一株γ-聚谷氨酸產生菌及其發酵產物的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株γ-聚谷氨酸產生菌，屬于微生物和發酵【技術領域】，所述γ-聚谷氨酸產生菌為地衣芽孢桿菌（Bacillus?licheniformis），保藏號為CGMCC?NO.9169。γ-聚谷氨酸產生菌Dou-6，菌株發酵液直接用做土壤保水劑，且表現較好的保水效果，通過直接稀釋菌株Bacillus?licheniformis?Dou-6的發酵液對土壤的保水效果，表明2倍和5倍稀釋液均顯著起到保水效果，二者達到差異顯著水平,在播種、拌種、移苗時經過γ-PGA保水劑拌種、蘸根處理，就能大大提升其成活率，有廣闊的應用前景。
【專利說明】一株Y-聚谷氨酸產生菌及其發酵產物的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物和發酵【技術領域】，具體涉及一種Y-聚谷氨酸產生菌及其發酵產物在土壤保水中的應用。
【背景技術】
[0002]農業生產中常存在土壤因保水性差而引起作物缺水，造成減產甚至絕收，因此農業保水對農業生產尤其重要。目前有一些聚丙烯酸系列吸水樹脂材料應用于農業保水，但存在成本高、降解慢、對環境不友好等問題。因此具有無殘留、不污染環境、綠色環保性能的新型保水劑成為當前研究的熱點。由于Y-聚谷氨酸具有水溶性好、保濕性佳、可生物降解等特性，因此在農業上極具應用潛力。
[0003]Y-聚谷氨酸(Y-polyglutamic acid,簡稱Y-PGA)是一種可由多種微生物發酵產生的氨基酸聚合物。目前研究較多的￥-?64產生菌有及^277心5^07/>5正03335、Bacillus Subtilis TAM-4^BaciIlus Licheniformis WBL-3 及Bacillus SP.B53 等。在發酵產物保水性方面有研究表明Y -PGA的最大自然吸水倍數可達到1108.4倍，高于聚丙烯酸鹽類吸水樹脂I倍以上，張新民等制備Y -PGA高吸水樹脂最高吸水率可達1600 g/g。前人研究多側重于Y-PGA產生菌的選育鑒定、培養條件或發酵產物的鑒定及其保水性中的單一方面，而圍繞一株Y -PGA產生菌的選育鑒定并開展培養條件及其發酵產物在土壤保水性等方面的綜合性研究報道甚少。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一株Y-PGA產生菌及其發酵產物在土壤保水中的應用，具有較好的保水效果。
[0005]為實現上述目的，本發明采用以下技術方案:一種Y -聚谷氨酸產生菌Dou-6，分類命名:地衣芽孢桿菌，拉丁文學名-.Bacillus licheniformis，樣蘇H:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱:CGMCC，保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期:2014年05月16日，保藏號為CGMCC N0.9169。
[0006]所述的Y-聚谷氨酸產生菌的發酵產物在土壤保水中的應用。
[0007]本發明的有益效果:本發明的Y-聚谷氨酸產生菌的出發菌株licheniformis Dou-6所用發酵底物中谷氨酸鈉添加量僅為30g/L,在沒有進一步發酵培養基及發酵條件優化的條件下，底物中谷氨酸轉化率達到60%以上，本發明獲得的Y-PGA合成菌株合成效率較高，且該菌株的產量隨著傳代產量遞增加了 98.7%，還有進一步增加的可能，有研究通過射線誘變合成菌株后經一定程度的培養基優化，其產能提升了 70%以上，因此通過菌株改造或發酵條件優化預期將獲得更高的產量；菌株發酵液直接用做土壤保水劑，且表現較好的保水效果，通過直接稀釋菌株licheniformis Dou~6的發酵液對土壤的保水效果，表明2倍和5倍稀釋液均顯著起到保水效果，二者達到差異顯著水平，在播種、拌種、移苗時經過Y-PGA保水劑拌種、蘸根處理，就能大大提升其成活率，有廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1為菌株D3、D4和D6發酵水解物10倍稀釋液紙層析(2、4、6、8、10、20分別指
