專利名稱：一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法
技術領域：
本發明屬于農業生物工程技術領域，尤其涉及一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法。
背景技術：
植物雄性不育特性可由細胞質基因引起，稱細胞質雄性不育(CMS)，也可因核基因突變引起，又名核基因雄性不育(GMS)。水稻是自花授粉作物，其雜種優勢利用必須依賴于雄性不育性。在雜交水稻研究和應用之初，使用的雄性不育系都是CMS類型。1973年石明松在湖北晚粳稻品種農墾58群體中發現了自發突變的光周期敏感雄性不育(photoperiod-sensitive genic male sterile, PGMS)株,后來定名為農星 58S (石明松，中國農業科學，1985，2:44-48)，開啟了利用光溫敏雄性不育特性培育兩系法雜交水稻的序眷。經過幾十年的研究，兩系不育系根據其對光照長度和溫度的敏感性可分為光敏不育(PGMS)、溫敏不育(temperature-sensitive genic male sterility, TGMS)和光溫敏核不育(P/TGMS)三類(程式華，中國農業科學，1996，29 (4): 11-16)。PGMS水稻具有長日照條件下抽穗雄性不育，短日照條件下抽穗雄性可育的基本特征，如農墾58S及其衍生的部分不育系。TGMS水稻在高溫條件下抽穗雄性不育，低溫條件下抽穗雄性部分可育，如安農S-1 (鄧華鳳等，雜交水稻，1999，14 (3): 1-3)，廣占63S (楊振玉等，雜交水稻，2002，17(4):4-6)，株 IS (楊遠柱等，雜交水稻，2000，15(2):6-9)等。PGMS 和 TGMS 共同構成了目前生產上大面積應用的兩系法雜交稻不育系基因的主要來源。有的水稻則對光照和溫度都有一定的敏感性，在長日照、高溫下抽穗表現不育，短日照、低溫下表現部分可育，如培矮64S (羅孝和等，雜交水稻，1992，(I): 27-29)。系譜分析表明大多早期商業化應用的P/TGMS系主要有3個起源:農墾58S，安農S-1和株IS (斯華敏等，作物學報，2012，38 (3): 394-407)。在農墾58S衍生的后代中有些保持了光敏特性如玉兔S (趙海軍等，中國水稻科學，2004，18(6):515-521)，而有些則表現為溫敏特性如廣占63S (楊振玉等，雜交水稻，2002，17(4):4_6)。大量遺傳分析表明，PGMS 和 TGMS 都受單隱性基因控制，如安農 S-1 (Yang et al.Planta, 2007，225:321-330)，株IS (楊遠柱等，中國稻米，2007，(6): 17-22)。
為精細定位并最終克隆TGMS，許多研究者針對不同的溫敏不育材料已經做了不少工作。安農S-ι是很多目前在生產上應用的水稻TGMS不育系的不育基因(tms5)的供體，Yang等(Yang et al, 2007)已將tms5定位在染色體2上一個19kb的區域，在其5’和3’端分別由STS標記4039-1和4039-2界定，并認為其候選基因是NAC家族的一個成員(Yanget al.Planta，2007，225:321-330)。Peng 等(Peng et al，2010)將溫敏不育系秈 S 的不育基因同樣也定位于第2號染色體上，介于2個SSR標記RMAN81和RMX21之間183kb的與安農S-1定位區間相近的區域,但認為有著不同于安農S-1的候選基因(Peng et al.TheorAppl Genet, 2010，120:1013-1020)。
除上述提及的兩系水稻不育系外，不同研究所還報道了不少獨立發現的P/TGMS不育水稻材料，有的已經育成商用不育系在兩系雜交水稻生產中應用，如瓊香is (郭國強等，雜交水稻，2009，24 (I): 399-400)，綿9S(王志等，西南農業學報，1999，12 (4): 11-14)，雁農S (陽花秋等，雜交水稻，1996(1):9-10)等，但均未見有與這些不育基因相連鎖的分子標記的公開報道。在水稻兩系不育系選育中，通常需要在田間自然條件下鑒定不育單株。但是，光溫條件在各地及同一地點的不同季節存在很大差異，這對兩系不育系的選育十分不利。如:(O海南是我國水稻冬、春季節水稻加代繁育的重要場所，在3月前抽穗時，由于氣溫相對也較低，因此多數TGMS水稻也表現可育。因此，在海南TGMS基本不能表達，從而制約了兩系不育系的選育。(2)在長江流域及北方水稻區，TGMS水稻在正常水稻生產季節都表現為不育，一旦選到不育株，需要在割茬再生后才有可能結實；由于后期氣溫一般較高，即使再生分蘗也往往高度不育，很難使收獲種子，因此需要將稻樁帶海南、讓其再生分蘗才能獲得種子，不但費時費力，而且嚴重制約可選擇群體的大小。利用分子標記輔助選擇是目前作物育種中的一種先進育種方法。對TGMS這樣的性狀，基于如上所說的原因，利用分子標記輔助選擇育種尤為重要。