利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法
【專利摘要】本發明涉及一種生物工程技術，具體地說是一種利用基因重組病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法：重組慢病毒載體構建；神經干細胞的分離、培養及鑒定；重組病毒轉染NSCs；重組慢病毒轉染NSCs的鑒定；重組病毒轉染NSCs：取傳代3次后的NSCs消化制備成單細胞懸液，接種至培養板中；轉染TH+Brn4基因重組慢病毒；加入慢病毒和ploybrene，搖晃混勻后將培養板置培養箱中培養，12小時后更換新鮮分化培養基；同時用嘌呤霉素進行篩選，以獲得穩定轉染的細胞；本發明的優點在于：通過構建目的基因TH和Brn4的慢病毒載體，轉染NSCs后外源性基因能在細胞內穩定表達；分化后產生高比例的TH陽性多巴胺能神經元；Brn4能促進神經營養因子的高表達，且具有抑制細胞凋亡的功能。
【專利說明】利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的
方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法。【背景技術】
[0002]帕金森病(Parkinson’ s Disease, PD)是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，其基本病理改變是特異性的中腦黑質多巴胺能神經元因各種原因漸行性退變壞死，數量減少，致使紋狀體內多巴胺神經遞質釋放減少，從而產生震顫、肌肉強直等一系列運動障礙癥狀。
[0003]傳統的藥物治療和外科治療僅限于改善癥狀，但并不能阻止病情發展，不能從根本上解決問題。由于此病變主要侵犯中腦黑質多巴胺能神經元，且黑質多巴胺能神經元投射的靶區紋狀體定位明確，所以在黑質-紋狀體系統內移植能夠分泌多巴胺的細胞，恢復多巴胺的神經環路是一個針對病因治療的理想方法。
[0004]近三十年來，ro的腦內移植研究取得了較大的進展，有許多ro患者接受了流產胎兒中腦組織的移植，移植組織中的多巴胺神經元能夠長期存活，并不斷釋放多巴胺，使病人的運動癥狀得以明顯改善。這表明細胞移植替代治療是治療ro較有希望的方法。但因胚腦移植物來源有限、異體免疫排斥及倫理等問題，胚腦組織移植在實際應用中受到很大限制。
[0005]神經干細胞(Neural stem cells,NSCs)是當前國際上研究的熱點之一,它不僅存在于胚胎腦組織中，在成年腦內也已被發現。NSCs不僅具有分裂增殖和自我更新的能力，還具有多分化潛能，可以分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等神經系統多種類型的細胞，包括多巴胺能神經元。因此，NSCs作為細胞移植替代治療的供體細胞治療ro等神經系統退行性疾病具有巨大的潛力和優越性。然而，研究表明體外培養的NSCs —般情況下大多分化為膠質細胞，很少分化為神經元，特別是特異性的多巴胺能神經元，這給臨床應用NSCs移植治療ro造成了極大的障礙。同時，目前的研究表明單獨NSCs移植后細胞存活率只有5% -10%，且不能有效地遷移分化并整合到宿主的神經環路中，從而不能很好的釋放神經遞質發揮生理功能。
[0006]所以探討誘導NSCs分化為多巴胺神經元的方法以及促進移植的細胞在體內存活，較長時間地分泌多巴胺是NSCs移植治療ro研究中迫切需要解決的問題。
[0007]酪氨酸輕化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)是細胞內酪氨酸合成多巴胺過程中的限速酶，通常作為多 巴胺能神經元的特異性標志，其表達情況是NSCs能否轉化為多巴胺能神經元的關鍵。研究發現，腦內TH含量與中腦多巴胺含量呈線性正相關，H)患者腦內TH及TH mRNA的水平明顯低于正常人，提示補充腦內TH基因可促進多巴胺的生物合成。將人或鼠TH基因作為目的基因轉入多種細胞的體內和體外實驗證明，經TH遺傳改造的細胞具有分泌多巴胺的能力。因此，設法提高NSCs的TH活性，促進多巴胺的生成和釋放是NSCs移植聯合轉基因治療H)的新方法。