2、4、6、8、10、20mg/L 谷氨酸標準品)。
[0009]圖2為標準谷氨酸色譜圖。
[0010]圖3為Dou-6發酵產物液相色譜圖。 [0011]圖4為Dou-6菌株形態圖。
[0012]圖5為Dou-6菌株染色鏡檢圖。
[0013]圖6為不同培養基中菌株Dou-6的生長曲線。
[0014]圖7為傳代培養對Dou-6菌株聚谷氨酸合成產量的影響。
[0015]圖8為Dou-6菌株基于16S rDNA序列的系統發育樹。
[0016]圖9為Dou-6菌株的發酵產物不同處理的土壤保水效果。
【具體實施方式】
[0017]一種Y -聚谷氨酸產生菌Dou-6，分類命名:地衣芽孢桿菌，拉丁文學名'Bacillus
保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏單位簡稱:CGMCC，保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期:2014年05月16日，保藏號為CGMCC N0.9169。
[0018]Y-聚谷氨酸產生菌的選育方法，步驟如下:
(1)將2g取自河南省通許縣玉皇廟鄉申店村的豆醬樣品研碎懸浮在無菌蒸餾水中震蕩均勻，煮沸15 min，冷卻后梯度稀釋，并涂布于篩選培養基中，37°C下培養24 h，得到菌落，篩選培養基為LB固體培養基(貧/L)的組成為:葡萄糖10，蛋白胨10，NaCl 5.0，瓊脂20，pH=7.0 ；
(2)挑選形態各異、生長旺盛、表面光滑且粘稠的菌落8株，相同的培養條件下，將這幾株菌進行反復劃線培養三次以上，以獲得純菌株；
(3)將純化后的菌株接種到含50ml液體發酵培養基的250ml三角瓶中，在恒溫搖床上培養60 h，恒溫搖床的溫度為37°C，轉速200 r/min，發酵培養基(g/L)的組成為:檸檬酸12，甘油 80，NH4Cl 7.0，谷氨酸鈉 30，K2HPO4o 3H20 0.5，FeCl3.6H20 0.05，CaCl2.2H20 0.15，MgSO4.7H20 0.5，MnSO4.H2O 0.1，pH=7.0 ；
(4)選擇粘稠度較高的第2、第6和第7號菌的發酵液于8000r/min離心10 min,上清液用4倍乙醇沉淀過夜,再于8000 r/min離心10 min將沉淀物溶于去離子水中，并透析過夜，將透析液凍干稱重，得到Y -PGA的含量，量取純化好的Y -PGA溶液10 mL,放入水解管，加入10mL6mol/L的HC1，抽真空封口，120°C水解24 h，獲得Y-PGA水解產物；
(5)用谷氨酸標準品做對照，通過紙層析法檢測水解產物中的氨基酸遷移特征，根據各菌株發酵液粘稠度及紙層析結果如圖1所示，從圖譜上可以看出谷氨酸標準品2、4、8、10、20mg/L與其它三種菌株發酵產物的稀釋液基本上處于同一位置，且均只有一個斑點，初步認為3株菌株發酵水解產物是谷氨酸，其中，以菌株Dou-6斑點最亮，結合其發酵液粘稠度，初步判斷其Y-PGA合成能力最強，選擇第6號菌作為出發菌株，命名為Dou-6。將Dou-6發酵水解進行液相色譜分析測定，從圖2和圖3得知，發酵產物的峰和谷氨酸標準品的峰圖保留時間一致，判定其產物為聚谷氨酸。
[0019]1.菌株Dou-6的形態學特征
挑取Dou-6菌株于篩選培養基劃線培養,培養24h后觀察菌落形態并照相。另外挑取該菌菌于滅菌去離子水中，震蕩后吸取菌液于載玻片上，進行革蘭氏染色，用顯微鏡(NikonEclipse 80i,日本)觀察并拍照。結果:固體培養基上該菌生長旺盛，菌落黏稠，用接種環挑取能拉出細絲，菌落表面光滑且蔓延，為乳白色或半透明狀。大多數菌落粗糙有皺褶，邊緣不規則(圖4)。菌株革蘭氏染色呈陽性，在電鏡下可以看到該菌株呈桿狀分布(圖5)。
