表達脂肪酶的埃希氏菌f6,f6脂肪酶及其生產和應用的制作方法【專利摘要】分離的表達脂肪酶的埃希氏菌F6，F6脂肪酶及其生產和應用，尤其是用于生產生物柴油的用途。CGMCCNo.75072013.04.22【專利說明】表達脂肪酶的埃希氏菌F6,F6脂肪酶及其生產和應用【
技術領域：
】：[0001]本發明涉及微生物、酶工程，涉及脂肪酶及其生產和應用。【
背景技術：
】：[0002]脂肪酶（甘油三酯酰基水解酶，E.C.3.I.1.3)催化酯（由長鏈脂肪酸和甘油合成的酯）的水解和合成（PetersenM,DanielR.2006.PurificationandcharacterizationofanextracellularlipasefromClostridiumtetanomorphum.JMicrobiolBiotechnol22:431-435)。除了水解羧基酯鍵的基本功能外，脂肪酶還可催化酯化反應（形成酯），酯交換反應，酯基轉移反應（酯鍵的交換）（HasanF,AamerAS,AbdulΗ.2006.Industrialapplicationofmicrobiallipases.EnzymeandMicrobTechnol39:235-251)。由于脂肪酶在工業、生物醫療、生物能源和醫學研究上有巨大的潛在應用價值，如今已存在大量的有關脂肪酶的研究。[0003]脂肪酶普遍存在于自然界中，可從不同的植物，動物和微生物中生產獲取這些脂肪酶（GuptaR，NamitaG，PoojaR.2004.Bacteriallipases:Anoverviewofproduction,purification,andbiochemicalsproperties.ApplMicrobiolBiotechnol64:763-781).盡管從動植物中已能夠獲得多種脂肪酶，但由于細菌生產的脂肪酶多為胞外脂肪酶，可通過細胞外膜分泌到培養基中，這在工業應用中特別有利，因此，采用微生物尤其是細菌進行脂肪酶的生產越來越受到青睞（RoyterM.2006.CloningandCharacterizationofThermostableLipasesfromThermophilicAnaerobicBacteria[Dissertation].Hamburg:TechnischeMikrobiologie,TechnischeUniversitatHamburg)〇[0004]目前已發現大量的脂肪酶生產菌株，但只有少數一些野生型或重組脂肪酶可在商業化中應用（JaegerKE，RansaeS，DjikstraBW，ColsonC，vanHeuvelM，Misset0·1994.Bacteriallipases.FEMSMicrobiolRev15:29-63))。[0005]由于生物柴油的可生物降解性、可再生、無毒害、低排放量和環境友好性，因此近來生物柴油備受世界各地的關注（LecaM,TcacencoL，MicutzM,StaicuT.2010.Optimizationofbiodieselproductionbytransesterificationofvegetableoilsusinglipases.RomanianBiotechnologicalLetters15(5):5618-5630)〇由于生物柴油是由植物油一類的可再生資源制備，因此被認為是CO2中性的，可生物降解的油類，有助于節約化石燃料。與傳統的柴油燃料相比，它的燃燒污染排放大幅減少(RafaelC1GiandraV1KeikoW1MarcoA.2008.Enzymaticsynthesisofbiodieselfromtransesterificationreactionsofvegetableoilsandshortchainalcohols.JAmOilChemSoc85:925-930)。[0006]工業上，生物柴油可在堿性或酸性的催化劑條件下，由植物油和短鏈醇的酯化反應生成，其中，短鏈醇通常為甲醇。得到的反應產物為需要的酯類，單甘酯，甘二酯，甘油，水，和催化劑的混合物。和酶介導的過程相比，該過程需消耗更多的能量。由于皂類副產物的存在，化學法制備的生物柴油與酶法制備的生物柴油相比，它的分離純化在一定程度上需更復雜的步驟。