專利名稱：生產l－蘇氨酸的微生物、生產其的方法、及使用其生產l－蘇氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及具有滅活tyrR基因的微生物、生成該微生物的方法、以及使用該微生物來生產L-蘇氨酸的方法。
背景技術：
L-蘇氨酸是必需氨基酸，而且廣泛用作飼料和食品添加劑，還作為制藥原材料用于合成某些藥物。它已通過埃希氏菌(Escherichia)屬、棒桿菌屬(Coryneform bacteria)、沙雷氏菌屬(Seratia)、和Providencia屬的人工突變體發酵生產。例如，日本專利公開號10037/81公開了一種使用屬于埃希氏菌屬的菌株來生產L-蘇氨酸的方法，所述菌株需要二氨基庚二酸和甲硫氨酸且耐受蘇氨酸生物合成系統的蘇氨酸反饋抑制。日本專利申請公開號224684/83公開了一種使用屬于短桿菌屬(Brevibacterium)的菌株來生產L-蘇氨酸的方法，所述菌株耐受S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和α-氨基-β-羥基戊酸且對L-異亮氨酸和L-賴氨酸具有營養需要。韓國專利申請公開號8022/87公開了一種使用屬于埃希氏菌屬的菌株來生產L-蘇氨酸的方法，所述菌株需要二氨基庚二酸和甲硫氨酸且耐受α-氨基-β-羥基戊酸，并額外耐受至少一種選自由利福平、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、和高絲氨酸組成的組的物質，或者具有降低的分解L-蘇氨酸的能力。日本專利申請公開號219582/90公開了一種使用屬于Providencia屬的菌株來生產L-蘇氨酸的方法，所述菌株耐受α-氨基-β-羥基戊酸、L-乙硫氨酸、硫代異亮氨酸、羥基硫胺素、和磺胺胍且需要L-亮氨酸還對L-異亮氨酸具有滲漏需要。
然而，上述已知方法的缺點在于它們不能提供較高的L-蘇氨酸產量或者具有昂貴的需要諸如二氨基庚二酸和異亮氨酸。換言之，需要二氨基庚二酸的菌株在生產L-蘇氨酸中的用途包括二氨基庚二酸的額外發酵，因而可能增加成本。在使用需要異亮氨酸的菌株來生產L-蘇氨酸時，必需向發酵培養基中添加昂貴的異亮氨酸，從而增加了成本。
在試圖克服這些缺點的嘗試中，本發明人開發了耐受L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸且對甲硫氨酸具有營養需要、對異亮氨酸具有滲漏需要的大腸桿菌L-蘇氨酸生產菌株。他們通過菌株的發酵成功生產了L-蘇氨酸，產量高于先前的菌株。菌株和使用所述菌株來生產L-蘇氨酸的方法公開于韓國專利發布號92-8365。
酪氨酸的氧化性分解有兩條路徑，即分解成富馬酸和乙酰乙酸以及通過酪氨酸酶轉變成3，4-羥基苯乙酸后的分解。在前一種情況中，L-酪氨酸與α-酮戊二酸反應而生成L-谷氨酸和4-羥基苯丙酮酸(Neidhardt FC等人編，Escherichia coli and Salmonellacellularand molecular biology，第2版，ASM出版社，華盛頓特區，1996，第2649-2660頁)。酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成包括轉氨作用。tyrB、aspC、和ilvE基因編碼轉氨作用中一種重要的酶(Ji Yang和JamesPittard，Journal of Bateriology，167，4710-4715，1987)。也就是說，tyrB基因編碼芳香族氨基酸轉氨酶的一個亞基。由tyrB基因編碼的TyrB蛋白質作為亞基在酪氨酸生物合成的第三步和最后一步參與芳香族氨基酸轉氨酶的轉氨作用(Neidhardt FC等人編，Escherichiacoli and Salmonellacellular and molecular biology，第2版，ASM出版社，華盛頓特區，1996，第2649-2660頁)。