因為，即使生長環境無法使其TGMS特性得以展現，利用分子標記仍然可以確定其基因型。此外，一旦確定其基因型，還可以通過調節播期有意讓其在可育環境下開花結實，避免需要采用割茬再生、冷水灌溉等 費力但效果欠佳的方法。但是，可能是由于沒有特別適宜的分子標記，迄今尚未見基于分子標記輔助選擇TGMS水稻的報道。同時，由于尚無TGMS基因特異性分子標記，迄今尚未能將TGMS基因像其他基因一樣如抗稻瘟病基因(董巍等，分子植物育種，2010，8 (5):853-860)和白葉枯病抗性基因(蘭艷榮等，中國水稻科學，2011, 25(2): 169-174)聚合在一個不育系中，提高不育系對環境的穩定性。目前用于輔助選擇育種的分子標記主要有微衛星標記(SSR標記)，INDEL標記，RFLP標記，RAPD標記，AFLP標記，STS標記和基于PCR擴增的限制性酶切的CAPS或dCAPS標記(馮建成，中國農學通報，2006，22(2):43-47)。最近，利用有序列變化的擴增子之間微弱的Tm值差異，通過DNA片段溶解曲線的差異進行突變檢測的原理，還發展起來區分SNP的 HRM 分析方法(Reed et al.Pharmacogenomics, 2007, 8:597-608),以及基于 DNA 分子雜交的SNP芯片技術。與其他性狀一樣，在控制每個性狀的基因被克隆之前，可以獲得與目標性狀基因無限接近、在不同品種之間具有多態性的分子標記。傳統利用與溫敏不育緊密連鎖的4039-1 和 4039-2 (Yang et al.Planta, 2007，225:321-330)以及 RMAN81 和 RMX21 (Penget al.Theor Appl Genet, 2010，120:1013-1020)開發了大量的分子標記，這些分子標記的多態性只與研究的表型存在連鎖關系，在生物學上不存在因果關系，并不是功能性分子標記。在這些分子標記的實際應用中，首先要確定在研究的不育系和野生型材料之間是否存在多樣性，只有在存在多樣性的前提下，才能進一步用分子標記輔助選擇等。在很多情況下，特別是品種之間雜交時往往不存在多態性；同時，即使存在多態性，由于只是連鎖關系，減數分裂時的基因重組，也會打破這種連鎖關系，從而影響選擇效果。功能性分子標記是指根據在基因水平上決定某一性狀差異的核苷酸序列而開發的分子標記，其特征是用該分子標記表示的不同等位基因直接代表一種表型性狀，分子標記與性狀之間不像其他分子標記只是連鎖關系(連鎖關系意味著分子標記與性狀之間存在多種可能的相斥或相向關系；同時，在育種過程中這種連鎖關系可能被打破)。迄今，尚無公開報道開發出了水稻TGMS基因的功能性分子標記。
發明內容
本發明公開了一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，通用性廣，簡單有效，準確率高且成本低廉。一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，包括:(I)提取水稻樣品DNA ；(2)根據RNaseZ基因的第70 71位核苷酸的多態性，設計引物，進行PCR擴增；(3)對PCR擴增產物進行特性分析，確定水稻樣品的基因型。其中，RNaseZ基因的核苷酸序列如SEQ N0.1所示。溫敏雄性不育水稻的RNaseZ基因第70 71位核苷酸為+7°TA，而正常可育的水稻或光敏不育水稻在該位點為+7tlTC或+7°gc，因此可針對包含該位點的核苷酸多態性，對水稻樣品進行基因分型。所述的水稻樣品可以為秈稻、粳稻或非洲栽培稻，也可以為不同類型水稻雜交產生的非典型的秈稻、粳稻、非洲栽培稻等。按品種劃分，所述的水稻樣品可以為水稻常規品種、雜交品種、育種中間材料等，當然，所述水稻樣品也可以為采用雜交以外的方法得到的新品系。提取水稻DNA 時，可以采用水稻的種子、葉片、根、花器等組織。對水稻DNA的提取方法也沒有特殊要求，可以為CTAB法、SDS提取法、ROSE —管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用試劑盒進行DNA的提取。所述特性分析為高分辨率溶解曲線分析或擴增產物酶切片段多態性分析。若進行高分辨率溶解曲線分析，步驟(2)中，所述引物的堿基序列為:上游引物RNZ-F3:5’ -ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3’ ；下游引物RNZ-Rl: 5，-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3 ’。步驟(2)中，所述PCR擴增的體系為:2XPCR Master Mix，5 μ L ;10 μ M的上游弓丨物 RNZ-F3，0.2μ L ;10 μ M 的下游引物 RNZ-R1，0.2 μ L ； 10 X LC green-Plus, I μ L ；25ng/y L的 DNA, I μ L ;無菌水 2.6 μ L ;礦物油 10-20 μ L。