[0020]2.菌株Dou-6的生理生化特征
(I)好氧性試驗
把滅過菌的LB培養基倒入3個已滅菌的試管中，大約在2/3處，在無菌操作臺上，用接種針挑取斜面培養的所述菌，穿刺接種到上述培養基中(必須穿刺到管底)。30°C培養，分別在3天至7天觀察結果。在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌，如沿穿刺線生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。
[0021]試驗結果表現，菌落沿瓊脂柱表面生長，穿刺線內也有菌落生長，為兼性厭氧。
[0022](2)過氧化氫酶的測定 在干凈載玻片上滴I滴3%H202，取18~24 h的LB斜面培養物I環，在H2O2中涂抹，若有氣泡產生則為陽性，否則為陰性。試驗結果為接觸酶陽性。
[0023](3)甲基紅試驗(M.R試驗)
a.培養基及試劑:蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化鈉5g，蒸餾水lOOOmL，調節ρΗ7.0-7.2，分裝試管，每管裝4~5 mL，12rC滅菌20 min。試劑:甲基紅0.lg，95%酒精300 mL，蒸餾水200mL ο
[0024]b.菌種培養及結果觀察接種菌株于上述培養液中，30°C培養廣2天。在培養液中加入幾滴甲基紅試劑，如培養液呈現紅色，為甲基紅陽性，黃色為陰性(甲基紅變色范圍4.4紅色~6.0黃色)。
[0025]試驗結果為M.R陽性。
[0026](4)乙酞甲基甲醇試驗(VP試驗)
a.培養基培養基同甲基紅試驗。b.菌種培養及結果觀察接種與培養同甲基紅試驗。做VP試驗時，取培養液(約2mL)和等量的40 %NaOH相混合，加少量肌酸，充分振蕩2飛min后，如培養液出現紅色，即為VP陽性。
[0027]試驗結果為VP陰性。
[0028](5)淀粉水解試驗
a.培養基及試劑在肉湯蛋白胨瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝三角瓶，121°C滅菌20min備用。路哥氏碘液:碘片lg，碘化鉀2g，先用少量(3飛mL)蒸餾水溶解碘化鉀，現加入鵬片，待鵬完全溶解后，加水稀釋至300mL。
[0029]b.菌種培養及結果觀察取菌種點接于平板上，30°C培養2~4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以鋪滿菌落周圍為度，平板呈藍色，而菌落周圍如有無色透明圈出現，說明淀粉已被水解。透明圈的大小一般說明水解淀粉能力的大小。
[0030]試驗結果為淀粉水解陽性。[0031](6)明膠水解試驗
a.培養基及試劑蛋白胨5g，明膠120g，蒸餾水lOOOmL。調節pH7.2^7.4，分裝試管，培養基高度約為4~5cm，121°C滅菌20min。
[0032]b.菌種培養及結果觀察用穿刺法接種在試管中央。在30°C溫箱中培養一個月，觀察明膠是否液化。
[0033]試驗結果為明膠水解陽性。
[0034](7)硝酸鹽還原試驗
a.培養基及試劑蛋白胨10g，KNO3Ig,蒸餾水1000mL，pH7.0~7.4。格里斯氏(Gries)試劑:A液:對氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10%左右)150mL ；B液:蔡胺0.1g,蒸餾水20mL，稀醋酸(10%左右)150mL。二苯胺試劑:二苯胺0.5g溶于IOOmL濃硫酸中，用20mL蒸餾水稀釋。
[0035]b.菌種培養及結果觀察將試驗菌接種于硝酸鹽液體培養基中，30°C培養1、3、5天。在白色瓷盤小孔中倒入少許培養液，然后在其中分別滴I滴試劑A和B液，當培養液變為粉紅色、玫瑰紅色、橙色或棕色等時，表示有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性，否則為陰性。