[0008]Brn-4是轉錄因子POU蛋白家族第三類成員之一。許多資料表明，多種同源盒基因，如HOX、POU、UM、PAX等，編碼的轉錄因子在胚胎發育過程中對神經細胞的分化、遷移和某些組織特異性基因的表達起著重要的調控作用。其中，POU同源盒基因在中樞神經系統發育過程中扮演著重要角色。根據POU區的全部氨基酸序列同源程度，哺乳動物POU蛋白分為Class I~ClassVI共六類，Brn_4和Brn-l、Brn-2、Tst_l同屬于第III類，在胚胎早期Brn-1、Brn-2、Brn-4即在神經系統中出現，且分布廣泛，提示這些因子可能參與早期神經發生。近期在《Nature》上的一篇報道中，將三個轉錄因子Ascll、fcn-2、Mytll導入來自成年大鼠尾部的皮膚細胞，一周后，約有20%的實驗鼠皮膚細胞轉化為神經細胞，這些神經細胞不但可以表達神經蛋白，而且可與其他神經細胞形成突觸聯系，表明POU蛋白家族成員Brn-2在神經發育中的關鍵作用。可見，POU蛋白家族的第III類因子對NSCs分化命運可能起著決定性的作用。Le Moine等的研究還發現，阻斷成年哺乳動物黑質向紋狀體的多巴胺能神經投射，會引起紋狀體內Brn-4表達上調。表明Brn_4可能和成年哺乳動物去多巴胺能神經支配后紋狀體內的神經再生與修復有關。
[0009]前期研究中，通過切割大鼠穹窿海馬傘阻斷自隔區向海馬投射的膽堿能神經纖維建立去神經支配海馬模型，將NSCs移植到海馬內，植入的NSCs在去神經支配的海馬內更容易存活，并且更多地分化為神經元，同時，存在于齒狀回的內源性NSCs在去神經支配損傷刺激下也出現明顯增生、遷移和神經元分化。上述結果表明，去神經支配損傷后，海馬內局部微環境的改變為NSCs的存活、再生和向神經元分化提供了良好的條件。我們進一步利用原位雜交、RT-PCR、免疫組織化學和Western blot等多種方法檢測發現，Brn_4的轉錄和表達水平在去神經支配的海馬內均明顯上調。在獲得的去神經支配海馬提取液中加入過量的Brn-4抗體中和其中的Brn_4，再與NSCs共培養，結果發現，抗體中和后，去神經支配海馬提取液促進神經元分化的效應顯著減弱。利用RNA干擾技術將針對Brn-4的小RNA片段轉入NSCs中，下調細胞內Brn-4的水平，結果NSCs分化為神經元的比例明顯下降。相反，過表達Brn-4的NSCs分化為神經元的比例明顯升高，而且新生神經元的成熟度明顯增加。這些結果說明Brn-4在NSCs向神經元分化成熟過程中起著十分重要的作用。進一步研究還發現，轉染Brn-4基 因的NSCs在體外分化7天后,Western blot檢測發現凋亡相關蛋白Caspase-3的表達明顯低于對照組,提示Brn_4可能具有抑制細胞凋亡的作用。Shimazaki等的研究發現，在體外用腦源性神經生長因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和胰島素樣生長因子-1 (Insulinlike growth factor-1, IGF-1)刺激來源于小鼠胚胎紋狀體的NSCs分化過程中，Brn-4表達迅速上調，且Brn_4蛋白主要表達于新生的神經元內；應用反義寡核苷酸技術阻斷Brn-4的功能，NSCs分化為成熟神經元的比例則下降。說明Brn-4可能通過一些神經營養因子的介導來調控NSCs向神經元的分化及其成熟。然而，Brn-4促進NSCs向成熟神經元分化并且維持移植細胞存活的分子機制在國內、外沒有研究。如果能通過TH和Brn-4基因有效地誘導NSCs向成熟的多巴胺能神經元分化，并且通過Brn-4維持移植后細胞的存活，使之長時間地分泌多巴胺，糾正H)的病理和生化異常，改善臨床癥狀，這將為多基因聯合NSCs移植治療H)提供新的方法和實驗依據。
【發明內容】
[0010]本發明的目的是克服現有技術中的不足之處，提供一種利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法。[0011]為了實現本發明的目的，我們將采用如下技術方案予以實施:
[0012]利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法，所述的方法包括如下實施步驟:
[0013]一、pLV5-TH+Brn4重組慢病毒載體構建:
[0014]根據pLV5-EFla-GFP慢病毒表達載體的要求和GenBank大鼠TH和Brn4的cDNA功能全長序列分別為ΝΜ_012740和ΝΜ_017252的基因，合成目的基因并構建pLV5_TH、pLV5-Brn4和pLV5_TH+Brn4慢病毒表達載體，包裝滴度后進行測序鑒定和滴度鑒定；
[0015]二、神經干細胞的分離、培養及鑒定:
[0016]神經干細胞的培養方法:在無菌條件下取孕14d的SD胎鼠腹側中腦組織，用吸管反復吹打直至為細胞懸液，并經200目尼龍網過濾，收集過濾后的細胞懸液，用基礎培養基清洗3遍后重懸于NSCs培養液中，經細胞計數和活力觀察后，按IX 105/ml細胞密度接種于含有IOml NSCs培養液的細胞培養瓶中，置于5%、37°C的C02培養箱中培養，3天后可見培養瓶內形成懸浮的NSCs球，7天后進行傳代培養；
[0017]神經干細胞的分離方法:神經干細胞在培養瓶中培養3天后，用低速離心收集NSCs球，清洗3遍后用Accutase酶進行消化，約IOmin鐘后用含10% FBS的基礎培養液終止消化，通過機械吹打的方式使其分散成單細胞懸液，進行細胞計數后培養瓶中繼續培養;
[0018]神經干細胞的鑒定方法:取P3代NSCs在傳代時培養液中加入終濃度為5 μ mol/L的BrdU進行標記,使BrdU整合到神經干細胞DNA中，7天后進行BrdU免疫突光檢測；另取P3代以后的NSCs亞克隆球用Nestin免疫熒光檢測證明其胚胎源性；將PlO代NSCs球接種于預先置入涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養板中，加入含10% FBS的DMEM/F12分化培養液進行分化，2周后分 別進行MAP_2、GFAP和CNP免疫熒光檢測以證明NSCs的多分化潛能；
[0019]重組慢病毒轉染NSCs的鑒定，包括:
[0020]轉染效率檢測是將轉染后的NSCs球接種至預涂有多聚賴氨酸圓蓋片的24孔板中，加入含2% FBS的DMEM/F12分化培養液，分化培養I周后終止培養，吸去培養液，加入4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗后用Hochest33342染色，在熒光顯微鏡下觀察結果；
[0021]TUNEL法細胞凋亡檢測是將各組NSCs分化培養2W后，吸去各孔中的培養液，用
0.01MPBS清洗3遍，然后用含4%多聚甲醛的0.1PBS室溫下固定20min，吸去多聚甲醛，PBS清洗3遍，用Roche公司TUNEL凋亡檢測試劑盒按操作說明進行細胞凋亡檢測，最后PBS洗片3遍后，在避光條件下，加入Hoechst33342，室溫濕盒孵育30min。PBS洗片3遍后，中性甘油封片；在正置熒光顯微鏡下觀察TUNEL、Hoechst陽性細胞核并攝片；用Statal0.0統計軟件對各組數據進行方差分析和組間比較；
[0022]高效液相色譜法檢測分化培養液中DA含量是將各組取NSCs分化培養液Iml，加入0.lmol/L過氯酸酸化培養液，14000rpm離心15min,取上清過濾后按吳燕瓊等報道的方法行高效液相色譜測定；
[0023]其特征在于:該方法實施步驟還包括:
[0024]三、重組病毒轉染NSCs :
[0025]所述的重組病毒的轉染方法:取P3代NSCs消化制備成單細胞懸液，細胞計數后接種至24孔培養板中，每孔接種4 X 104個細胞，加入500 μ I基礎培養液懸浮細胞；細胞共分4組進行轉染，每組6孔:Mock組轉染pLV5-GFP慢病毒陰性對照；TH組轉染pLV5_TH重組慢病毒；Brn4組轉染pLV5_Brn4重組慢病毒；TH+Brn4組轉染pLV5_TH+Brn4重組慢病毒；每孔加入20 μ 11 X 108TU/ml感染復數為50的慢病毒和5 μ g/ml ploybrene,輕輕搖晃混勻后將培養板置培養箱中培養，12小時后更換新鮮分化培養基；感染72小時后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，同時在培養基中加入I μ g/ml嘌呤霉素進行篩選，以獲得穩定轉染的細胞；7天后對各組形成的NSCs球進行傳代培養；
