一種rna片段及其制備方法和用途

一種rna片段及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種制備RNA片段的方法，該方法包括：（1）獲得化學合成的雙鏈DNA；（2）將所述化學合成的雙鏈DNA片段克隆至載體中以得到多個克隆的擴增質粒，并分別對多個克隆的擴增質粒進行DNA測序；挑選能夠完全正確編碼目的RNA片段的擴增質粒的克隆作為模板質粒；（3）對模板質粒進行酶切，得到酶切產物，并從酶切產物中分離能夠完全正確編碼目的RNA片段的轉錄模板片段；（4）對所述轉錄模板片段進行體外轉錄，得到轉錄產物。本發明還提供了如上所述的方法制備得到的RNA片段及其用途。本發明大幅度地提高了制備的RNA片段在序列和長度上的完全正確性和均一度。
【專利說明】一種RNA片段及其制備方法和用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥生物領域，具體地，涉及分子生物【技術領域】，更具體地，涉及一種 制備RNA片段的方法、該方法制備得到的RNA片段以及該RNA片段的用途。

【背景技術】
[0002] 最近十幾年小的非編碼 RNA(small non-coding RNAs)，尤其是微 RNA(microRNA， 即miRNA)的研究非常火熱，技術人員非常看好以微RNA作為靶點來研發診斷試劑盒和研發 小核酸藥物的前景（Jackson and Levin, 2012;van Rooij et al·，2012)。由于微RNA通常 只有18-30個堿基（Bartel, 2004)，而且一個家族的不同微RNA成員可能只有1-2個堿基的 差異（WWW. mirbase.com)，因此用雜交方法來檢測微RNA時，對探針的純度要求高。如果探 針有堿基突變的話，會導致檢測結果為假陰性或假陽性（Barad et al.，2004)。
[0003] 現有的生產微RNA探針的方法有兩種：一種是通過化學合成與微RNA互補的 RNA鏈，然后通過末端轉移酶把一個帶DIG或其它標記物的核苷酸加在RNA鏈的末端， 從而使探針被標記好，以便于后續的檢測，這類探針在早期發表的微RNA文獻中大量使 用（Chen，2004)。第二種方法是在化學合成與微RNA互補的DNA探針時，把RNA核苷酸 類似物鎖核酸（locked nucleic Acid, LNA)參入探針中，得到鎖核酸修飾的DNA探針 (LNA-modified DNA probes,如Exiqon公司生產的產品)，然后再通過末端標記使探針的一 端或兩端都帶上DIG或其它的標記物。現在，這種LNA修飾的DNA探針被大量應用于檢測 微RNA的研究中。
[0004] 上述兩種方法的缺點有三：第一，RNA或DNA的化學合成都是從核酸的3'向5'端 逐漸加上單個的堿基，因為每次合成一個堿基時效率都達不到l〇〇%(Reese，2005)，所以無 論是化學合成的RNA還是DNA，都有一定的錯誤率，且錯誤率隨合成的核苷酸長度的增加而 增加。雖然合成后的純化(常用HPLC或PAGE純化）能幫助富集預期目的大小的核苷酸，但 無法減少擁有同樣大小的序列突變的雜質核苷酸。第二，其標記探針的方法都是在探針的 一端或兩端加上帶標記的一個堿基，這使得探針的序列比要檢測的微RNA序列多1或2個 堿基，這會影響探針的特異性。第三，因為探針最多只攜帶兩個標記物，所以檢測的靈敏度 有限，無法檢測那些低豐度表達的微RNA。
[0005] 已經公開了用T7RNA聚合酶（T7RNA polymerase)以體外轉錄的方式制備短RNA的 方法（Milligan et al.，1987)，具體地，該方法使用了如下3種模板：（1)化學合成的完全 雙鏈DNA，其編碼鏈由T7啟動子和RNA片段的DNA模板連接而成；（2)酶切線性化的質粒雙 鏈DNA，其編碼鏈由線性載體片段、T7啟動子和目的RNA片段的編碼DNA連接而成；（3)化 學合成的由雙鏈區和單鏈區連接而成的DNA，雙鏈區為完全雙鏈的T7啟動子，單鏈區為RNA 探針的DNA模板。用該方法制備短RNA探針，會存在下列問題：（1)化學合成的模板會引入 和擴增DNA合成時的突變，從而降低了探針的純度和特異性；（2)以酶切線性化的質粒雙鏈 DNA為模板的方法，雖然保證了模板的完全正確性，但由于該方法使用的是一型限制性內切 酶，所以線性化的模板在編碼RNA的序列后面銜接著酶切位點的殘余序列，使得轉錄出來 的RNA比目的RNA片段多幾個堿基，也降低了探針的特異性。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是克服現有的RNA探針的特異性較低和靈敏度較差的缺陷，提供一 種特異性較高且靈敏度較好的RNA片段及其制備方法。
