水母種類鑒別方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，水母種類鑒別方法，首先，提取水母DNA，對水母DNA進行水母16s?RNA數據庫分析；然后，根據16s?RNA同源性分析結果設計水母16s?RNA特異性引物和Taqman探針；接著，以水母DNA為模板、利用特異性引物進行Taqman探針檢測獲得曲線數據；最后，根據擴增結果，確定水母種類。本發明根據水母的DNA確定水母的種類，能夠針對形態上不完整的成體個體以及水母幼體進行種類鑒定。同時本發明根據16s?RNA同原性分析結果設計水母16s?RNA特異性引物，針對性強、準確率高。
【專利說明】水母種類鑒別方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及生物種類鑒別方法。
【背景技術】
[0002]近十幾年，我國沿岸水母大量發生，給海洋生態環境帶來了一定的影響。水母在形態上完整的成體個體在種類的鑒別上比較容易，但形態上不完整的成體個體以及水母幼體的種類鑒別比較困難。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于，提供一種水母種類鑒別方法，以解決上述問題。
[0004]本發明所解決的技術問題可以采用以下技術方案來實現:
[0005]水母種類鑒別方法，其特征在于，首先，利用Clustalx軟件對水母16s RNA數據庫分析；然后，根據16s RNA同源性分析結果,利用primer分析軟件設計水母16s RNA特異性引物和Taqman探針；接著,提取水母DNA,以水母DNA為模板、利用特異性引物進行Taqman探針檢測獲得曲線數據；最后，確定水母種類。本發明根據水母的DNA確定水母的種類，能夠針對形態上不完整的成體個體以及水母幼體進行種類鑒定。同時本發明根據16s RNA同源性分析結果設計水母16s RNA特異性引物和Taqman探針，針對性強、準確率高。
[0006]通過水母DNA提取液提取水母DNA。(利用我們改良后的CTAB法)使用時，直接將100-200g樣本放入水母DNA提取液中，利用水母DNA提取液進行水母DNA提取。現有技術，通常是將采集的樣本進行冷凍保存，本發明將樣本直接保存在提取液中，避免了之后的操作，達到了省時省力的作用。
[0007]使用real time PCR儀采用實時熒光定量PCR技術對水母DNA進行檢測，確定水母種類。本發明采用上述技術方案，既可節省人力物力，又可簡化生產步驟。real time PCR(又叫實時定量PCR)是指在PCR指數擴增期間通過連續監測熒光信號變化來即時測定特異性產物，不需要取出PCR產物進行分離。實時熒光定量PCR技術不僅實現了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度聞等特點。
[0008]在實驗操作過程中所使用的器具均經消毒處理。所使用的試劑均為DNase free級，以避免水母DNA降解。
[0009]由于水母的98%為水分，不及時處理極易降解。因此，水母樣本采集、水母DNA提取間隔在半小時以內最佳。
[0010]本方法可針對沙海蜇、海月水母、澳洲斑點水母、海蜇進行種類鑒別。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為本發明的流程圖；
[0012]圖2為沙海蜇樣本檢測的結果圖；[0013]圖3為海月水母樣本檢測的結果圖；
[0014]圖4為澳洲斑點樣本檢測的結果圖；
[0015]圖5為海蜇樣本檢測的結果圖。
【具體實施方式】
[0016]為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體圖示進一步闡述本發明。
[0017]參照圖1、圖2、圖3、圖4和圖5。水母種類鑒別方法，首先，提取水母DNA，對水母DNA進行水母16s RNA數據庫分析；然后,根據16s RNA同原性分析結果設計水母16s RNA特異性引物；接著，以水母DNA為模板、利用特異性引物進行Taqman探針檢測獲得擴增曲線；最后，根據擴增結果確定水母種類。本發明根據水母的DNA確定水母的種類，能夠針對形態上不完整的成體個體以及水母幼體進行種類鑒定。同時本發明根據16s RNA同源性分析結果設計水母16s RNA特異性引物Taqman探針，針對性強、準確率高。
[0018]通過水母DNA提取液提取水母DNA。(我們改良后的CTAB法)使用時，直接將100-200g樣本放入水母DNA提取液中，利用水母DNA提取液進行水母DNA提取。現有技術，通常是將采集的樣本進行冷凍保存，本發明將樣本直接保存在提取液中，避免了之后的操作，達到了省時省力的作用。
[0019]上述操作步驟中，部分操作步驟對操作順序要求不高，也可同步進行。作為一種優選方案，圖1中先進行水母樣品采集、再進行水母DNA提取，在此同時進行水母信息采集，設計特異性引物和Taqman探針，最后以水母DNA為模板、利用特異性引物進行Taqman探針檢測。
[0020]使用real time PCR儀采用實時熒光定量PCR技術對水母DNA進行檢測，確定水母種類。本發明采用上述技術方案，既可節省人力物力，又可簡化生產步驟。real time PCR(又叫實時定量PCR)是指在PCR指數擴增期間通過連續監測熒光信號變化來即時測定特異性產物，不需要取出PCR產物進行分離。實時熒光定量PCR技術不僅實現了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度聞等特點。
[0021]在實驗操作過程中所使用的器具均經消毒處理。所使用的試劑均為DNase free級，以避免水母DNA降解。
[0022]由于水母的98%為水分，不及時處理極易降解。因此，水母樣本采集、水母DNA提取間隔在半小時以內最佳。本方法可針對沙海蜇、海月水母、澳洲斑點水母、海蜇進行種類鑒別。圖2、圖3、圖4和圖5中A、B為沙海蜇；C、D為海月水母；E、F為澳洲斑點水母；G、H為海蜇。
[0023]以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
【權利要求】
1.水母種類鑒別方法，其特征在于，首先，提取水母DNA，對水母DNA進行水母16sRNA數據庫分析；然后，根據16s RNA同原性分析結果設計水母16s RNA特異性引物和Taqman探針；接著，以水母DNA為模板、利用特異性引物進行Taqman探針檢測獲得曲線數據；最后，根據擴增結果，確定水母種類。
2.根據權利要求1所述的水母種類鑒別方法，其特征在于:通過水母DNA提取液提取水母DNA。(我們改良后的CTAB法)。
3.根據權利要求2所述的水母種類鑒別方法，其特征在于:使用時，直接將100-200g樣本放入水母DNA提取液中，利用水母DNA提取液進行水母DNA提取。
4.根據權利要求1所述的水母種類鑒別方法，其特征在于:使用realtime PCR儀采用實時熒光定量PCR技術對水母DNA進行檢測，確定水母種類。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的水母種類鑒別方法，其特征在于:本方法可針對沙海蜇、海月水母、澳 洲斑點水母、海蜇進行種類鑒別。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540656SQ201310221007
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年6月4日 優先權日:2013年6月4日
【發明者】曲憲成 申請人:曲憲成