所述PCR擴增的程序為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，50_60°C退火30s，72°C延伸30s，共35-40個循環；72°C延伸7min。若進行擴增產物酶切片段多態性分析，步驟(2)中，所述引物為兩對，其中，第一對引物的堿基序列為:上游引物RNZ-Fl:5，-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3，；下游引物 RNZ-Rl: 5 ’ -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3 ’ ；第二對引物的堿基序列為:上游引物RNZ-F2:5，-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3，；下游引物RNZ-Rl: 5，-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3，。步驟(2)中，所述PCR擴增的體系為:2XPCR Master Mix，10 μ L ; 10 μ M的上游引物，0.4 μ L ; 10 μ M的下游引物，0.4 μ L ；25ng/ μ L的DNA，I μ L ;補充無菌水至20 μ L0所述PCR擴增的程序為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，50_60°C退火30s，72°C延伸30s，共35-40個循環；72°C延伸7min。進行擴增產物酶切片段多態性分析時，第一對引物的擴增產物采用Hinf I進行酶切，第二對引物的擴增產物采用Sty I進行酶切。酶切的反應體系為:10XH Buffer, I μ L ；0.1%BSA, I μ L ;限制性內切酶，0.3 μ L ；PCR擴增產物，2 μ L ;無菌水補足至10 μ Lo酶切的反應條件為:37°C水浴4_12h。與現有技術相比，本發明的有益效果為:(I)本發明水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法簡單，有效，準確率高，且成本低廉。(2)本發明確定了水稻RNaseZ基因控制水稻的溫敏雄性不育性狀，為水稻的溫敏雄性不育基因，并針對該溫敏不育基因RNaseZ的序列特點，開發了分子標記。本發明開發的分子標記是根據造成水稻溫敏雄性不育性狀變異的遺傳基礎，即在確定造成水稻溫敏雄性不育生物學機制的基礎上發展起來的，因此屬于功能性分子標記。這樣，本發明開發的分子標記在育種中不但適用于任何組合，而且也不會因遺傳重組而發生變化，具有通用性和廣適性。(3) HRM分子標記易于高通量操作。采用HRM分子標記時，由于在PCR結束后，擴增產物可以在儀器上如LightScanner上直接分型，因此較其他類型的分子標記更加適用于高通量分析。(4)利用本發明的方法輔助育種，方便、準確，節約成本，能大大提高品種選擇效率，加快溫敏不育水稻品種育種進程，而且可以避免環境因素對于表型的影響。
圖1為溫敏不育候選基因RNaseZ結構及dCAPS分子標記引物設計示意圖；其中，黑色方框代表外顯子，直線代表內含子；溫敏不育突變位點用白色三角標出；箭頭代表所設計的分子標記引物位置；并在圖下方方框中列出了所修改的堿基位置和類型，以及所形成的限制性內切酶的識別位點；圖2a為dCAPS分子標記(引物為RNZ-F1/RNZ-R1)對株IS和08EZ01兩個親本及其F2代中不育單株進行檢測的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；其中，M為DNA分子量標準；泳道I為株IS ;泳道2為08EZ01 ;泳道3為F1 ;泳道4-27為F2代不育單株；圖2b為是dCAPS分子標記(引物為RNZ-F1/RNZ-R1)對株IS和08EZ01兩個親本及其F2代中可育單株進行檢測的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；其中，M為DNA分子量標準；泳道I為株IS ;泳道2為08EZ01 ;泳道3為F1 ;泳道4-30為F2代可育單株； 圖3a為dCAPS分子標記(引物為RNZ-F2/RNZ-R1)對Y58S和ZlO兩個親本及其F2代中不育單株進行檢測的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；其中，M為DNA分子量標準；泳道I為Y58S ;泳道2為ZlO ;泳道3為F1 ;泳道4-36為F2代不育單株；圖3b為dCAPS分子標記(引物為RNZ-F2/RNZ-R1)對Y58S和ZlO兩個親本及其F2中可育單株進行檢測的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；其中，M為DNA分子量標準；泳道I為Y58S ;泳道2為ZlO ;泳道3為F1 ;泳道4-23為F2代可育單株；圖4a為水稻溫敏不育基因RNaseZ的HRM分子標記中不同基因型隨溫度變化的溶解曲線圖；其中，沿著箭頭方向，曲線依次代表的基因型為TC、TA、TA/TC、TA/GC和GC ；圖4b為HRM分子標記對溫敏不育候選基因位點不同基因型進行分型的峰圖；圖5a為利用dCAPS分子標記(Hinf I酶切)檢測不同類型的光溫敏不育系的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖5b為利用dCAPS分子標記(Sty I酶切)檢測不同類型的光溫敏不育系的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖； 其中，圖5a_圖5b中，M為DNA分子量標準；前6個泳道為酶切前的PCR產物對照；泳道I為株IS ;泳道2為08EZ01 ;泳道3為日本晴；泳道4為株IS和08EZ01的混合；泳道5為株IS和日本晴的混合；泳道6為08EZ01和日本晴的混合；泳道7_25分別為GS138 ；廣占 63S ；Y58S ;廣湘 24S ;N422S/R8272 (F1);雙 8S/0293 (F1) ；W6154S ;龍 S ；Z9S ;海豐 IS ；1892S ;桂科-1S ;桂科-2S ；X07S ;雁農 S ；GS2011-20 ;安 7S-1II ;綿 9S ;943S。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步闡釋。實施例1水稻溫敏不育功能性分子標記的開發于2011年，構建溫敏不育系株IS和野生型08EZ01的雜交F2后代群體，并于田間調查分離比，結果發現在1260個F2單株中有286株完全不育單株，表型分離比符合3:1，說明溫敏性狀為單隱性基因控制。在開花期鏡檢觀察取樣完全不育的單株549株，用于定位控制株IS溫敏不育性狀的基因，并構建基因池，利用348對均勻分布于各條染色體上的SSR標記進行初步定位，將溫敏不育基因定位于第2號染色體上。之后在該條染色體上發展更多的標記，并利用這549株完全不育的單株進行更加精細的定位，最后將該基因定位于第2號染色體RM12721和RM12735 之間。在定位區間內尋找有可能的候選基因，測序發現位于第2染色體上的RNaseZ(RNZ)水稻同源基因RNZ (L0C_0s02gl2290)在不育系和野生型品種中存在差異，溫敏不育品種在該基因第I外顯子中存在的一個提前終止的突變+7°TAG，并且該突變與水稻溫敏雄性不育(TGMS)性狀完全一致，所有檢測的TGMS水稻在該位點均為+7°TAG，而正常可育的水稻品種或光敏不育水稻在此位點上要么為+7°TCG，要么為+7°GCG。據此，我們認為該基因為控制溫敏不育的基因，并開發了一組特異性區別上述變異的分子標記。以下將上述三種RNZ等位基因分別記為RNZta，RNZtc和RNAee。1、水稻溫敏不育功能性dCAPS(擴增產物酶切片段多態性)分子標記的開發(I)區分RNZta和RNZTe等位基因的功能性dCAPS分子標記
在Gramene 網站(http://www.gramene.0rg/)下載 L0C_0s02gl2290 的核苷酸序列(如SEQ N0.1)，并利用Primer Premier5.0軟件在+70TAG區域附近設計PCR引物，堿基序列為:上游引物(RNZ-Fl):5， -ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3，；下游引物(RNZ-Rl):5， -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3，；由于突變位點處沒有任何限制性酶切位點可用，因此在引物RNZ-Fl的3’末端引入了一個錯配堿基從而形成一個限制性內切酶Hinf I的識別位點(如圖1)。在引入這一錯配堿基后擴增的PCR產物，等位基因RNZta不能被HinfI酶切，等位基因RNZtg含有Hinf I的識別位點，可以被Hinf I酶切成153bp和25bp 二段，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，攜帶不同等位基因的水稻材料可以容易地加以區分，擴增片段經HinfI酶切后，只攜帶RNZta等位基因的純合材料只顯示178bp的條帶；而只攜帶RNZTe等位基因的純合材料顯示153bp和25bp的條帶；而同時攜帶RNZta和RNZrc等位基因的雜合材料顯示178bp、153bp和25bp三個條帶(如圖2a、圖2b)。該dCAPS分子標記能將只攜帶RNZta等位基因的純合溫敏材料和只攜帶RNZTe等位基因的純合野生型材料以及攜帶2種等位基因的雜合(但雄性可育)材料加以區分。(2)區分RNZta和RNZee等位基因的功能性dCAPS標記采用相似的原理利用Primer Premier5.0軟件在+7ciTAG區域附近設計PCR引物，堿基序列為:`