[0007] 為了實現上述目的，一方面，本發明提供了一種制備RNA片段的方法，該方法包 括：（1)獲得化學合成的雙鏈DNA，所述化學合成的雙鏈DNA由編碼鏈和模板鏈配對而成； 在從所述編碼鏈的5'至3'方向上，第一內切酶的酶切位點、啟動子、目的RNA片段的編碼 DNA和第二內切酶的酶切位點依次連接；（2)將所述化學合成的雙鏈DNA片段克隆至載體 中以得到多個克隆的擴增質粒，并分別對多個克隆的擴增質粒進行DNA測序；挑選能夠完 全正確編碼目的RNA片段的擴增質粒的克隆作為模板質粒；（3)使用第一內切酶和第二內 切酶對模板質粒進行酶切，得到酶切產物，并從酶切產物中分離能夠完全正確編碼目的RNA 片段的轉錄模板片段；其中，第二內切酶能夠在目的RNA片段的DNA模板鏈的5'末端切開， 以使轉錄模板片段的模板鏈的5'末端能夠與目的RNA片段的3'末端形成平末端的雙鏈； (4)對所述轉錄模板片段進行體外轉錄，得到含有目的RNA片段的轉錄產物。
[0008] 另一方面，本發明還提供了一種RNA片段，該RNA片段是根據如上所述的方法制備 得到的。
[0009] 再一方面，本發明還提供了 RNA片段在制備核酸藥物、檢測試劑盒或診斷試劑盒 中的用途。
[0010] 通過上述技術方案，本發明大幅度地提高了制備RNA片段在序列和長度上的完全 正確性和均一度，由此提高了 RNA探針的特異性和靈敏度。
[0011] 本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中：
[0013] 圖1舉例性地顯示了本發明的制備RNA片段的策略。
[0014] 圖2顯示了轉錄模板片段T1 (泳道1)、轉錄產物R1 (泳道2)、轉錄產物R1-DB1 (泳道4)、轉錄模板片段T2 (泳道6)和轉錄產物R2 (泳道7)的電泳結果，泳道3、5和8分 別為分子量標記。
[0015] 圖3顯示了來源于同一個小鼠胚胎的發育13. 5天的冠狀切片標本（A，B)和發育 11.5天的矢狀切片標本（C，D)。同時用本發明生產的miR-96RNA探針（B，D)或購自Exiqon 公司的靶向miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號38474-05)(A，C)雜交 顯色3個小時后，本發明生產的miR-96RNA探針檢測到的信號（B，D)明顯強于購自Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號 38474-05) (A，C)。
[0016] 圖4顯示了來源于同一個小鼠胚胎的發育13. 5天的冠狀切片標本（A，B)和發育 11.5天的矢狀切片標本（C，D)。同時用本發明生產的miR-96RNA探針（A，C)或購自Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號 38474-05) (B，D)雜 交后，本發明生產的miR-96RNA探針在顯色12個小時后檢測到的信號非常強（A，C);相反， 購自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探針（B，D)在顯色72個小時檢測到的信號還是很弱。 這說明本發明生產的miR-96RNA探針比購自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號 38474-05)更加靈敏。
[0017] 圖5顯示了在胚胎發育11. 5天的小鼠胚胎矢狀切片的背根神經節中，本發明生產 的miR-96RNA探針在顯色12個小時后檢測到miR-96特異地高表達(A);相反，購自Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號 38474-05)在顯色 72 個小時后檢測到的信號還是很微弱，與背景差別不大（B)。
[0018] 圖6顯示了在胚胎發育13. 5天的小鼠胚胎冠狀切片的背根神經節中，本發明生 產的miR-96RNA探針在顯色12個小時后檢測到miR-96的信號非常強、而且非常特異（A); 相反，購自Exiqon公司的祀向miRNA-96的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號 38474-05)在顯色72個小時后檢測到miR-96的信號還是非常弱，與背景難以區分（B)。

【具體實施方式】
[0019] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0020] 本發明提供了一種制備RNA片段的方法，該方法包括：（1)獲得化學合成的雙鏈 DNA，所述化學合成的雙鏈DNA由編碼鏈和模板鏈配對而成；在從所述編碼鏈的5'至3'方 向上，第一內切酶的酶切位點、啟動子、目的RNA片段的編碼DNA和第二內切酶的酶切位點 依次連接；（2)將所述化學合成的雙鏈DNA片段克隆至載體中以得到多個克隆的擴增質粒， 并分別對多個克隆的擴增質粒進行DNA測序；挑選能夠完全正確編碼目的RNA片段的擴增 質粒的克隆作為模板質粒；（3)使用第一內切酶和第二內切酶對模板質粒進行酶切，得到 酶切產物，并從酶切產物中分離能夠完全正確編碼目的RNA片段的轉錄模板片段；其中，第 二內切酶能夠在目的RNA片段的DNA模板鏈的5'末端切開，以使轉錄模板片段的模板鏈的 5'末端能夠與目的RNA片段的3'末端形成平末端的雙鏈；（4)對所述轉錄模板片段進行體 外轉錄，得到含有目的RNA片段的轉錄產物。
