專利名稱：人椎間盤髓核細胞和免疫細胞相互作用的體外模型構建方法
技術領域：
本發明屬于基礎醫學的細胞共培養，具體涉及一種人椎間盤髓核細胞和免疫細胞相互作用的體外模型構建方法。
背景技術：
髓核細胞是人椎間盤組織中的主要細胞，對維持椎間盤正常形態具有重要的作用，相關研究發現退變的椎間盤中髓核細胞大量凋亡[Jones P, Gardner L, MenageJ, Williams GT, Roberts S:1ntervertebral disc cells as competent phagocytesin vitro:1mplications for cell death in disc degeneration.Arthritis research&therapy2008, 10(4):R86.] ； [Tschoeke SK, Hellmuth M, Hostmann A, RobinsonY,Ertel ff, Oberholzer A, Heyde CE:Apoptosis of human intervertebral discs aftertrauma compares to degenerated discs involving both receptor-mediated andmitochondrial-dependent pathways.Journal of orthopaedic research:officialpublication of the Orthopaedic Research Society2008, 26 (7): 999-1006.],椎間盤作為機體內最大的免疫赦免器官[Buckwalter JA MV, Boden SD, Eyre DR, WeidenbaumM: Rosemont:American Academy of Orthopaedic Surgeons, 2nd ed edn; 2000.],其凋亡與免疫細胞的影響密切相關。但目前尚無免疫細胞與椎間盤髓核細胞的共培養研究模型。
發明內容
本發明的目的在于提供一種人椎間盤髓核細胞和免疫細胞相互作用的體外模型構建方法即通過建立模型研究人椎間盤免疫赦免的作用機制。為達到上述目的，本發明采用的技術方案是:I)人髓核細胞分離及培養首先將髓核組織在無菌條件下分離，棄去其中的纖維環組織節軟骨板，將剩余的髓核組織在室溫下置于胰蛋白酶溶液中消化，隨后離心棄去上清液，在室溫下用II型膠原酶靜止消化后，再離心，棄去上清液，細胞用PBS液沖洗離心后以45 μ m孔徑的尼龍過濾網濾去剩余組織，計數板進行細胞計數；再以胎牛血清的DMEM/F12培養液將細胞接種于培養瓶內，置于37°C含CO2的培養箱中進行培養，每三天換液一次；2)人外周血巨噬細胞的分離及培養2.1)外周血單核細胞(PBMCs)分離利用肝素抗凝管抽取外周血，以1:3的體積比將抽取的外周血加入RPM1-1640培養基并混勻，隨后再以1:1的體積比緩慢加至細胞分離液Ficoll-Paque中，室溫下以SOOXg離心30分鐘，隨后吸取白膜層即為外周血單核細胞；2.2)巨噬細胞分離及培養
將外周血單核細胞接種于含胎牛血清的RPM1-1640培養液的培養瓶中，置于37°C含C02的培養箱中進行培養，24h后，棄去培養瓶中上清液，即去除非粘附細胞，向剩余的粘附細胞中加入18ng/mL濃度的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/mL濃度的巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，培養5天后，得到的粘附細胞即為外周血巨噬細胞；3)人外周血⑶8+T細胞分離及培養利用⑶8+T-cell Positive Isolation Kit試劑盒,根據說明，對外周血淋巴細胞逐步分離，得到外周血中的⑶8+T細胞；4)人髓核細胞和免疫細胞相互作用的體外模型采用半透膜孔徑為0.4μ m的Transwell inserts插入式小室建立非接觸共培養模型，將第I步得到的髓核細胞與免疫細胞(即巨噬細胞或CD8+T細胞)按1:1的體積比共