[0036]試驗結果為硝酸鹽還原陽性。
[0037](8)檸檬酸鹽的利用
a.培養基及試劑檸檬酸鈉 2g，NaCl 5g，MgSO4.7H20 0.2g，(NH4)2.HPO4 lg, 1% 澳百里香酚藍水溶液10mL，瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH6.8-7.0,121°C滅菌20min。
[0038]b.菌種培養及結果觀察取幼齡菌種接種于斜面上，30°C培養3-7天，培養基呈堿性(藍色)者為陽性反應，不變者則為陰性。
[0039]檸檬酸鹽利用的試驗結果為陽性。
[0040]3.菌株Dou-6生長曲線的測定
分別在250 mL三角瓶中配制50 mL的3種液體種子培養基，種子培養基I為:葡萄糖54g，硫酸銨9 g，三水磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.25 g，pH值7.5。種子培養基2為液體LB培養基，種子培養基3為牛肉膏蛋白胨培養基。121°C滅菌20 min，冷卻后分別挑取兩環的菌株接種至液態培養基中，于37°C，200 r.mirT1，振蕩培養24 h，每隔2 h取樣檢測菌體在OD600nm下的吸光值，記錄菌體在不同培養基下的生長曲線。菌株Dou-6在不同培養基中的生長曲線見圖6，由生長曲線我們可以看出，在3種種子培養基中該菌株都是在14-16 h左右首次A9660值達到最大且趨于穩定，表明此時菌體進入穩定期，菌體數量最多。培養基2增長速度最快，最適宜作為發酵種子液，培養時間為15h左右。
[0041]4.連續培養馴化對發酵產物量的影響
500ml三角瓶中配制100mL發酵培養基，接種量為5%，搖瓶發酵，37°C，200 r.min—1發酵60h后，獲得第I代發酵液，同時挑取取一定量的發酵液劃線，挑取單菌落轉接到種子培養基中，細胞增殖后，同樣按照5%的接種量轉接到500ml含100mL發酵培養基的培養瓶中，搖瓶培養，作為第2代發酵液，循環往復，重復10次發酵，測定每代發酵產物中Y -PGA產量。Y -PGA采用GoTo等方法進行目標產物的純化和分離，得到的樣品用于后續的酸水解及液相色譜(waters 515，美國)測定。利用HPLC對發酵產物的水解液進行液相色譜分析，通過參照谷氨酸標準品圖譜對照同時根據峰面積可計算出產量。該菌株10代內的搖瓶發酵產量見圖7，隨著連續傳代培養馴化，該菌株合成Y-PGA的能力有了很大幅度的提升，產量從最初9.13貧/L增加到18.15辦1，增幅達98.80%，底物中谷氨酸鈉的轉化率由30.4%提高到60.5%。且后期產量穩定，保證了后續研究的可靠性。
[0042]5.細菌16S rDNA序列鑒定
將Dou-6號菌株接種到LB液體培養基，搖床培養15h后，取I ml菌液于8000 rpm離心10min后，棄上清，沉淀用CTAB法提取DNA。使用細菌的16S rDNA的引物27F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3，)和 1492R (5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)進行 16S rDNA序列全長擴增。擴增體系:50 ul，包括 TaKaRa Tap (5ug/ul) 0.25 ul, 10XPCR Buffer (Mg2+Free) 5 ul, MgCl2 (25mM) 3ul, dNTP Mixture (各 2.5mM) 4ul，模版 DNA 兩份各 Iul，引物I (IOuM) 2ul，引物 2 (IOuM) 2 ul，滅菌去離子水 31.75 ul。PCR 程序:95°C 10 min ；93°C