[0021] 其中，需要制備的RNA片段即為目的RNA片段；目的RNA的長度沒有特別的要 求，可以為常規的作為探針和/或核酸藥物的RNA片段的長度，例如為5-200bp，優選為 8-100bp，更優選為10-50bp，特別優選為15-30bp。目的RNA的堿基序列也沒有特別的要求， 可以為常規的作為探針和/或核酸藥物的RNA片段的堿基序列，如數據庫miRBase(http:// www. mirbase. org/)> miR2Disease (http://www. mir2disease. org/)中所記載的各 miRNA 的堿基序列或它們的反向互補序列。
[0022] 其中，化學合成雙鏈DNA的操作可以按照本領域常規的方式進行，例如使用固相 DNA合成法分別合成模板鏈的單鏈DNA和編碼鏈的單鏈DNA。
[0023] 其中，編碼鏈，又稱正義鏈，是指與轉錄產物（RNA)序列相同(僅僅將T替換為U)的 那條DNA單鏈。
[0024] 其中，模板鏈，又稱反義鏈，是指與編碼鏈互補的那條DNA單鏈。
[0025] 其中，"互補"是指核酸分子中的核苷酸或核苷酸類似物的堿基按照Watson-Crick 配對原則（A-T、A-U、C-G)的配對。"完全互補"是指核酸分子中的核苷酸或核苷酸類似物的 喊基100%的互補。"完全正確"是指測定的喊基序列與目的喊基序列具有100%的一致性。
[0026] 根據本發明所述的方法，其中，第一內切酶可以為本領域常規使用的I型核酸 內切酶或II型核酸內切酶（EC3. 1. 22. 1)，例如NEB公司出售的各種限制性核酸內切酶 (https://www. neb. com/products/restriction-endonucleases)，包括但不限于 Aatll，A baSI, Acc65I, AccI, Acil, Acll, Acul, Afel, Aflll, Afllll, Agel, Ahdl, Alel, Alul, Alwl, A1 wNI, Apal, ApaLI, ApeKI, Apol, AscI, AscI, Asel, AsiSI, Aval, Avail, AvrII, BaeGI, Bael, B amHI, BanI, Banll, Bbsl, BbvCI, Bbvl, BccI, BceAI, Bcgl, BciVI, Bell, BcoDI, Bfal, BfuAI, BfuCI, Bgll, Bglll, BlpI, BmgBI, Bmrl, Bmtl, Bpml, BpulOI, BpuEI, BsaAI, BsaBI, BsaHI, Bs al, BsaJI, BsaffI, BsaXI, BseRI, BseYI, Bsgl, BsiEI, BsiHKAI, BsiffI, BslI, BsmAI, BsmBI, B smFI, BsmI, BsoBI, Bspl286I, BspCNI, BspDI, BspEI, BspHI, BspMI, BspQI, BsrBI, BsrDI, Bs rFI, BsrGI, BsrI, BssHII, BssKI, BssSI, BstAPI, BstBI, BstEII, BstNI, BstUI, BstXI, BstY I, BstZ17I, Bsu36I, Btgl, BtgZI, BtsCI, BtsI, BtsIMutI, Cac8I, Clal, CspCI, CviAII, CviK 1-1, CviQI, Ddel, Dpnl, DpnII, Dral, Dralll, DrdI, Eael, EagI, Earl, Ecil, Eco53kI, EcoNI, Eco0109I, EcoP15I, EcoRI, EcoRV, Fatl, Faul, Fnu4HI, FokI, Fsel, FspEI, FspI, Haell, Hael II, Hgal, Hhal, Hindi, Hindlll, Hinfl, HinPlI, Hpal, Hpall, HphI, Hpyl66II, Hpyl88I, Hpy 188III, Hpy99I, HpyAV, HpyCH4III, HpyCH4IV, HpyCH4V, I-CeuI, I-Scel, KasI, Kpnl, LpnPI, Mbol, MboII, Mfel, MluCI, Mlul, Mlyl, Mmel, Mnll, MscI, Msel, MslI, MspAlI, MspI, MspJI, Mw ol, Nael, Narl, Nb. BbvCI, Nb. BsmI, Nb. BsrDI, Nb. BtsI, Neil, Ncol, Ndel, NgoMIV, Nhel, Nla