[0026]四、重組慢病毒轉染NSCs的鑒定。
[0027]利用所述的利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法獲得一種轉染pLV5-TH+Brn4重組慢病毒的神經干細胞:是將所述的方法中所述的實施步驟三中獲得的穩定轉染pLV5-TH+Brn4病毒的NSCs制成單細胞懸液，用基礎培養液將細胞配成2 X 106/ml，加入1.5ml細胞凍存管中，同時加入0.4ml小牛血清和0.1ml 二甲基亞楓，混勻后密封，置4°C 1小時，-200C 2小時，然后直接放入_80°C超低溫冰箱中保存獲得。
[0028]所述的重組慢病毒轉染NSCs的鑒定還包括=Western Blot檢測、免疫熒光細胞化學檢測:
[0029]所述的Western Blot檢測是將各組轉染后的NSCs球接種至24孔板中進行分化，另設一組未轉染的NSCs作為對照組，分化培養2周后終止培養，按RIPA裂解液說明書的要求，提取各組中細胞的蛋白，用10% SDS-PAGE垂直電泳對蛋白進行分離，Bio-Rad半干轉印系統轉膜15V,50min,5%脫脂奶粉封閉后分別加入下列一抗:小鼠抗β-actin抗體、小鼠抗TH抗體、兔抗Brn4抗體、兔抗GDNF抗體、兔抗GFR α -1抗體、兔抗RET抗體，室溫孵育2h，4°C過夜，次日分別加入辣根過氧化物酶結合的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育4h，然后進行曝光、顯影并用所采集圖像，用圖像分析軟件對Western blot結果進行平均光密度分析，并用統計的方法對各組數據進行方差分析和組間比較；
[0030]所述的免疫熒光細胞化學檢測是各組NSCs分化2周后終止培養，對陰性對照組和各重組病毒轉染組中細胞進行免疫熒光檢測，簡述如下:所用一抗分別為:小鼠抗TH、大鼠抗DAT ;二抗為:結合有Alexa Fluor568的山羊抗鼠IgG ;—抗于4°C孵育過夜,二抗室溫下孵育2h，隨后用Hoechst33342進行細胞核染色30min，中間各步驟之間均用0.01M PBS進行常規洗片，最后用20%甘油緩沖液封片，并在FVlOi智能型激光共聚焦顯微鏡下觀察TH或DAT的表達情況，并計算GFP/TH和GFP/DAT雙標細胞占Hoechst標記細胞的百分比，并用統計方法對各組數據進行方差分析和組間比較；
[0031]所述的高效液相色譜法檢測分化培養液中DA含量的色譜條件:色譜柱為4.6 X 250mm,顆粒度5 μ m的Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅膠柱，柱溫40°C，流動相為磷酸鹽緩沖液與甲醇的混合液，流速為l.0ml/min，檢測器為SH)-20A型紫外檢測器，檢測波長280nm ;定性分析:以樣品峰的保留時間與標準品保留時間對照定性；定量分析:先利用DA標準品繪制標準曲線，然后在相同條件下依次進行樣品測定，用外標法定量，以峰面積表不含量。
[0032]所述的磷酸鹽緩沖液是由磷酸二氫鉀6.742g，磷酸氫二鉀0.0114g，加水定溶至1000ml，用磷酸調節pH值至4.2，并用0.12 μ m纖維素脂膜過濾獲得的。
[0033]所述的流動相為磷酸鹽緩沖液與甲醇的混合液，其比例為97: 3。[0034]所述的NSCs 培養液由 DMEM/F12、2% B27、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF 組成。
[0035]所述的慢病毒的感染復數為50。
[0036]有益效果
[0037]—、我們從鼠胚中腦組織中分離得到的細胞具有不斷增殖和自我更新能力，并具有分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的多分化潛能，是中樞神經系統的干細胞；
[0038]二、成功構建帶有目的基因TH和Brn4的慢病毒載體，轉染NSCs后外源性基因能在細胞內穩定表達，得到大鼠NSCs-TH+Brn4細胞株；
