專利名稱：一種農桿菌介導的快速轉基因方法
技術領域：
本發明涉及一種農桿菌介導的快速轉基因方法。
背景技術：
植物基因工程是指通過某種方法將外源基因導入到受體植物基因組中，使之穩定遺傳并賦予植物抗蟲、抗病、抗逆、抗除草劑、高產和優質等新的性狀。改變一株植物的遺傳性狀的能力是提高農作物農藝性狀和培育成帶有目的性狀的栽培品種的基礎。向植物細胞中導入外源基因的方法和技術中，應用時間較長、方法較成熟的是根癌農桿菌介導法和基因槍法。由于這兩種轉化方法有一些缺點，因此科學工作者們探索了一些可替代二者的植物遺傳轉化方法。例如，花粉管通道法、真空滲入法、莖尖轉化法、超聲波輔助的農桿菌轉化法、碳化硅纖維介導法、葉綠體轉化法以及藻酸鈣微珠介導法等。莖尖轉化法是一種快速的、可應用于單子葉植物和雙子葉植物、不依賴植物基因型、不經過去分化和組織誘導階段的轉化方法，具有巨大的應用潛力；浸花法是轉化擬南芥的主要方法，該方法簡單易行，也不需要經過組織培養過程，可以高效率獲得轉基因植株，隨著轉化體系的進一步完善，在許多作物的轉化中非常有效。這兩種方法都是生物介導的農桿菌轉化法，農桿菌轉化法操作簡單、成本低、轉化效率高，廣泛應用于植物的遺傳轉化中，說明農桿菌轉化法的潛力巨大。但是這些方法也有一些不足之處，如花粉管通道法重復性較差，應用范圍較窄，操作經驗性強，轉化效率低；真空滲入法處理后植株處于極虛弱的狀態，用于少數植物轉化；莖尖轉化法外源基因容易丟失，適用于少數植物的轉化；超聲波輔助的農桿菌轉化法處理后細胞損傷程度大，難以恢復；碳化硅纖維介導法安全性差、轉化效率較低；葉綠體轉化法缺少有效的選擇標記基因，外源基因表達不穩定；藻酸鈣微珠介導法轉化效率較低。隨著轉基因技術的不斷發展，越來越多的外源基因待轉移到植物中，而上述的方法又有各自的不足，因此，尋找能擺脫組織培養的限制，在自然環境下大規模進行轉基因的工作，且操作要求低的轉化方法十分重要。
發明內容
針對上述問題，本發明提供了一種農桿菌介導的快速轉基因方法，目的在于提供一種在自然環境下的雙子葉植物活體轉基因方法，能快速獲得轉基因植株，進行植物的基因工程改良。該方法可以避免誘導愈傷組織以及愈傷組織培養中引起的不利變異，操作簡單，成本低廉，可以在短時間內獲得轉基因植株。—種農桿菌介導的快速轉基因方法，包括以下步驟:
(O自然環境下試驗材料的栽培:在自然環境下種植試驗材料，當材料有6片葉子以上且腋芽不高于0.5cm時，開始用作試驗受體；
(2)農桿菌工程菌轉化液的配制:將含有目的基因的農桿菌接種到含有篩選壓的液體培養基進行擴大培養， 當菌液0D_值達到0.8^1.3時，離心分離菌體，用含有篩選壓的AAM液體培養基重懸浮，加入乙酰丁香酮和吐溫20，使菌液OD_值為2.5^3.0，農桿菌轉化液配制完成，待用；
(3)試驗受體的預處理:在試驗受體所處的環境溫度為20°C 30°C、試驗受體溫度不高于28°C時，去掉頂芽和腋芽，用注射器挫傷或刺傷腋芽處的組織；
(4)農桿菌浸染:把(2)中配制好的農桿菌轉化液滴在挫傷或刺傷處，再用脫脂棉球沾上農桿菌轉化液覆蓋在傷口處，其后不間斷往脫脂棉球滴加農桿菌轉化液，讓其保持濕潤4小時以上，處理期間受體溫度不能超過30°C ；