III, NlalV, NmeAIII, Notl, Nrul, Nsil, NspI, Nt. Alwl, Nt. BbvCI, Nt. BsmAI, Nt. BspQI, Nt. BstNBI, Nt. CviPII, PacI, PaeR7I, Pcil, PflFI, PflMI, Phol, PI-PspI, PI-SceI, Plel, PluTI ,Pmel, Pmll, PpuMI, PshAI, Psil, PspGI, PspOMI, PspXI, PstI, Pvul, PvuII, Rsal, RsrII, Sac I, SacII, Sail, SapI, Sau3AI, Sau96I, Sbfl, Seal, ScrFI, SexAI, SfaNI, Sfcl, Sfil, Sfol, Sg rAI, Smal, Smll, SnaBI, Spel, Sphl, SspI, StuI, StyD4I, Styl, Styi-HF?，Swal, Taq α I，Tfi 1, Tlil, Tsel, Tsp45I, Tsp509I, TspMI, TspRI, Tthllll, Xbal, Xcml, Xhol, Xmal, XmnI, Zral ； 優選為SnaBI或BtsCI。
[0027] 其中，第二內切酶可以為本領域常規使用的I型核酸內切酶或II型核酸內切酶， 且能在目的RNA片段的編碼DNA的3'末端切開，以使轉錄模板片段的模板鏈的5'末端能 與目的RNA片段的3'末端形成平末端的雙鏈；例如上面所列出的酶，優選為BtsCI。
[0028] 優選地，目的RNA片段的DNA模板鏈的5'末端的1-7個堿基是第二內切酶的 酶切位點的片段(也就是目的RNA片段的編碼DNA與第二內切酶的酶切位點存在重疊 (overlap))，并且，第二內切酶的切割點恰好為DNA模板鏈的5'末端的第1個核苷酸的5' 一側。例如BtsCI的酶切位點在編碼鏈上的序列為5' -NNCATCC-3'，而BtsCI的酶切位點 在模板鏈上的序列為3'-NNGTAGG-5'（即5'-GGATGNN-3'），此時，目的RNA片段的DNA模板 鏈的5'末端的第1和第2個堿基是BtsCI的酶切位點中的NN，BtsCI的切割點恰好為目的 RNA片段的DNA模板鏈的5'末端的第1個核苷酸的5' 一側（即5' -GGATG-3'和5' -NN-3' 之間）。
[0029] 根據本發明的一種實施方式，其中，可以通過第一內切酶和/或第二內切酶的具 體選擇，以避免在啟動子和目的RNA片段的編碼DNA中出現第一內切酶的酶切位點或第二 內切酶的酶切位點。例如，當目的RNA片段的編碼DNA中出現EcoRI的酶切位點時，要避免 使用EcoRI作為第一內切酶的酶切位點或第二內切酶位點。
[0030] 根據本發明所述的方法，其中，啟動子是指能夠被RNA聚合酶識別和結合并 且在5' -3'方向上促使RNA合成的特異性DNA序列。可以根據不同的RNA聚合酶選 擇該RNA聚合酶對應的啟動子。優選使用高保真（即突變幾率小）的RNA聚合酶，例如 T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶或T3RNA聚合酶。優選情況下，所述啟動子為T7啟動子 (TAATACGACTCACTATAGGG，SEQ ID N0:5)、SP6啟動子（GATTTAGGTGACACTATAG，SEQ ID N0:6) 或 T3 啟動子（AATTAACCCTCACTAAAGG，SEQ ID N0:7)。
[0031] 根據本發明所述的方法，其中，目的RNA片段可以為各種需要合成的RNA片段，例 如RNA探針、RNA藥物等，優選情況下，目的RNA片段為靶向miRNA的RNA探針。其中，RNA 探針是指用于RNA雜交的RNA片段。
[0032] 根據本發明所述的方法，其中，所得到的轉錄產物可以直接作為含有目的RNA片 段的物料使用，優選情況下，該方法還包括，從轉錄產物中純化RNA片段。
[0033] 其中，純化RNA片段的操作可以按照本領域常規的方法進行，例如進行核酸凝膠 電泳和切膠回收，或者高壓液相色譜純化。
[0034] 根據本發明所述的方法，其中，優選情況下，所述編碼鏈的序列為SEQ ID NO: 1或 SEQ ID N0:3。
[0035] 根據本發明所述的方法，其中，進行體外轉錄所用的核糖核苷三磷酸中的至少一 部分為帶有標記修飾的核糖核苷三磷酸。
[0036] 其中，"標記"是指能夠通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他手段 檢測到的基團或化合物。例如，常用的標記包括但不限于 32P、熒光染料、生物素、地高辛或 半抗原。標記可以在轉錄所得的RNA中的任意位置摻入，例如在5'末端、3'末端或中間。
[0037] 其中，優選情況下，所述帶有標記修飾的核糖核苷三磷酸為帶有地高辛修飾的核 糖尿嘧啶三磷酸、生物素修飾的核糖尿嘧啶三磷酸、生物素修飾的核糖胞嘧啶三磷酸、生物 素修飾的核糖鳥嘌呤三磷酸、熒光素修飾的核糖尿嘧啶三磷酸、熒光素修飾的核糖胞嘧啶 三磷酸、熒光素修飾的核糖鳥嘌呤三磷酸、熒光素修飾的核糖腺嘌呤三磷酸、氚標記的核糖 尿嘧啶三磷酸、 32P標記的核糖尿嘧啶三磷酸、32P標記的核糖胞嘧啶三磷酸或32P標記的核 糖腺嘌呤三磷酸。