上游引物(RNZ-F2):5， -ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3，；下游引物(RNZ-Rl):5， -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3，；引物RNZ-F2是根據突變位點設計的，同樣由于突變位點處沒有任何限制性酶切位點可用，因此在引物RNZ-F2的3’末端引入一個錯配堿基從而形成一個限制性內切酶StyI的識別位點(如圖1)。在引入這一錯配堿基后擴增的PCR產物，等位基因RNZta不能被Sty I酶切，而等位基因RNZgg含有Sty I的識別位點，可以被Sty I酶切成155bp和23bp 二段，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，攜帶不同等位基因的水稻材料可以容易地加以區分，擴增片段經StyI酶切后，只攜帶等位基因RNZta的純合材料只顯示178bp的條帶；而野生型可育等位基因RNZgc的純合材料只顯示155bp和23bp的條帶；而同時攜帶兩種等位基因的雜合材料顯示178bp、155bp和23bp三個條帶(如圖3a、圖3b)。因此，該dCAPS標記能將攜帶RNZta等位基因的純合溫敏材料和只攜帶RNZee等位基因的純合野生型材料以及攜帶2種等位基因的雜合(但雄性可育)材料加以區分。2、水稻溫敏不育功能性HRM(高分辨率溶解曲線)分子標記的開發采用相似的原理利用Primer Premier5.0軟件在+7ciTAG區域附近設計HRM引物，堿基序列為:上游引物(RNZ-F3): 5，-ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3，；
下游引物(RNZ-Rl):5 ’ -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3 ’ ；引物位置如圖1所示，根據HRM分析要求進行PCR擴增，將擴增產物在HRM分析儀(如LightScanner)分析，可以直觀地將等位基因RNZTA與其他兩種等位基因加以區別。如圖4a、圖4b所示，不同基因型的溶解曲線在93 96°C區段釋放的熒光信號明顯不同，熒光染料特異的與DNA雙鏈結合，隨溶解溫度的上升，與DNA雙鏈相結合的熒光信號強度相對變化。由于，不同類型的基因型所形成的PCR產物有著不同的Tm值，有不同的熒光隨溫度上升的變化值，根據高分辨率溶解曲線基因分型的原理，如果兩條曲線的AF值(相對熒光強度)大于0.05，則可以認為二者屬于不同的基因型。如圖4b所示，以只攜帶等位基因RNZta的純合溫敏材料為基準線，只攜帶RNZrc等位基因的純合野生型材料，只攜帶等位基因RNZre的純合野生型材料，攜帶RNZta和RNZrc兩種等位基因的雜合(但雄性可育)材料以及攜帶RNZta和RNZee2種等位基因的雜合(但雄性可育)材料，這五種基因型都能夠被明顯的相互區分開。因此，可以將上述已知基因型的溶解曲線作為對照，將待檢測水稻材料的溶解曲線與對照進行對比，如果兩條曲線的Λ F值小于0.05，則認為基因型相同，由此確定待檢測水稻材料的基因型。實施例2利用dCAPS分子標記區分雙親基因型為RNZta和RNZrc的雜交后代植株利用溫敏不育材料株IS和可育材料08EZ01配制其雜交組合F2代，其中經測序驗證，株IS和08EZ01在溫敏不育候選基因突變位點基因型分別為RNZta和RNZtg,因此針對該親本所配制雜交后代作為試驗材料，這些試驗材料于2012年夏季種植于浙江大學實驗農場，自田間開花期觀察并鏡檢花粉育性，共取549株表現為完全不育的單株和27株可育單株。另外，采集這些試驗材料的葉片，利用dCAPS分子標記對RNZ基因進行檢測。1、水稻基因組DNA的提取(I)將水稻葉片剪碎后置于2.0mL離心管中，同時放入一粒鋼珠，用組織碾磨儀磨碎；(2)加入 800 μ L CTAB 提取緩沖液(Tris-HCl, IOOmM, ρΗ8.0 ；EDTA, 20mM, ρΗ8.0 ；NaCl,500mM ；CTAB, 2%)，65°C水浴 40min,期間搖動 3-4 次；(3)加入等體積的氯仿:異戊醇(24:l,v/v)混合液，上下顛倒混勻，10000r/min離心 IOmin ；(4)轉移上清至新的1.5mL離心管中，加入等體積_20°C預冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置 _20°C下沉淀 30min, 10000r/min 離心 IOmin ；(5)棄上清液,70%乙醇洗漆I次，IOOOOrpm離心IOmin ；(6)棄上清液，無水乙醇洗滌I次，自然風干，溶于適量(100-200 μ L) TE溶液中，-20°C保存。2、包含突變位點DNA片段的PCR擴增、酶切和分析以提取的水稻DNA為模板，采用實施例1中設計的特異性引物RNZ-Fl和RNZ-R1，進行PCR擴增，PCR擴增的反應體系見表I。表I用于dCAPS分子標記的PCR 反應體系