[0039]NSCs-TH+Brn4在體外分化后能產生較高比例的TH陽性多巴胺能神經元，且這些神經元在形態、表型和功能上均較為成熟。Brn4能促進神經營養因子GDNF及其受體GFRa-1和Ret的高表達，同時還具有抑制細胞凋亡的功能，這些對于多巴胺神經元的分化、成熟以及維持其存活可能起到了重要的作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1為慢病毒載體的構建及慢病毒包裝試驗結果圖；
[0041]圖2為NSCs的培養、分離及鑒定結果圖；
[0042]圖3為重組病毒轉染NSCs的效率檢測結果圖；
[0043]圖4為Western blot檢測結果圖；
[0044]圖5為免疫突光檢測結果圖；
[0045]圖6為細胞凋亡檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0046]結合附圖，對本發明做進一步地說明:
[0047]第一部分體外實驗
[0048]轉染重組慢病毒的神經干細胞的制備和該神經干細胞的鑒定
[0049]實驗材料
[0050]1.1、實驗動物
[0051]孕14d Sprague-Dawley (SD)大鼠,清潔級，由南通大學實驗動物中心提供,生產許可證號:SCXK (蘇)2002-0019。
[0052]1.2實驗儀器
[0053](I) SF1D-2OA型紫外檢測器(日本Shimadzu公司)；
[0054]⑵⑶2培養箱(法國Jouan公司)；
[0055](3)超凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術有限公司)；
[0056](4)低溫冷凍離心機(德國Beckman公司)；
[0057](5) Leica DMR正置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；
[0058](6) Leica DMIRB倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；
[0059](7)超低溫冰箱(美國Nuaire公司)；
[0060](8) SDS-PAGE電泳槽及轉膜裝置(Bio-Rad公司)；
[0061](9) LeicaQwin 圖像分析系統(Leica 公司)；[0062](IO)Molecular Imager ChemiDoc XRS System 米集圖像(Bio-Rad 公司)；
[0063](Il)FVlOi智能型激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司)；
[0064](12) TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche公司)；
[0065](13)細胞培養瓶(BD公司)；
[0066](14)200目尼龍網(BD公司)；
[0067](15)細胞凍存管(BD公司)；
[0068](16)纖維素脂膜(BD公司)；
[0069](17) Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅膠柱(Shimadzu公司);
[0070](18) Quantity One 圖像分析軟件(Bio-Rad 公司)。
[0071]1.3實驗試劑
[0072]1.3.1慢病毒構建試劑
[0073](I) pLV5_EFla_GFP 慢病毒(Genepharma 公司)；
[0074](2)限制性核酸內切酶BamHI (MBI)；
[0075](3)限制性核酸內切酶NotI (MBI)；
·[0076](4) T4DNA Ligase (NEB 公司);
[0077](5) DNA純化試劑盒(Axygen公司);
[0078](6) DH5 α 感受態細胞(TransGen Biotech 公司)；
[0079](7)氨節抗生素溶液(Invitrogen公司)；
[0080](8)包裝質粒 Packaging Mix (Genepharma 公司)；
[0081](9)293FT 細胞(Invitrogen 公司)；
[0082](10) DMEM+10% FBS (Invitrogen 公司)；