[0038] 根據本發明所述的方法，其中，優選情況下，所述帶有標記修飾的核糖核苷三磷酸 為帶有地高辛修飾的核糖尿嘧啶三磷酸，且帶有地高辛修飾的核糖尿嘧啶三磷酸和不帶有 地高辛修飾的核糖尿嘧啶三磷酸的摩爾比為1.5-4:1，更優選為1.8-3:1，更進一步優選為 1. 9-2. 5:1，最優選為 2:1。
[0039] 另一方面，本發明還提供了一種RNA片段，其中，該RNA片段是根據如上所述的方 法制備得到的。
[0040] 再一方面，本發明還提供了 RNA片段在制備核酸藥物、檢測試劑盒或診斷試劑盒 中的用途。
[0041] 以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。以下實施例中，各分子生物學試劑 均為市售品，各分子生物學實驗的操作均可按工具書（Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press;4th edition)及各試劑的使用說明書進 行。
[0042] 實施例1
[0043] 參考圖1，本實施例按照以下方式制備轉錄產物：
[0044] (1)委托上海鉬宜生物科技有限公司化學合成以下4條DNA單鏈：
[0045] 單鏈 SS1，MiR-96 探針的正向序列(SnaBI-T7-MiR96~BtsCI)；
[0046] TACGTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAACG CATCC(SEQ ID NO:1);
[0047] 單鏈 SS2, MiR-96 探針的反向互補序列(BtsCI-MiR96-T7~SnaBI)；
[0048] GGATGCGTTTGGCACTAGCACATTTTTGCTCCCTATAGTGAGTCGTATT ACGTA(SEQ ID NO:2)；
[0049] 單鏈 SS3, MiR_2〇OC 探針的正向序列(BtsCI-SP6-MiR200c-BtsCI)；
[0050] GGATGCGGATTTAGGTGACACTATAGTCCATCATTACCCGGCAGTATTA CGCATCC(SEQ ID NO:3)；
[0051] 單鏈 SS4, MiR-200C 探針的反向互補序列(BtsCI-MiR200c-SP6-BtsCI)
[0052] GGATGCGTAATACTGCCGGGTAATGATGGACTATAGTGTCACCTAAATC CGCATCC (SEQ ID NO:4)〇
[0053] 其中，單鏈SSI是編碼鏈，單鏈SS2是模板鏈，單鏈SSI和單鏈SS2經過變 性退火處理后即得到化學合成的雙鏈DNA，命名為雙鏈DS1 ;在DS1的編碼鏈（即單鏈 SS1)的5'至3'方向上，第一內切酶的酶切位點（即SnaBI的酶切位點，GGATGCG)、啟 動子（即 17 啟動子，TAATACGACTCACTATAGGG, SEQ ID N0:5)、RNA 片段的編碼 DNA (即， AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA，SEQ ID N0:8)和第二內切酶的酶切位點（S卩BtsCI的酶切位點， CGCATCC)依次連接。
[0054] 其中，單鏈SS3是編碼鏈，單鏈SS4是模板鏈，單鏈SS3和單鏈SS4經過變 性退火處理后即得到化學合成的雙鏈DNA，命名為雙鏈DS2 ;在DS2的編碼鏈（即單鏈 SS3)的5'至3'方向上，第一內切酶的酶切位點（即BtsCI的酶切位點，GGATGCG)、啟 動子（即 SP6 啟動子，GATTTAGGTGACACTATAG, SEQ ID N0:6)、RNA 片段的編碼 DNA (即， TCCATCATTACCCGGCAGTATTA, SEQ ID N0:9)和第二內切酶的酶切位點（S卩BtsCI的酶切位點， CGCATCC)依次連接。
[0055] (2)將雙鏈DS1克隆到載體pUC57的EcoRV酶切位點處，得到多個單克隆的質粒 PUC57-DS1。具體地，將載體pUC57用EcoRV酶切開，然而后用DNA連接酶（T41igase，購自 NEB，以下同）把切開的pUC57和DS1進行核酸連接，得到連接產物；用連接產物轉化感受態 細胞(大腸桿菌DH5 α菌株)，挑選4個單克隆并擴增得到質粒pUC57-DSl。
[0056] 同上述方法將雙鏈DS2克隆到pUC57的EcoRV酶切位點處，得到4個單克隆的質 粒PUC57-DS2。
[0057] 將4個單克隆的質粒PUC57-DS1分別進行測序，測序結果顯示其中有1個克隆含 有的插入序列與RNA片段的編碼DNA(g卩，AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA，SEQIDN0:8)不完 全一致，因而不能完全正確編碼RNA片段；而剩余的3個克隆含有的插入序列與RNA片段的 編碼DNA (S卩，AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA，SEQ ID勵:8)完全一致，能夠完全正確編碼尺隱 片段。挑選任意1個能夠完全正確編碼RNA片段的pUC57-DSl質粒作為模板質粒，命名為 模板質粒TP1。