培養；具體操作為:以1.5X106/孔的數目將髓核細胞接種于六孔板，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養液作為培養基；將1.5X IO6的巨噬細胞或⑶8+T細胞接種于Transwellinserts小室，并插入六孔板中，共養48小時后，根據實驗目的對髓核細胞、巨噬細胞或CD8+T細胞進行相關檢測。所述步驟I)將剩余的髓核組織先剪成I X Imm3碎塊，在室溫下置于質量濃度為0.25%的胰蛋白酶消化40min,隨后以1000r/min離心5min,棄去上清液,于室溫下用質量濃度為0.025%的II型膠原酶靜止消化4h，再以1000r/min離心5min，棄去上清液，細胞再用PBS液沖洗3次，以1000r/min離心5min后以45 μ m孔徑的尼龍過濾網濾去剩余組織，計數板進行細胞計數； 再以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養液將細胞接種于培養瓶內，置于37°C含5%C02的培養箱中進行培養，每三天換液一次。將外周血單核細胞接種于含10%胎牛血清的RPM1-1640培養液接種于培養瓶中，置于37°C含5%C02的培養箱中進行培養，24h后。本發明共培養模型較好模擬了體外人髓核細胞和免疫細胞相互作用，可為體外椎間盤免疫研究提供一種新的實驗思路。發明人已在研究=FasL在椎間盤免疫赦免中的作用機制研究中，采用該共培養模型。此研究通過上調椎間盤退變患者髓核細胞中的FasL表達量，并與免疫細胞共培養后發現，FasL在髓核細胞中的上調可有效增加免疫細胞的凋亡比例。
具體實施例方式I)人髓核細胞分離及培養將收集的髓核組織在無菌條件下仔細分離，棄去纖維環組織節軟骨板，將剩余的髓核組織剪成I X Imm3碎塊，于室溫下以濃度為0.25%的胰蛋白酶消化40min，隨后低速離心(1000r/min) 5min,棄去上清液,于室溫下用0.025%的II型膠原酶靜止消化4h,低速離心(1000r/min) 5min后棄去上清液,細胞再用PBS液沖洗3次,低速離心5min,以45 μ m孔徑的尼龍過濾網濾去剩余組織，計數板進行細胞計數。以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養液將細胞接種于培養瓶內，置于37°C含5%C02的培養箱中進行培養。每三天換液一次，密切觀察細胞生長狀態。培養狀態下的髓核細胞。
2)人外周血巨噬細胞分離及培養2.1)外周血單核細胞(PBMCs)分離外周血單核細胞分離采用密度梯度離心法，利用肝素抗凝管抽取志愿者外周血15mL,以1:3比例加入RPM1-1640培養基并混勻，隨后再以1:1比例緩慢加至細胞分離液(FicolΙ-Paque)上。室溫下以800Xg離心30分鐘。隨后吸取白膜層即為外周血單核細胞。2.2)巨噬細胞分離及培養將上一步收集的外周血單核細胞以含10%胎牛血清的RPM1-1640培養液接種于培養瓶中，置于37°C含5%C02的培養箱中進行培養。24h后，棄去培養瓶中上清液，即去除非粘附細胞，向剩余的粘附細胞中加入18ng/mL濃度的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和 20ng/mL濃度的巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，培養5天后，得到的粘附細胞即為外周血巨噬細胞。利用流式細胞儀以PE標記的CD68抗體檢測巨噬細胞純度。3)人外周血⑶8+T細胞分離及培養CD8+T細胞采用免疫磁珠法分離,利用Q)8+T-cell Positive Isolation Kit試劑盒，根據說明，對外周血淋巴細胞逐步分離，得到90%外周血中的CD8+T細胞。利用流式細胞儀以APC標記的⑶8a抗體檢測⑶8+T細胞純度。4)人髓核細胞和免疫細胞相互作用的體外模型。采用半透膜孔徑為0.4 μ m的Transwell inserts插入式小室建立非接觸共培養模型，將第I步得到的髓核細胞與免疫細胞(即巨噬細胞或CD8+T細胞)按1:1的體積比共
培養；具體操作為:以1.5X106/孔的數目將髓核細胞接種于六孔板，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養液作為培養基；將1.5X IO6的巨噬細胞或⑶8+T細胞接種于Transwellinserts小室，并插入六孔板中，共養48小時后，根據實驗目的對髓核細胞、巨噬細胞或CD8+T細胞進行相關檢測。
權利要求