tyrB基因還具有與aspC基因相似的功能，即參與由草酰乙酸(OAA)合成天冬氨酸(ASP)以及酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成。ASP是L-蘇氨酸生物合成的中間物(Neidhardt FC等人編，《大腸桿菌和沙門氏菌細胞和分子生物學》即Escherichia coli and Salmonellacellular and molecularbiology，第2版，ASM出版社，華盛頓特區，1996，第358-403頁)。
tyrB基因屬于tyrR調節子，并且在轉錄過程中通過由tyrR基因編碼的產物而經歷表達遏制(Ji Yang和James Pittard，Journal ofBateriology，167，4710-4715，1987)。
發明內容
本發明人在常規技術基礎上深入研究而選擇了L-蘇氨酸生產能力得到改進的菌株，現在發現了通過滅活tyrR基因能夠促進L-蘇氨酸生物合成。
發明概述本發明提供了L-蘇氨酸的生物合成能力得到改進的微生物。
本發明還提供了生成該微生物的方法。
本發明還提供了使用該微生物來高效生產L-蘇氨酸的方法。
依照本發明的一個方面，提供了能夠生成L-蘇氨酸且具有滅活tyrR基因的微生物。
依照本發明的另一個方面，提供了生成L-蘇氨酸生產微生物的方法，該方法包括制備滅活tyrR基因或其DNA片段；將滅活tyrR基因或其DNA片段導入能夠生成L-蘇氨酸的微生物以引起與微生物染色體上存在的tyrR基因的重組；并選擇具有滅活tyrR基因的微生物。
依照本發明的另一個方面，提供了生產L-蘇氨酸的方法，該方法包括培養上文所述微生物；并由培養物分離L-蘇氨酸。
通過參照附圖而詳細描述本發明的例示性實施方案，本發明的上述和其它特色和優勢將變得更顯然。
圖1描繪了包含tyrR基因的重組質粒pTblue/tyrR的構建；和圖2描繪了由重組質粒pT7bluetyrR∷loxpCAT構建DNA片段ΔtyrR∷loxpCAT。
發明詳述本發明提供了能夠生成L-蘇氨酸且具有滅活tyrR基因的微生物。
在本發明中，微生物能夠生成L-蘇氨酸，而且包括具有滅活tyrR基因的原核和真核微生物。例如，可以包括屬于埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、Providencia屬、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、和短桿菌屬(Brevibacterium)的菌株。優選的是，微生物屬于腸桿菌科，更優選的是，微生物屬于埃希氏菌屬。最優選的是，微生物是大腸桿菌FTR7624(KCCM-10538)。
同樣，微生物可以包括生產L-蘇氨酸的突變體以及天然微生物。突變體的范例包括屬于耐受L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸且對甲硫氨酸具有營養需要、對異亮氨酸具有滲漏需要的L-蘇氨酸生產大腸桿菌的微生物；和除了內在磷酸烯醇丙酮酸羧酶(ppc)基因以及蘇氨酸操縱子中所含thrA、thrB、和thrC基因以外，染色體DNA中還插入了至少一個拷貝的ppc基因以及蘇氨酸操縱子所含thrA、thrB、和thrC基因的突變微生物。L-甲硫氨酸類似物可以是至少一種選自下組的化合物D，L-乙硫氨酸、正亮氨酸、α-甲基甲硫氨酸、和L-甲硫氨酸-D，L-sulfoxymine。L-蘇氨酸類似物可以是至少一種選自下組的化合物α-氨基-β-羥基戊酸和D，L-蘇氨酸氧肟酸(D，L-threonine hydroxamate)。L-賴氨酸類似物可以是至少一種選自下組的化合物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和δ-甲基-L-賴氨酸。