[0058] 將4個單克隆的pUC57-DS2分別進行測序，測序結果顯示其中有2個克隆含有的 插入序列與RNA片段的編碼DNA(g卩，TCCATCATTACCCGGCAGTATTA，SEQIDN0:9)不完全一 致，因而不能完全正確編碼RNA片段；而剩余的2個克隆含有的插入序列與RNA片段的編碼 DNA (S卩，TCCATCATTACCCGGCAGTATTA，SEQ ID勵:9)完全一致，能夠完全正確編碼1?隱片段。 挑選任意1個能夠完全正確編碼RNA片段的pUC57-DS2質粒作為模板質粒，命名為模板質 粒 TP2。
[0059] (3)使用51^81和財8(：1對模板質粒了？1進行酶切，然后通過電泳切膠法分離酶切 產物中的小片段(約50bp)，該分離的小片段即為能夠完全正確編碼RNA片段的轉錄模板片 段T1。
[0060] 使用BtsCI對模板質粒TP2進行酶切，然后通過電泳切膠法分離酶切產物中的小 片段(約50bp)，該分離的小片段即為能夠完全正確編碼RNA片段的轉錄模板片段T2。
[0061] (4)使用體外轉錄體系對轉錄模板片段T1進行體外轉錄得到轉錄產物R1。體外 轉錄體系采用購自Promega公司的體外轉錄試劑盒進行，其中含有IX轉錄緩沖液、10mM的 DTT，40 單位的 RNA 酶抑制劑、0· 5mM 的 CTP、0. 5mM 的 ATP、0. 5mM 的 GTP、0. 4mM 的 UTP、0. 2mM 的DIG-UTP (購自Roche Applied Science公司）和40單位的T7RNA聚合酶。體外轉錄的 時間為4h，溫度為37°C，模板用量為5ng/l·! L。
[0062] 使用體外轉錄體系對轉錄模板片段T2進行體外轉錄得到轉錄產物R2。體外轉 錄體系采用購自Promega公司的體外轉錄試劑盒進行，其中含有IX轉錄緩沖液、10mM的 DTT，40 單位的 RNA 酶抑制劑、0· 5mM 的 CTP、0. 5mM 的 ATP、0. 5mM 的 GTP、0. 4mM 的 UTP、0. 2mM 的DIG-UTP (購自Roche Applied Science公司）和40單位的SP6RNA聚合酶。體外轉錄 的時間為4h，溫度為37°C，模板用量為5ng/l·! L。
[0063] 對比例1
[0064] 采用實施例1的方法制備RNA產物，不同的是將載體pUC57替換為載體 pcDNA3. 1 (+)，并用Pmel酶將pcDNA3. 1 (+)質粒線性化以使pcDNA3. 1 (+)質粒中自帶的 ?7啟動子后面只連接22bp的模板序列，然后通過電泳切膠法分離線性化的質粒，該分離 的片段作為轉錄模板片段T1-DB1。然后采用實施例1的方法進行體外轉錄得到轉錄產物 R1-DB1。
[0065] 對比例2
[0066] 采用實施例1的方法制備轉錄產物，不同的是將單鏈SS1和單鏈SS2經過變性退 火處理后得到的化學合成的雙鏈DS1作為轉錄模板片段T1-DB2。然后采用實施例1的方法 進行體外轉錄得到轉錄產物R1-DB2。
[0067] 測試實施例1
[0068] 將轉錄模板片段T1、轉錄產物R1、轉錄產物R1-DB1、轉錄模板片段T2和轉錄產物 R2用濃度為15%的PAGE膠進行電泳，電泳結果見圖2。
[0069] 圖2的結果顯示轉錄產物R1 (泳道2)中大部分是預期大小（23bp)和比預期大小 少一個堿基的產物，另有一些比預期大小大的RNA產物。圖2的結果還顯示，以線性化載體 (轉錄模板片段T1-DB1)為模板不能精確轉錄短的RNA，未見預期的22bp的RNA (泳道4)。 轉錄產物R2 (泳道7)中也含有精確大小的RNA探針，且轉錄產物主要是預期大小（23bp) 的RNA和比預期大小大一個堿基（24bp)的RNA。
[0070] 實施例2
[0071] 將轉錄產物R1和轉錄產物R2用濃度為15%的PAGE膠進行電泳，電泳結果與圖2 中的泳道2和泳道7相同。切下23bp位置處的凝膠，并且從切下的凝膠中回收RNA片段， 以達到純化RNA片段的目的，分別得到靶向miRNA-96的探針1和靶向miRNA-200c的探針 2〇
[0072] 具體的從凝膠中回收RNA片段的操作包括：把膠切成小碎片，用3倍體積的 1 XTBE洗脫搖過夜，離心（600X g，lmin)后，把上清液轉移至新的離心管內，加相當于上清 液〇. 7倍體積的異丙醇沉淀RNA，用lmL的70%的乙醇洗滌RNA沉淀一次，風干RNA沉淀，力口 10 μ 1無核酸酶的水溶解RNA沉淀，即得到溶解有RNA探針的水溶液。
[0073] 對比例3
[0074] 采用實施例2的方法純化RNA片段，不同的是對轉錄產物R1-DB2進行純化，得到 探針1-DB2。
[0075] 測試實施例2