[0083](11) Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司)；
[0084](12) Opt1-ΜΕΜ 培養液(Invitrogen 公司)；
[0085](13)0.05% Trypsin(Invitrogen 公司)。
[0086]1.3.2細胞培養主要試劑
[0087](I)DMEM 培養基(Dulbecco’ s Modified EagleMedium,Cat.N0.12100-038，Gibco公司)；
[0088](2)F12 培養基(F12Nutrient Mixture, Cat.N0.21700-026，Gibco 公司)；
[0089](3)無血清培養添加劑 B27 (B27Supplement, Cat.N0.17504-044, Gibco 公司);
[0090](4)胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS, Cat.N0.16140-087, Gibco 公司)；
[0091](5)表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF, Cat.N0.E4127, Sigma 公司)；
[0092](6)喊性成纖維細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor-Basic, bFGF, Cat.N0.F0291, Sigma 公司);
[0093](7)細胞消化液 Accutase (Sigma 公司);
[0094](8) BrdU (5-Bromo-2-deoxyUridine，sigma 公司)；
[0095](9) RIPA 裂解液(碧云天，P0013B)；
[0096](10) 二甲基亞楓(dimethyl sulfoxide, sigma 公司)。
[0097](11)嘌呤霉素(puromycm, sigma 公司)。
[0098]1.3.3主要抗體[0099](I)小鼠抗 TH(1: 200，Millipore 公司)；
[0100](2)大鼠抗 DAT(1: 5000，Millipore 公司)；
[0101](3)結合有 Alexa Fluor568 的山羊抗鼠 IgG(l: 500, Invitrogen 公司);
[0102](4)小鼠抗 β-actin 抗體(1: 2000, Sigma 公司)；
[0103](5)小鼠抗 TH 抗體(I: 200，Millipore 公司)；
[0104](6)兔抗 Bm4 抗體(1: 1000, Santa Cruz 公司);
[0105](7)兔抗 GDNF 抗體(I: 200，Abcam 公司)；
[0106](8)兔抗 GFRa-1 抗體(I: 5OO, Abcam 公司)；
[0107](9)兔抗 RET 抗體(I: 5000，Abcam 公司)；
[0108](10)辣根過氧化物酶結合的羊抗小鼠IgG(l: 1000，Pierce公司)；
[0109](11)羊抗兔 IgG(l: 1000，Pierce 公司)；
[0110](12) Hoechst33342 (1: 2000，sigma 公司)。
[0111]1.4實驗方法
[0112]一、重組慢病毒載體構建
[0113](I)目的基因獲取
[0114]I)引物設計
[0115]根據Genepharma公司pLV5_EFla_GFP慢病毒表達載體的要求和GenBank大鼠TH(NM_012740)和Bm4 (NM_017252)的cDNA功能全長序列設計合成PCR引物，上游引物5’端加BamHI位點序列，下游引物5’端加NotI位點序列，引物序列ΤΗ-1F、TH-1R、Brn4_lF、Brn4_lR、TH+Brn4、TH+Brn4 如序列表:
[0116]2)擴增目的基因片段并且膠回收
[0117](I) PCR 體系如下:
[0118]
【權利要求】