1.人椎間盤髓核細胞和免疫細胞相互作用的體外模型構建方法，其特征在于: 1)人髓核細胞分離及培養 首先將髓核組織在無菌條件下分離，棄去其中的纖維環組織節軟骨板，將剩余的髓核組織在室溫下置于胰蛋白酶溶液中消化，隨后離心棄去上清液，在室溫下用II型膠原酶靜止消化后，再離心，棄去上清液，細胞用PBS液沖洗離心后以45 μ m孔徑的尼龍過濾網濾去剩余組織，計數板進行細胞計數； 再以胎牛血清的DMEM/F12培養液將細胞接種于培養瓶內，置于37°C含CO2的培養箱中進行培養，每三天換液一次； 2)人外周血巨噬細胞的分離及培養 2.1)外周血單核細胞(PBMCs)分離 利用肝素抗凝管抽取外周血，以1:3的體積比將抽取的外周血加入RPM1-1640培養基并混勻，隨后再以1:1的體積比緩慢加至細胞分離液Ficoll-Paque中，室溫下以800Xg離心30分鐘，隨后吸取白膜層即為外周血單核細胞； 2.2)巨噬細胞分離及培養 將外周血單核細胞接種于含胎牛血清的RPM1-1640培養液的培養瓶中，置于37°C含C02的培養箱中進行培養，24h后，棄去培養瓶中上清液，即去除非粘附細胞，向剩余的粘附細胞中加入18ng/mL濃度的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/mL濃度的巨噬細胞集落刺激因子( M-CSF)，培養5天后，得到的粘附細胞即為外周血巨噬細胞； 3)人外周血⑶8+T細胞分離及培養 利用⑶8+T-cell Positive Isolation Kit試劑盒,根據說明，對外周血淋巴細胞逐步分離，得到外周血中的CD8+T細胞； 4)人髓核細胞和免疫細胞相互作用的體外模型 采用半透膜孔徑為0.4 μ m的Transwell inserts插入式小室建立非接觸共培養模型，將第I步得到的髓核細胞與免疫細胞(即巨噬細胞或CD8+T細胞)按1:1的體積比共培養； 具體操作為:以1.5X IO6/孔的數目將髓核細胞接種于六孔板，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養液作為培養基；將1.5X IO6的巨噬細胞或⑶8+T細胞接種于Transwellinserts小室，并插入六孔板中，共養48小時后，根據實驗目的對髓核細胞、巨噬細胞或CD8+T細胞進行相關檢測。
2.根據權利要求1所述的人椎間盤髓核細胞和免疫細胞相互作用的體外模型構建方法，其特征在于:所述步驟I)將剩余的髓核組織先剪成I X Imm3碎塊，在室溫下置于質量濃度為0.25%的胰蛋白酶消化40min,隨后以1000r/min離心5min,棄去上清液,于室溫下用質量濃度為0.025%的II型膠原酶靜止消化4h，再以1000r/min離心5min，棄去上清液，細胞再用PBS液沖洗3次，以1000r/min離心5min后以45 μ m孔徑的尼龍過濾網濾去剩余組織，計數板進行細胞計數； 再以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養液將細胞接種于培養瓶內，置于37°C含5%C02的培養箱中進行培養，每三天換液一次。
3.根據權利要求1所述的人椎間盤髓核細胞和免疫細胞相互作用的體外模型構建方法，其特征在于:將外周血單核細胞接種于含10%胎牛血清的RPM1-1640培養液接種于培養瓶中，置于37°C含5%C02的培養箱中進行培養，24h后。
全文摘要
人椎間盤髓核細胞和免疫細胞相互作用的體外模型構建方法，即通過建立模型研究人椎間盤免疫赦免的作用機制。本發明共培養模型較好模擬了體外人髓核細胞和免疫細胞相互作用，可為體外椎間盤免疫研究提供一種新的實驗思路。發明人已在研究FasL在椎間盤免疫赦免中的作用機制研究中，采用該共培養模型。此研究通過上調椎間盤退變患者髓核細胞中的FasL表達量，并與免疫細胞共培養后發現，FasL在髓核細胞中的上調可有效增加免疫細胞的凋亡比例。
文檔編號C12N5/0783GK103215223SQ201310085259
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者王海強, 劉志恒, 李新奎, 李昂, 高揚, 孫振, 陳宇飛, 張威林, 張泳照, 萬中元 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學