[0076] 按照文獻（Peng et al. ,2012)中的方法分別制備8μπι厚的11.5日齡和13.5 日齡的小鼠胚胎的切片。并按照上述文獻中的方法分別使用實施例2中制備得到的靶向 miRNA-96 的探針 1、購自 Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號38474-05)和對比例3中制備得到的探針1-DB2以相同的條件對切片進行雜交 和顯色，部分結果分別如圖3-圖6所示。
[0077] 具體地的雜交和顯色的操作如下：
[0078] (1)處理切片：將上述制得的切片按照文獻（Peng et al.，2012)中的方法依次進 行二甲苯脫蠟、復水、4質量％的多聚甲醛固定、蛋白酶K消化、4質量％的多聚甲醛固定和 2倍濃度的SSC雜交緩沖液洗滌；得到處理好的切片。
[0079] (2)預雜交：加100 μ 1的雜交緩沖液(購自Ambion，貨號8806G)到上述處理好的 組織片上，蓋上蓋玻片，放置在一個含50體積％甲酰胺的5倍濃度的SSC雜交緩沖液的保 濕盒中，把保濕盒放置在53°C的溫箱內預雜交1個小時。
[0080] (3)雜交：為每張標本片準備ΙΟΟμΙ的雜交緩沖液(購自Ambion，貨號8806G)， 其中加2pmol的本發明生產的miR-96RNA探針，或者加2pmol的購自Exiqon公司的革巴向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號 38474-05)，或者加 2pmol 的對比 例3中制備得到的探針1-DB2,混勻后備用。把組織片上的蓋玻片移去，分別加上如上所述 的含探針的1〇〇μ 1的雜交緩沖液，蓋上一個新的蓋玻片，放回保濕盒中，放至溫箱中53°C 雜交過夜。
[0081] (4)洗滌：將雜交后的切片用含有50體積％甲酰胺和0. 1體積％Tween-20的2倍 濃度的SSC雜交緩沖液于57°C洗4次，每次200mL，每次15分鐘；用含有50體積％甲酰胺 和0. 1體積％Tween-20的0. 2倍濃度的SSC雜交緩沖液于57°C洗4次，每次200mL，每次15 分鐘；PBS中洗2次，每次200mL，每次10分鐘，得到洗滌后的切片。
[0082] (5)抗體檢測信號：在室溫下用500 μ 1的含10體積％胎牛血清（FBS)的PBS封閉 上述洗滌后的切片1小時；加40〇μ 1的1:2000 (體積）稀釋的辣根過氧化物酶（HRP)交聯 的 anti-DIG 抗體（Roche)，4°C孵育過夜；緩沖液 I (0. 1Μ Tris，0. 1Μ NaCl，pH7. 5)中洗滌 2 次，每次 200mL，每次 15 分鐘；200mL 的緩沖液 II (0· 1M Tris，0. 1M NaCl，pH9. 5)中洗滌 15分鐘；加400 μ 1 NBT/BCIP (Roche)底物于腦片上，室溫顯色反應3小時后用相機拍照， 記錄顯色進程(見圖3)。
[0083] 用本發明生產的探針顯色速度快，且特異地深染高表達miR-96的背根神經節區， 與文獻報道一致（Kloosterman et al.，2006)。室溫顯色反應12小時后終止用本發明生 產的miR-96RNA探針雜交的顯色，并封片。用購自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探針 (miRCURY LNA? Detection probe，貨號38474-05)雜交的顯色在72小時后終止，并封片。 用相機拍照記錄染色的結果，顯示本發明生產的miR-96RNA探針在顯色12個小時后檢測 到的信號要明顯強于購自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號38474-05)在顯色72個小時后檢測到的信號（見圖4)。
[0084] 用10倍光學顯微鏡拍照顯示：本發明生產的miR-96RNA探針在顯色12個小時后 檢測到miR-96特異地高表達在胚胎發育11. 5天的小鼠胚胎矢狀切片的背根神經節中（圖 5 中的 A)，相反，Exiqon 公司的祀向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨 號38474-05)在顯色72個小時后在背根神經節中檢測到的信號還是很微弱，與背景差別不 大（圖5中的B)。
[0085] 同樣，在胚胎發育13. 5天的小鼠胚胎冠狀切片的背根神經節中，本發明生產的 miR-96RNA探針在顯色12個小時后檢測到miR-96的信號非常強，而且非常特異（圖6中 的 A);相反，Exiqon 公司的祀向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號 38474-05)在顯色72個小時后檢測到miR-96的信號還是非常弱，與背景難以區分（圖6中 的B)。
[0086] 此外，相對于對比例3中制備得到的探針1-DB2,實施例2中制備得到的靶向 miRNA-96的探針1的背景較淺，證明本發明生產的RNA探針(探針1)的特異性高于探針 1-DB2。