(5)抗性愈傷的篩選:當材料傷口上出現l_2mm大小的愈傷組織時，補加篩選壓，抑制愈傷中非轉基因細胞的分裂，使轉基因細胞正常分裂并分化成抗性芽；
(6)抗性芽的篩選:當抗性芽低于1.5cm時，補加篩選壓，抑制非轉基因愈傷芽的分化，使抗性芽正常生長，及時剪掉未經轉化處理的枝條，使抗性芽長成抗性枝條；
(7)轉基因植株的鑒定；對抗性枝條進行轉基因鑒定，結果呈陽性的植株即為轉基因植株。所述試驗材料為·雙子葉植物。所述雙子葉植物為蕃茄或辣椒。所述步驟(2)中的農桿菌轉化液中乙酰丁香酮的濃度為40-50mmol/L，吐溫20的體積百分濃度為0.02%。更具體地，本發明的一種農桿菌介導的快速轉基因方法，包括以下步驟:
(1)自然環境下試驗材料的栽培:用50%多菌靈可濕性粉劑，多菌靈與水按為Ig:200ml的比例配成藥液，室溫下浸泡材料種子12-24小時，中間翻動2-3次，浸泡后即可播種，播種間距適中，當材料有6片葉子以上(為保證每株植物有足夠的腋芽數，必須有6片以上)且腋芽不高于0.5cm時，開始用作試驗受體；
(2)農桿菌工程菌轉化液的配制:將含有目的基因的農桿菌接種到含有篩選壓的液體培養基進行擴大培養，對其中的外源基因進行檢測，確定農桿菌工程菌的正常，當菌液0D_值達到0.8^1.3時，室溫12000r/m離心分離菌體，用含有篩選壓的AAM液體培養基重懸浮菌體，加入終濃度為40-50mmol/L的酰丁香酮(AS)和體積百分濃度為0.02%的吐溫20，使農桿菌轉化液0D_值為2.5^3.0,以上過程都需在無菌條件下進行，農桿菌轉化液配制完成，待用;
(3)試驗材料的預處理:在試驗材料所處的環境溫度為20°C 30°C、試驗材料溫度不高于28°C時，去掉試驗材料的頂芽和腋芽，用Iml —次性注射器挫(或刺)傷腋芽處的組織，如傷口處滲出較多的組織液，需用脫脂棉或衛生紙吸干；
(4)農桿菌浸染:把(2)中配制好的農桿菌轉化液(配制到使用不要超過2h)滴在植株挫(或刺)傷處，再用脫脂棉球沾上農桿菌轉化液放在傷口上，其后不間斷往脫脂棉球滴農桿菌轉化液(配制到使用不要超過2h)，讓脫脂棉球保持濕潤4小時以上，如材料在田間需進行遮陽處理，避免陽光直射；
(5)抗性愈傷的篩選:在材料處理部位出現l-2mm大小的愈傷組織時，向其愈傷加適當的篩選壓，抑制愈傷中非轉基因細胞的分裂，使轉基因細胞正常分裂并分化成抗性芽；
(6)抗性芽的篩選:在抗性愈傷分化的芽低于0.5-1.5cm時補加適當濃度的篩選壓,抑制非轉基因愈傷分化的芽，使轉基因愈傷分化出的芽正常生長，及時剪掉未經轉化處理的枝條，使抗性芽能長成抗性枝條；
(7)轉基因植株的鑒定；當抗性枝條長至3 5cm時，對抗性枝條進行轉基因鑒定，結果呈陽性的枝條即為轉基因枝條，及時剪掉結果呈陰性的枝條和未經轉化處理的枝條，使抗性枝條成主枝條，以便后期種子的收集。本發明具有如下有益效果:
1.整個轉化過程無需在無菌環境下進行，在自然環境下就可完成，可大規模進行實驗。2.轉化過程不需進行組織培養，可有效的縮短實驗時間。
3.實驗操作簡單,難度低。4.農桿菌介導的轉化法可以準確完整的把外源基因轉入到受體細胞中，且能插入到受體基因組中，轉基因植物遺傳較穩定。推測本發明的雙子葉植物腋芽處農桿菌轉化法的機理為以下幾點:
(I)雙子葉植物腋芽處為腋芽分化的源泉，具有極強的生長和分化能力。(2)雙子葉植物在去掉腋芽后，又對其傷口處進行挫(或刺)傷，此處細胞直接裸露在外，農桿菌菌液能夠輕易接觸到裸露細胞從而直接浸染。(3)腋芽處為植物的核心部位，去掉頂芽后，此處擁有最好的營養條件和生理狀況，只要在進行轉基因操作時不過度傷害，則轉基因處理后的細胞分化良好。
圖1A為辣椒待處理苗；
圖1B為蕃茄待處理苗；
圖2A為農桿菌侵染中的辣椒；
圖2B為農桿菌侵染中的蕃茄；
圖3A為Hyg篩選過的辣椒抗性愈傷，圖中的愈傷已經分化出芽；
圖3B為Hyg篩選過的辣椒非抗性愈傷，圖中的愈傷褐化死亡；
圖3C為Hyg篩選過的蕃茄抗性愈傷，圖中的愈傷已經分化出芽；
圖3D為Hyg篩選過的蕃茄非抗性愈傷，圖中的愈傷褐化死亡；
圖4A為Hyg篩選過的辣椒抗性分化芽長成的枝，圖中的辣椒枝上的葉顏色和性狀都正
常；
圖4B為Hyg篩選過的辣椒非抗性分化芽長成的枝，圖中的辣椒枝上的葉成畸形，數日后枯委；
圖4C為Hyg篩選過的蕃茄抗性分化芽長成的枝，圖中的蕃茄枝上的葉顏色和性狀都正 常；
圖4D為Hyg篩選過的蕃茄非抗性分化芽長成的枝，圖中的蕃茄枝枯萎死亡；
圖5A為轉基因辣椒植株的PCR檢測結果，M為Mark，A為陽性對照，B為陰性對照，C為非轉基因辣椒植株，D和E為轉基因辣椒植株；
圖5B為轉基因蕃茄植株的PCR檢測結果，M為Mark，A為陽性對照，B為陰性對照，C為非轉基因蕃茄植株，D、E和F為轉基因蕃茄植株；
圖6A為轉基因辣椒植株后期生長狀況；圖6B為轉基因蕃茄植株后期生長狀況。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更清楚，下面將結合附圖，對本發明的實施例進行詳細的描述。本發明實施例以蕃爺和辣椒為研究對象，蕃爺為黃美人，購于壽光蔬菜種子旗艦店，辣椒為8819線椒，購于景苑旗艦店，將農桿菌工程菌采用本發明的腋芽處轉化法轉化蕃茄腋芽227處和辣椒腋芽181處，最終經過潮霉素抗性鑒定和PCR鑒定，獲得蕃茄轉基因植株3株和辣椒轉基因植株2株。其它雙子葉植物的農桿菌介導腋芽處轉化法基本步驟一致，只需對相應參數進行適當優化調整即可。下述實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。一、蕃茄和辣椒腋芽處農桿菌介導的轉化法 1.農桿菌工程菌簡介
本發明所使用的是含真核表達載體PTCK303-J0.的農桿菌工程菌，農桿菌為
LBA4404菌株，載體為pTCK303，3a-羥類固醇脫氫酶基因(3 a-HSD/CR)編碼基因全長774bp，該農桿菌工程菌具有潮霉素(Hyg)抗性、卡那霉素(Kan)抗性和利福平(Rif)抗性。2.蕃茄和辣椒的種植
蕃茄品種黃美人，辣椒品種8819線椒，種子用50%多菌靈可濕性粉劑與水按為lg: 200ml的比例配成藥液,室溫下浸泡材料種子12-24小時，中間翻動2_3次,浸泡后即可播種于小盆內，放入恒溫培養箱內。當辣椒小苗生長到l(Tl5cm時(附圖1A)，進行實驗；當蕃茄小苗生長至6 10cm時，移栽至桶中，每桶f 2株，當其生長至有6個以上腋芽時(附圖1B )，進行實驗。3.農桿菌工程菌轉化液的配制