1.利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法，所述的方法包括如下實施步驟: 一、pLV5-TH+Brn4重組慢病毒載體構建: 根據pLV5-EFla-GFP慢病毒表達載體的要求和GenBank大鼠TH和Brn4的cDNA功能全長序列分別為 NM_012740 和 NM_017252 的基因，構建 pLV5-TH、pLV5_Brn4 和 pLV5_TH+Brn4慢病毒表達載體，包裝滴度后進行測序鑒定和滴度鑒定； 二、神經干細胞的分離、培養及鑒定: 神經干細胞的培養方法:在無菌條件下取孕14d的SD胎鼠腹側中腦組織，用吸管反復吹打直至為細胞懸液，并經200目尼龍網過濾，收集過濾后的細胞懸液，用基礎培養基清洗3遍后重懸于NSCs培養液中，經細胞計數和活力觀察后，按I X 105/ml細胞密度接種于含有IOml NSCs培養液的細胞培養瓶中，置于5%、37°C的C02培養箱中培養，3天后可見培養瓶內形成懸浮的NSCs球，7天后進行傳代培養； 神經干細胞的分離方法:神經干細胞在培養瓶中培養3天后，用低速離心收集NSCs球，清洗3遍后用Accutase酶進行消化，約IOmin鐘后用含10% FBS的基礎培養液終止消化，通過機械吹打的方式使其分散成單細胞懸液，進行細胞計數后培養瓶中繼續培養； 神經干細胞的鑒定方法:取P3代NSCs在傳代時培養液中加入終濃度為5 μ mol/L的BrdU進行標記，使BrdU整合到神經干細胞DNA中，7天后進行BrdU免疫熒光檢測；另取P3代以后的NSCs亞克隆球用Nestin免疫熒光檢測證明其胚胎源性；將PlO代NSCs球接種于預先置入涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養板中，加入含10% FBS的DMEM/F12分化培養液進行分化，2周后分別進行MAP_2、GFAP和CNP免疫熒光檢測以證明NSCs的多分化潛能； 四、重組慢病毒轉染NSCs的鑒定，包括: 轉染效率檢測是將轉染后的NSCs球接種至預涂有多聚賴氨酸圓蓋片的24孔板中，加入含2% FBS的DMEM/F12分化培養液，分化培養I周后終止培養，吸去培養液，加入4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗后用Hochest33342染色，在熒光顯微鏡下觀察結果； TUNEL法細胞凋亡檢測是將各組NSCs分化培養2W后，吸去各孔中的培養液，用0.01MPBS清洗3遍，然后用含4%多聚甲醛的0.1PBS室溫下固定20min，吸去多聚甲醛，PBS清洗3遍，用TUNEL凋亡檢測試劑盒按操作說明進行細胞凋亡檢測，最后PBS洗片3遍后，在避光條件下，加入H0echst33342，室溫濕盒孵育30min，PBS洗片3遍后，中性甘油封片；在正置熒光顯微鏡下觀察TUNEUHoechst陽性細胞核并攝片；用統計方法對各組數據進行方差分析和組間比較； 高效液相色譜法檢測分化培養液中DA含量是將各組取NSCs分化培養液1ml，加入`0.lmol/L過氯酸酸化培養液，14000rpm離心15min,取上清過濾后按吳燕瓊等報道的方法行高效液相色譜測定； 其特征在于:該方法實施步驟還包括: 三、重組病毒轉染NSCs: 所述的重組病毒的轉染方法:取P3代NSCs消化制備成單細胞懸液，細胞計數后接種至24孔培養板中，每孔接種4 X IO4個細胞，加入500 μ I基礎培養液懸浮細胞；細胞共分4組進行轉染，每組6孔:Mock組轉染pLV5-GFP慢病毒陰性對照；TH組轉染pLV5_TH重組慢病毒；Brn4組轉染pLV5_Brn4重組慢病毒；TH+Brn4組轉染pLV5_TH+Brn4重組慢病毒；每孔加入20 μ IlX 108TU/ml的慢病毒和5 μ g/ml ploybrene,輕輕搖晃混勻后將培養板置培養箱中培養，12小時后更換新鮮分化培養基；感染72小時后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，同時在培養基中加入I μ g/ml嘌呤霉素進行篩選，以獲得穩定轉染的細胞；7天后對各組形成的NSCs球進行傳代培養。