在本發明中，由tyrR基因編碼的蛋白質抑制編碼TyrB(芳香族氨基酸轉氨酶)的tyrB的轉錄，而后者在酪氨酸生物合成途徑的第三步和最后一步發揮作用。對于大腸桿菌而言，tyrR基因是已知的，而且可以由Blattner等人(Science，277，1453-1462，1997)發表的基因組序列獲得(編號AAC74405)。基因組序列還可以由美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)和日本DNA數據庫(DNA Data Bank of Japan，DDBJ)獲得。tyrR基因還包括通過遺傳密碼衰減或突變而生成的等位基因。“滅活”在用于本文時指不表達有活性的tyrR蛋白質。由此，tyrR基因的滅活導致tyrB基因的表達提高。
可以通過滅活能夠生成L-蘇氨酸的微生物染色體上存在的tyrR基因來生成本發明的微生物。滅活方法可以包括通過光照諸如紫外線或化學藥品引起突變，并由突變體分離具有滅活tyrR基因的菌株。滅活方法還包括DNA重組技術。可以通過例如將與tyrR基因同源的核苷酸序列或包含該核苷酸序列的載體注入微生物以引起同源重組來實現DNA重組。注入的核苷酸序列和載體可以包含顯性選擇標記。
本發明還提供了生成L-蘇氨酸生產微生物的方法，包括制備滅活tyrR基因或其DNA片段；將滅活tyrR基因或其DNA片段導入能夠生成L-蘇氨酸的微生物以引起與微生物染色體上存在的tyrR基因的重組；并選擇具有滅活tyrR基因的微生物。
“滅活tyrR基因或其DNA片段”在用于本文時指與宿主中的tyrR基因具有序列同源性但由于丟失、置換、截短、和倒位而不能表達活性tyrR蛋白質的多核苷酸序列。將滅活tyrR基因或其DNA片段導入宿主細胞可以通過但不限于例如轉化、綴合、轉導、或電穿孔來實現。
在通過轉化將滅活tyrR基因或其DNA片段導入宿主細胞時，滅活流程可以通過混合多核苷酸序列與菌株的培養物來進行。雖然菌株天然勝任待轉化DNA的攝取，但是優選預先通過任何合適方法使得菌株勝任DNA攝取(參閱例如LeBlanc等人，Plasmid，28，130-145，1992；Pozzi等人，J.Bacteriol.，178，6087-6090，1996)。滅活tyrR基因或其DNA片段具有導入基因組DNA片段的外源DNA片段，并且用滅活狀態替換野生型染色體拷貝的序列。在本發明的一個實施方案中，滅活多核苷酸序列所包含的“尾部”包含其5’和3’端的靶位點DNA的一部分。尾部應當是至少50個堿基對，而且為了有效重組和/或基因轉換優選超過200-500個堿基對。為了方便，滅活多核苷酸序列可以包含選擇標記，例如抗生素抗性基因。在用抗生素抗性基因切斷靶DNA后，在含適當水平的合適抗生素的瓊脂板上進行對轉化子的選擇。轉化后，導入宿主細胞的滅活多核苷酸序列與基因組DNA尾部發生同源重組，導致野生型基因組序列的滅活。滅活重組事件易于通過例如Southern印跡來確認，或者通過更加方便的聚合酶鏈式反應(PCR)確認。
在本發明的一個實施方案中，生成本發明的L-蘇氨酸生產微生物的方法包括下列流程。
首先，由能夠生成L-蘇氨酸的菌株分離基因組DNA，并使用它作為模板通過常規技術進行PCR以擴增tyrR基因。
接著，將得到的tyrR基因克隆到合適的質粒或其它載體中。通過轉導將重組載體導入宿主細胞，諸如大腸桿菌。在培養轉化子并分離細胞后，提取具有tyrR基因的重組載體。然后將抗生素抗性基因片段插入提取的重組載體的tyrR基因以形成具有滅活tyrR基因的重組載體。通過轉化將該重組載體導入宿主細胞，并在合適的培養基中培養宿主細胞。然后，由產生的轉化子分離繁殖的重組載體，并通過合適的限制酶消化獲得具有滅活tyrR基因的多核苷酸序列。此后，通過常規技術諸如電穿孔將該多核苷酸序列導入能夠生成L-蘇氨酸的宿主。選擇具有抗生素抗性的微生物以分離具有滅活tyrR基因的微生物。