基于此，采用生物催化劑是一種具有吸引力的選擇，因為酶促合成的生物柴油，無需純化即可使用（RafaelC，GiandraV，KeikoW，MarcoA.2008.Enzymaticsynthesisofbiodieselfromtransesterificationreactionsofvegetableoilsandshortchainalcohols.JAmOilChemSoc85:925-930)〇[0007]通過脂肪酶作生物催化劑，可將來自植物油的甘三酯通過轉酯化反應轉變為脂肪酸烷基酯。在溫和條件下即可進行酶處理，這減少了能耗，降低了廢棄物處理的費用。同時，還可對固定化酶進行重復利用，這降低了成本，使酶處理過程具有經濟性和實用性（IgorNjSusanaLjMarlyCjOtavioLjMarcioFjMartaA.2011.Enzymaticbiodieselsynthesisusingabyproductobtainedfrompalmoilrefining.EnzymeResearch)。【
發明內容】：[0008]概括地說，本發明主要包括以下內容：[0009]第一方面，本發明提供了一種分離的表達脂肪酶的菌株，命名為埃希氏菌F6,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.7507。[0010]第二方面，本發明提供了一種脂肪酶，其氨基酸序列選自：SEQIDNO:1所示氨基酸序列或其保守性變體。[0011]第三方面，本發明提供了一種分離的核酸分子，含有編碼脂肪酶的核苷酸序列，所述脂肪酶的氨基酸序列選自SEQIDNO:1所示氨基酸序列或其保守性變體；所述核苷酸序列優選如SEQIDNO:2的1-1842所示；所述核酸分子的核酸序列優選如SEQIDNO:2所/Jn〇[0012]第四方面，本發明提供了一種重組細胞，含有第三方面所述的核酸分子，優選的，所述重組細胞選自含有所述核酸分子的大腸桿菌，含有所述核酸分子的酵母菌和含有所述核酸分子的保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.7507的埃希氏菌F6。[0013]第五方面，本發明提供了一種重組載體，含有第三方面所述的核酸分子，優選的，所述重組載體是質粒，優選的，例如由PUC19構建的含有所述核酸分子的PWB201、由PRK415構建的含有所述核酸分子的PWB204、或由pColdTF構建的含有所述核酸分子的pWB210。[0014]第六方面，本發明提供了一種生產脂肪酶的方法，包括：培養第一方面所述的菌株和/或第四方面所述的重組細胞以使所述菌株或細胞生產脂肪酶，收獲脂肪酶；優選地，所述方法包括在培養基中添加脂肪酶誘導劑，優選的誘導劑為甘三酯，優選的甘三酯為橄欖油、棕櫚油、椰子油、大豆油、棕櫚仁油。[0015]所述收獲可以包括分離和收集含有分泌或釋放到胞外的脂肪酶的培養物上清液，由此獲得含有脂肪酶的脂肪酶液；優選地，所述方法還包括對所述脂肪酶液進行濃縮。[0016]第七方面，本發明提供了一種脂肪酶，用第六方面所述方法制得。[0017]第八方面，本發明提供了一種脂肪酶液，用第六方面所述方法制得。[0018]第九方面，本發明提供了一種生產生物柴油的方法，其特征在于采用第一方面所述菌株、第二方面所述脂肪酶、第八方面所述脂肪酶、第四方面所述重組細胞或第九方面所述脂肪酶液作為催化劑。[0019]油棕櫚（Elaeisguineensis)果實表面或油棕櫚果圍，由于其油性的環境，是分離表達脂肪酶的菌株的潛在來源。我們從油棕櫚果圍成功分離得到一株表達脂肪酶的菌株，命名為埃希氏菌F6(Escherichiasp.F6)，本文中簡稱為F6,并將F6來源的脂肪酶命名為F6脂肪酶（F61ip)，經F6表現出的脂解活性稱為F6脂肪酶活性。本發明的埃希氏菌F6菌種已于2013年4月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.7507。[0020]本發明提供了一種生產脂肪酶的方法，包括培養本發明分離得到的F6以令其生產脂肪酶，收獲所述細菌生產的脂肪酶。F6可將生產的脂肪酶分泌到胞外的培養基中。實施方式之一中，所述收獲包括從培養物中分離出上清液，由此得到含有脂肪酶具有脂肪酶活性的脂肪酶液。可選的是，可以對生產株進行破胞處理，從而釋放出更多的脂肪酶。[0021]實施方式之一中，對本發明的脂肪酶液進行了濃縮，這樣可以提高脂肪酶液的脂肪酶活性。