2.利用權利要求1所述的利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法獲得一種轉染PLV5-TH+Brn4重組慢病毒的神經干細胞，其特征在于:是將權利要求1中所述的實施步驟三中獲得的穩定轉染pLV5-TH+Brn4病毒的NSCs制成單細胞懸液，用基礎培養液將細胞配成2X 106/ml，加入1.5ml細胞凍存管中，同時加入0.4ml小牛血清和0.1ml 二甲基亞楓，混勻后密封，置4°C I小時，_20°C 2小時，然后直接放入_80°C超低溫冰箱中保存獲得。
3.根據權利要求1所述的利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法，其特征在于:所述的重組慢病毒轉染NSCs的鑒定還包括=Western Blot檢測、免疫熒光細胞化學檢測。 所述的Western Blot檢測是將各組轉染后的NSCs球接種至24孔板中進行分化，另設一組未轉染的NSCs作為對照組，分化培養2周后終止培養，按RIPA裂解液說明書的要求，提取各組中細胞的蛋白，用10% SDS-PAGE垂直電泳對蛋白進行分離，Bio-Rad半干轉印系統轉膜15V, 50min, 5%脫脂奶粉封閉后分別加入下列一抗:小鼠抗β-actin抗體、小鼠抗TH抗體、兔抗Brn4抗體、兔抗⑶NF抗體、兔抗GFRa-1抗體、兔抗RET抗體，室溫孵育2h，4°C過夜，次日分別加入辣根過氧化物酶結合的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育4h，然后進行曝光、顯影并用所采集圖像，用圖像分析軟件對Western blot結果進行平均光密度分析，并用統計的方法對各組數據進行方差分析和組間比較； 所述的免疫熒光細胞化學檢測是各組NSCs分化2周后終止培養，對陰性對照組和各重組病毒轉染組中細胞進行 免疫熒光檢測，簡述如下:所用一抗分別為:小鼠抗TH、大鼠抗DAT ;二抗為:結合有Alexa Fluor568的山羊抗鼠IgG ;—抗于4°C孵育過夜，二抗室溫下孵育2h，隨后用Hoechst33342進行細胞核染色30min，中間各步驟之間均用0.01M PBS進行常規洗片，最后用20%甘油緩沖液封片，并在FVlOi智能型激光共聚焦顯微鏡下觀察TH或DAT的表達情況，并計算GFP/TH和GFP/DAT雙標細胞占Hoechst標記細胞的百分比，并用統計方法對各組數據進行方差分析和組間比較。
4.根據權利要求1所述的利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法，其特征在于:所述的高效液相色譜法檢測分化培養液中DA含量的色譜條件:色譜柱為4.6 X 250mm，顆粒度5μπι的Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅膠柱，柱溫40°C，流動相為磷酸鹽緩沖液與甲醇的混合液，流速為l.0ml/min，檢測器為SH)-20A型紫外檢測器，檢測波長280nm ;定性分析:以樣品峰的保留時間與標準品保留時間對照定性；定量分析:先利用DA標準品繪制標準曲線，然后在相同條件下依次進行樣品測定，用外標法定量，以峰面積表不含量。
5.根據權利要求4所述的利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法，其特征在于:所述的流動相為磷酸鹽緩沖液與甲醇的混合液，其比例為97: 3。
6.根據權利要求1所述的 利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的方法，其特征在于:所述的NSCs培養液由DMEM/F12、2% B27、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF組成。
7.根據權利要求1所述的利用重組慢病毒誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化的 方法，其特征在于:所述的慢`病毒的感染復數為50。
【文檔編號】C12N5/10GK103865956SQ201310229277
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年6月9日 優先權日:2013年6月9日
【發明者】譚雪鋒 申請人:南通大學