟實現: 1)、DAHP合成酶基因及突變基因的原核表達載體構建； 2)、目的基因與表達載體pET-28a(+)的酶切，限制性內切酶NdeI和Xho I雙酶切重組質粒pMD18T-simple_Aro I和pMD18T_simpIe-Aro I*,回收目的基因片段,分別按照下表中體系進行加樣，對目的基因和pET-28a(+)載體于37°C恒溫4h進行雙酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結果，回收目的基因和載體的目的片段；
全文摘要
本發明公開了一種高新生物技術，尤其涉及一種谷氨酸棒桿菌基因及其突變基因的原核表達方法，pET系統是有史以來在E.coli中克隆表達重組蛋白的功能最強大的系統。目的基因被克隆到pET質粒載體上，受噬菌體T7強轉錄及翻譯(可選擇)信號控制；表達由宿主細胞提供的T7RNA聚合酶誘導。T7RNA聚合酶機制十分有效并具選擇性充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時，目的蛋白通常可以占到細胞總蛋白的50％以上。盡管該系統極為強大，卻仍能很容易地通過降低誘導物的濃度來削弱蛋白表達。降低表達水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分產量。
文檔編號C12N15/70GK103215287SQ20131007459
公開日2013年7月24日 申請日期2013年2月28日 優先權日2013年2月28日
發明者佟毅, 劉俊梅, 王宏齡, 胡耀輝, 李琢偉, 王丹, 王玉華, 樸春紅, 代偉長, 于寒松 申請人:吉林中糧生化科技有限公司