Imin, 50°C I min,72°C I min 50s，24個循環；最后72°C 5 min。擴增產物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成回收測序。在NCBI數據庫中BLAST搜索其同源性較高的序列作為參考序列，使用MEGA 5.05軟件中的鄰接法構建系統進化樹。根據NCBI中提供的16SrRNA基因序列，構建進化樹進行分析(圖8)，其中菌株Dou-6相似度最高的菌株是相似率達 98%。 [0043]6.Dou-6菌株發酵液在土壤保水方面的應用
于河南農業大學校園苗圃內取0-20cm 土壤樣品，混合均勻后于陰涼處自然風干，過2mm篩后備用。Dou-6菌株發酵60h后，8000r/min離心10min除去菌體,粘稠上清用去離子水進行2倍和5倍稀釋，另外用相同稀釋倍數的滅菌發酵培養基作為對照CK2和CK5，去離子水作為空白對照CK0，共5個處理。分別稱400g風干過篩的土樣，放置于直徑16cm的塑料盆中，用上述5種液體調節土壤含水量為最大持水量的75%，25°C恒溫培養。取樣時間分別為:1 d，4 d，7 d，lld，15 d，破壞性取樣，每個處理重復15次。取樣時烘干稱重，求出不同處理的含水量。(其中添加2、5倍稀釋液盆中Y-PGA含量分別為0.270貧、0.10處)。發酵產物稀釋后的土壤保水效果見圖9。在I d時，2倍、5倍稀釋液、CK2、CK5及CKO的含水量基本都維持在18%左右，它們之間無顯著差異；在4 d時2倍、5倍發酵液處理土壤含水量分別為9.1%和7.7%，二者達到差異顯著水平(P < 0.05);而相應的2倍和5倍培養基稀釋液的含水量均為6.8%，去離子水處理含水量最低為6.7%，發酵液保水效果顯著高于培養基和去離子水(P < 0.05) ；7 d時各處理含水量都逐漸下降，此時2倍和5倍稀釋發酵液處理含水量為4.7%和3.4%，仍顯著高于對照培養基和去離子水處理的含水量；第10 d，2倍和5倍稀釋液間的土壤含水量仍最高，二者差差異不顯著(P > 0.05)，但發酵液處理含水量一直高于培養基和去離子水處理，且含水量差異達到顯著(P < 0.05)，第15 d時2倍稀釋發酵液含水量高于對照3.5倍維持在3.09%左右。
[0044]本發明以菌株發酵液直接用做土壤保水劑，且表現較好的保水效果。通過直接稀釋菌株licheniformis Dou~6的發酵液對土壤的保水效果,表明2倍和5倍稀釋液均顯著起到保水效果，二者達到差異顯著水平。本研究只初步探討了發酵液的保水性能，植物安全的前提下適宜有效的發酵液添加量，及其適宜的田間施用量仍需要深入研究。關于Y-PGA在土壤上的保水機理，本研究通過觀察發現，土壤培養15 d后掀開土層，2個發酵液處理土壤接觸緊密，有蜂窩狀的小空隙，而培養基、自然土處理土壤較松散，這可能是發酵產物Y-PGA在土層中形成了具有保濕性和粘結性的結構體，在涵養水分的同時能吸附在一起而減小土壤中的孔隙度，阻止了水分蒸發，從而起到了保水劑的作用效果。在農業生產中會時常發生種子和幼苗缺水死亡的現象，因此如果將富含Y-PGA的發酵液開發用作農業保水劑，在播種、拌種、移苗時經過Y-PGA保水劑拌種、蘸根處理，就能大大提升其成活率，預計有廣闊的應 用前景。
【權利要求】
1.一株Y-聚谷氨酸產生菌，其特征在于:所述Y-聚谷氨酸產生菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，保藏號為 CGMCC N0.9169。
2.如權利要求1所述的一株Y-聚谷氨酸產生菌的發酵產物在土壤保水中的應用。
【文檔編號】C09K101/00GK104017760SQ201410254043
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】李培培, 韓燕來, 汪強, 譚金芳, 姜瑛, 張萬旭 申請人:河南農業大學