權利要求
1.一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，包括: (1)提取水稻樣品DNA； (2)根據RNaseZ基因的第70 71位核苷酸的多態性，設計引物，進行PCR擴增； (3)對PCR擴增產物進行特性分析，確定水稻樣品的基因型。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述特性分析為高分辨率溶解曲線分析或擴增產物酶切片段多態性分析。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，若進行高分辨率溶解曲線分析，步驟(2)中，所述引物的喊基序列為:上游引物 RNZ-F3:5’ -ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3’ ；下游引物 RNZ-Rl:5’ -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴增的體系為:2XPCRMaster Μ χ,δμ L ;10μΜ 的 上游引物 RNZ_F3，0.2μ L ;10μΜ 的下游引物 RNZ-R1,0.2μ L ；10XLC green-Plus, I μ L ；25ng/y L 的 DNA，I μ L ;無菌水 2.6 μ L ;礦物油 10-20 μ L。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴增的程序為:94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，50-60°C退火 30s，72°C延伸 30s，共 35-40 個循環；72°C延伸 7min。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，若進行擴增產物酶切片段多態性分析，步驟(2)中，所述引物為兩對，其中， 第一對引物的堿基序列為:上游引物 RNZ-Fl:5’ -ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3’ ；下游引物 RNZ-Rl:5’ -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’ ； 第二對引物的堿基序列為:上游引物 RNZ-F2:5’ -ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3’ ；下游引物 RNZ-Rl:5’ -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴增的體系為:2XPCRMaster Mix，10 μ L ; 10 μ M 的上游引物，0.4 μ L ;10 μ M 的下游引物，0.4 μ L ；25ng/y L 的DNA, I μ L ;補充無菌水至20 μ L。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴增的程序為:94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，50-60°C退火 30s，72°C延伸 30s，共 35-40 個循環；72°C延伸 7min。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，第一對引物的擴增產物采用HinfI進行酶切，第二對引物的擴增產物采用Sty I進行酶切。
全文摘要
本發明公開了一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，包括提取水稻樣品DNA；根據RNaseZ基因的第70～71位核苷酸的多態性，設計引物，進行PCR擴增；對PCR擴增產物進行特性分析，確定水稻樣品的基因型；其中，RNaseZ基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。本發明水稻溫敏雄性核不育基因分型的方法簡單，有效，準確率高，且成本低廉。本發明確定了水稻RNaseZ基因控制水稻的溫敏雄性不育性狀，為水稻的溫敏雄性不育基因，并針對該溫敏不育基因RNaseZ的序列特點，開發了功能性的分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK103160583SQ20131009650
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月25日 優先權日2013年3月25日
發明者舒慶堯, 張華麗, 黃建中 申請人:浙江大學, 無錫求是生物農業有限公司, 浙江之豇種業有限責任公司