將農桿菌工程菌劃線于YEB固體培養基(100 mg/L Rif和100 mg/L Kan)，28°C恒溫光照培養箱暗光培養約48 h。挑取農桿菌單菌落接種10 mL YEB液體培養基(100 mg/L Rif和100 mg/L Kan)中，28°C，250 r/min恒溫搖床培養約48 h。取I mL菌液于50mL YEB 液體培養基(100 mg/L Rif 和 100 mg/L Kan)中，28°C，250 r/min 恒溫搖床培養至OD600值達到0.8 1.3時。10000 rp/m 5 min收集菌體，用AAM液體培養基(100 mg/L Kan、40-50mmol/L AS和體積百分濃度為0.02%的吐溫20，AAM液體培養基配方見表I)重懸浮菌體，農桿菌轉化液OD6tltl值為2.5^3.0,以上過程都需在無菌條件下進行，農桿菌轉化液配制完成，待用。4.蕃茄和辣椒腋芽處預處理
在試驗材料所處的環境溫度為20°C 30°C、試驗材料溫度不高于28°C時，去掉試驗材料的頂芽和腋芽，用Iml —次性注射器挫(或刺)傷腋芽處的組織，傷口處滲出的組織液用脫脂棉吸干。5.農桿菌浸染 把3中配制好的農桿菌轉化液(配制到使用不要超過2h)滴在植株挫(或刺)傷處，再用脫脂棉球沾上農桿菌轉化液放在傷口上(附圖2A、2B)，其后每隔30min往脫脂棉球滴農桿菌轉化液(配制到使用不要超過2h)，讓脫脂棉球保持濕潤4小時以上，使得農桿菌工程菌有足夠的活力和時間去侵染植物細胞，辣椒繼續放在恒溫培養箱中，桶中的蕃茄苗侵染后搬到室內一周后搬到室外。 6.抗性愈傷的篩選
在侵染后約1(Γ15天后，辣椒和蕃茄腋芽處都會出現f 2mm大小的愈傷組織，配制好3mg/L和40mg/L的Hyg溶液，帶上手套和口罩，用鑷子夾住脫脂棉球向愈傷涂抹Hyg溶液。辣椒愈傷涂抹40mg/L的Hyg溶液,再用約5mm寬的薄脫脂棉球沾上40mg/L的Hyg溶液,放在愈傷上，3飛h往薄脫脂棉球滴加少許的40mg/L的Hyg溶液；蕃爺愈傷涂抹3mg/L的Hyg溶液，再用約5mm寬的薄脫脂棉球沾上3mg/L的Hyg溶液，放在愈傷上，3飛h往薄脫脂棉球滴加少許的3mg/L的Hyg溶液,保持其濕潤3天。7.抗性芽的篩選
在抗性愈傷篩選后3飛周,抗性愈傷會分化出芽,配制好5mg/L和60mg/L的Hyg溶液，當分化的芽在0.5-1.5cm時，帶上手套和口罩，用鑷子夾住脫脂棉球向分化芽涂抹Hyg溶液，在涂抹時一定要注意保護好自己，同時不要涂抹到未經過轉化處理的正常枝葉。辣椒芽涂抹60mg/L的Hyg溶液，不間斷涂抹，保持芽表面濕潤，保持5天，記錄數據；蕃茄芽涂抹5mg/L的Hyg溶液，不間斷涂抹，保持芽表面濕潤，保持3天，記錄數據。8.轉基因植株的鑒定
根據GenBank上已公布的3 a -HSD/CR全長基因序列(774 bp)，設計一對PCR擴增引
物:
5’ 端引物 HSDl: 5，-CGAATTCATATGTCCATCATCGTGATA-3，劃線為 Nde I 酶切位點；