[0087] 由此可以看出：用來源于同一小鼠胚胎的標本，同步檢測Exiqon公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號 38474-05)與本發明生產的 RNA探 針的靈敏度和特異性，結果顯示，本發明生產的RNA探針靈敏度和特異性都遠高于Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探針（miRCURY LNA? Detection probe，貨號 38474-05)，且大大縮 短了顯色反應的時間。
[0088] 以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中 的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這 些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。
[0089] 另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征，在不矛 盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發明對各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0090] 此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本 發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。
【權利要求】
1. 一種制備RNA片段的方法，該方法包括： (1) 獲得化學合成的雙鏈DNA，所述化學合成的雙鏈DNA由編碼鏈和模板鏈配對而成； 在從所述編碼鏈的5'至3'方向上，第一內切酶的酶切位點、啟動子、目的RNA片段的編碼 DNA和第二內切酶的酶切位點依次連接； (2) 將所述化學合成的雙鏈DNA片段克隆至載體中以得到多個克隆的擴增質粒，并分 別對多個克隆的擴增質粒進行DNA測序；挑選能夠完全正確編碼目的RNA片段的擴增質粒 的克隆作為模板質粒； (3) 使用第一內切酶和第二內切酶對模板質粒進行酶切，得到酶切產物，并從酶切產物 中分離能夠完全正確編碼目的RNA片段的轉錄模板片段； 其中，第二內切酶能夠在目的RNA片段的DNA模板鏈的5'末端切開，以使轉錄模板片 段的模板鏈的5'末端能夠與目的RNA片段的3'末端形成平末端的雙鏈； (4) 對所述轉錄模板片段進行體外轉錄，得到含有目的RNA片段的轉錄產物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，第一內切酶為SnaBI或BtsCI ;第二內切酶為 BtsCI ;所述啟動子為T7啟動子、SP6啟動子或T3啟動子。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中，目的RNA片段為靶向miRNA的RNA探針。
4. 根據權利要求1所述的方法，其中，該方法還包括，從轉錄產物中純化RNA片段。
5. 根據權利要求1、3或4所述的方法，其中，所述編碼鏈的序列為SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3。
6. 根據權利要求1所述的方法，其中，進行體外轉錄所用的核糖核苷三磷酸中的至少 一部分為帶有標記修飾的核糖核苷三磷酸。
7. 根據權利要求6所述的方法，其中，所述帶有標記修飾的核糖核苷三磷酸為帶有地 高辛修飾的核糖尿嘧啶三磷酸、生物素修飾的核糖尿嘧啶三磷酸、生物素修飾的核糖胞嘧 啶三磷酸、生物素修飾的核糖鳥嘌呤三磷酸、熒光素修飾的核糖尿嘧啶三磷酸、熒光素修飾 的核糖胞嘧啶三磷酸、熒光素修飾的核糖鳥嘌呤三磷酸、熒光素修飾的核糖腺嘌呤三磷酸、 氚標記的核糖尿嘧啶三磷酸、 32P標記的核糖尿嘧啶三磷酸、32P標記的核糖胞嘧啶三磷酸或 32P標記的核糖腺嘌呤三磷酸。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中，所述帶有標記修飾的核糖核苷三磷酸為帶有地 高辛修飾的核糖尿嘧啶三磷酸，且帶有地高辛修飾的核糖尿嘧啶三磷酸和不帶有地高辛修 飾的核糖尿嘧啶三磷酸的摩爾比為1. 5-4 :1。
9. 一種RNA片段，其特征在于，該RNA片段是根據權利要求1-8中任意一項所述的方法 制備得到的。
10. 權利要求9所述的RNA片段在制備核酸藥物、檢測試劑盒或診斷試劑盒中的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK104250645SQ201310263324
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月27日 優先權日:2013年6月27日
【發明者】彭長庚, 溫婷 申請人:彭長庚, 溫婷