本發明的酶液可以直接使用。可以采用酶工程領域已知的各種方法從本發明酶液中進一步分離和純化脂肪酶，由此獲得本發明的F6脂肪酶。[0022]實施方式之一中，本發明在培養基中添加了脂肪酶誘導劑。本發明發現，誘導劑顯著提高培養上清中的酶活，由此表明誘導劑顯著提高了上清中的酶得率。所述誘導劑的例子有橄欖油、棕櫚油、椰子油、大豆油、棕櫚仁油等甘三酯油脂。Pogori等報道稱，甘三酯是一種常用的脂肪酶誘導劑，被廣泛用于增強脂肪酶的分泌；加入2%豆油或橄欖油可增強華根霉（Rhizopuschinensis)脂肪酶的分泌（PogoriN,CheikhyoussefA,XuY,WangD.2008.ProductionandbiochemicalcharacterizationofanextracellularlipasefromRhizopuschinensisCCTCCM201021.Biotechnology7(4):710-717)。本發明實施例之一中，加入1-2%(v/v)的橄欖油促使培養基中脂肪酶活性提高。[0023]測定脂肪酶活性的方法有例如對硝基苯酚棕櫚酸酯（pNPP)法。一個單位的脂肪酶活性的定義為：在PH8.0,37°C條件下，每分鐘催化水解pNPP釋放1μmol對硝基苯酚所消耗的酶量。所述方法包括：[0024](1)標準曲線的繪制[0025]1.稱取0.1391g的pNP溶解到50ml的異丙醇中制備20mM的儲存溶液。當使用它制作標準曲線時，以10:100的比例稀釋，得2.OmM的pNP溶液。當制作標準曲線及對如培養物的上清等樣品進行實驗時，要確保所有的反應條件和反應體積是相同的。[0026]2.如下表所示，將所有的溶液混合一起。在37°C條件下孵育15min，加入2ml95%乙醇。以7000rpm離心2min，測定上清于410nm處的吸光度值A410(當使用分光光度計時，加水作為空白對照）。記錄每個樣品的A410值，制作標準曲線，公式為：Y=ax+b(Y:pNPP濃度；X:A410;a，b:反應因子）[0027]【權利要求】1.一種分離的表達脂肪酶的菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.7507。2.-種脂肪酶，其氨基酸序列選自：1.SEQIDN0:1所示氨基酸序列，或2.SEQIDNO:1所示氨基酸序列的保守性變體。3.-種分離的核酸分子，含有編碼脂肪酶的核苷酸序列，所述脂肪酶的氨基酸序列選自SEQIDNO:1所示氨基酸序列或其保守性變體；所述核苷酸序列優選如SEQIDNO:2的1-1842所示；所述核酸分子的核酸序列優選如SEQIDN0:2所示。4.一種重組細胞，含有要求3所述的核酸分子，優選的，所述重組細胞選自含有所述核酸分子的大腸桿菌，含有所述核酸分子的酵母菌和含有所述核酸分子的保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.7507的埃希氏菌F6。5.-種重組載體，含有權利要求3所述的核酸分子，優選的，所述重組載體是質粒，優選為由PUC19構建的含有所述核酸分子的pWB201、由pRK415構建的含有所述核酸分子的PWB204、由pColdTF構建的含有所述核酸分子的pWB210。6.-種生產脂肪酶的方法，包括：培養權利要求1所述的菌株和/或權利要求4所述的重組細胞以使所述菌株或細胞生產脂肪酶，收獲脂肪酶；優選地，所述方法包括在培養基中添加脂肪酶誘導劑，優選的誘導劑為甘三酯，優選的甘三酯為橄欖油、棕櫚油、椰子油、大豆油、棕櫚仁油。7.如權利要求6所述的方法，所述收獲包括分離和收集含有分泌或釋放到胞外的脂肪酶的培養物上清液，由此獲得含有脂肪酶的脂肪酶液；優選地，所述方法還包括對所述脂肪酶液進行濃縮。8.-種脂肪酶，用權利要求6或7所述方法制得。9.一種脂肪酶液，用權利要求7所述方法制得。10.-種生產生物柴油的方法，其特征在于采用權利要求1所述菌株、權利要求2所述脂肪酶、權利要求8所述脂肪酶、權利要求4所述重組細胞或權利要求9所述脂肪酶液作為催化劑。【文檔編號】C12R1/185GK104278004SQ201310294466【公開日】2015年1月14日申請日期:2013年7月12日優先權日:2013年7月12日【發明者】A·蘇萬托,G·H·那塔迪普曲,Y·H·渃司坦申請人:豐益國際有限公司