3’ 端引物 HSD2: 5，-CGGGATCCGAACTGTGTCGGGC-3，劃線為 BamH I 酶切位點。取抗性枝條的葉片，用常規SDS法提取基因組DNA，以該基因為模板，以HSD1/HSD2為上下游引物進行PCR鑒定，PCR體系為總體積為25 μ L的標準TaqPCR體系，其中含有基因組 DNA 2μ L, PCR 反應條件為:94°C 5 min ；94°C 90 s，66°C 45 s，72°C 90s, 30 個循環；72 °C延伸10 min。取PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。表I AAM液體培養基配方
權利要求
1.一種農桿菌介導的快速轉基因方法，其特征在于，步驟如下: (O自然環境下試驗材料的栽培:在自然環境下種植試驗材料，當材料有6片葉子以上且腋芽不高于0.5cm時，開始用作試驗受體； (2)農桿菌工程菌轉化液的配制:將含有目的基因的農桿菌接種到含有篩選壓的液體培養基進行擴大培養，當菌液0D_值達到0.8^1.3時，離心分離菌體，用含有篩選壓的AAM液體培養基重懸浮，加入乙酰丁香酮和吐溫20，使菌液OD_值為2.5^3.0，農桿菌轉化液配制完成，待用； (3)試驗受體的預處理:在試驗受體所處的環境溫度為20°C 30°C、試驗受體溫度不高于28°C時，去掉頂芽和腋芽，用注射器挫傷或刺傷腋芽處的組織； (4)農桿菌浸染:把(2)中配制好的農桿菌轉化液滴在挫傷或刺傷處，再用脫脂棉球沾上農桿菌轉化液覆蓋在傷口處，其后不間斷往脫脂棉球滴加農桿菌轉化液，讓其保持濕潤4小時以上，處理期間受體溫度不能超過30°C ； (5)抗性愈傷的篩選:當材料傷口上出現l_2mm大小的愈傷組織時，補加篩選壓，抑制愈傷中非轉基因細胞的分裂，使轉基因細胞正常分裂并分化成抗性芽； (6)抗性芽的篩選:當抗性芽低于1.5cm時，補加篩選壓，抑制非轉基因愈傷芽的分化，使抗性芽正常生長，及時剪掉未經轉化處理的枝條，使抗性芽長成抗性枝條； (7)轉基因植株的鑒定；對抗性 枝條進行轉基因鑒定，結果呈陽性的植株即為轉基因植株。
2.根據權利要求1所述一種農桿菌介導的快速轉基因方法，其特征在于:所述試驗材料為雙子葉植物。
3.根據權利要求2所述一種農桿菌介導的快速轉基因方法，其特征在于:所述雙子葉植物為蕃茄或辣椒。
4.根據權利要求1所述一種農桿菌介導的快速轉基因方法，其特征在于:所述步驟(2)中的農桿菌轉化液中乙酰丁香酮的濃度為40-50mmol/L，吐溫20的體積百分濃度為0.02%。
全文摘要
本發明涉及一種農桿菌介導的快速轉基因方法。步驟如下(1)試驗材料的栽培；(2)農桿菌工程菌轉化液的配制；(3)試驗材料的預處理；(4)農桿菌浸染；(5)抗性愈傷的篩選；(6)抗性芽的篩選；(7)轉基因植株的鑒定。本發明目的在于提供一種在自然環境下的雙子葉植物活體轉基因方法，能快速獲得轉基因植株，進行植物的基因工程改良。該方法可以避免誘導愈傷組織以及愈傷組織培養中引起的不利變異，操作簡單，成本低廉，可以在短時間內獲得轉基因植株。突破了植物組織培養的限制，不依賴于植物基因型，操作簡單，工作周期短，成本低廉等優點，能在自然條件下規模化進行植物轉基因工作，適用于蕃茄和辣椒等易于形成愈傷的雙子葉植物。
文檔編號C12N15/84GK103233041SQ20131016198
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月6日 優先權日2013年5月6日
發明者潘大仁, 符雷, 周以飛, 劉崟艷 申請人:福建農林大學