熟練技術人員將認識到，本發明的滅活多核苷酸序列可以通過常規克隆方法來生成。例如，可以使用靶向tyrR基因的寡核苷酸引物的PCR擴增方法。PCR擴增方法在本領域是眾所周知的(參閱如PCR ProtocolsA Guide to Method and Application，M.Innis等人編，Academic出版社，1990)。PCR包括基因組DNA、合適的酶、引物、和緩沖液，而且可以在DNA熱循環儀(Perkin Elmer Cetus，諾沃克，康涅狄格州，美國)中方便的進行。通過例如在瓊脂糖凝膠電泳后檢測合適大小的DNA片段來確定陽性PCR結果。
在本發明的一個實施方案中，制備了重組質粒pT7blue/tyrR和pT7bluetyrR∷loxpCAT，并由它們獲得了滅活多核苷酸序列ΔtyrR∷loxpKAN。然后，通過電穿孔用滅活多核苷酸序列ΔtyrR∷loxpKAN轉化大腸桿菌菌株即大腸桿菌編號KCCM 10236，所述菌株耐受L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸且對甲硫氨酸具有營養需要、對異亮氨酸具有滲漏需要。結果是，野生型tyrR基因得到滅活而生成能夠比原型菌株生成更高濃度L-蘇氨酸的三類新菌株。將新菌株命名為大腸桿菌FTR7624，而且根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)于2003年12月4日保藏于韓國微生物培養物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms)，保藏號KCCM-10538。
大腸桿菌FTR7624衍生自大腸桿菌編號KCCM 10236，后者又衍生自大腸桿菌TF4076。大腸桿菌TF4076(KFCC10718)需要甲硫氨酸且耐受蘇氨酸類似物(例如α-氨基-β-羥基戊酸，AHV)、賴氨酸類似物(例如S-(2-氨基乙基-L-半胱氨酸，AEC)、異亮氨酸類似物(例如α-氨基丁酸)、甲硫氨酸類似物(例如乙硫氨酸)、諸如此類。大腸桿菌編號KCCMTF4076描述于韓國專利公開號92-8365(其全文結合于此作為參考)。磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是草酰乙酸的前體，它是L-蘇氨酸生物合成途徑的中間體。通過PCR擴增源自大腸桿菌編號KCCM TF4076染色體的ppc基因和蘇氨酸操縱子，并額外整合到大腸桿菌編號KCCM TF4076的染色體中以生成大腸桿菌編號KCCM 10236。由此，大腸桿菌編號KCCM10236具有兩個ppc基因和兩個蘇氨酸操縱子。因此，大腸桿菌編號KCCM10236能夠以更高水平表達催化PEP形成草酰乙酸的ppc基因和由天冬氨酸生物合成蘇氨酸所必需的酶(thrA天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶，thrB高絲氨酸激酶，thrC蘇氨酸合酶)，從而能夠提高L-蘇氨酸產量。
本發明還提供了生產L-蘇氨酸的方法，包括培養能夠生成L-蘇氨酸且具有滅活tyrR基因的微生物；并由培養物分離L-蘇氨酸。
在L-蘇氨酸的生產方法中，可以在本領域知道的合適培養基中在合適培養條件下進行培養，而且本領域熟練技術人員可以根據選擇的菌株類型容易的進行調整。可以通過分批操作、連續操作、或補料—分批操作進行培養(參閱如“Biochemical Engineering”，James M.Lee著，Prentice-Hall International Editions，第138-176頁)。
根據選擇的菌株，培養基應當完全達到要求。文獻中公開了多種培養基(參閱如“Manual of Methods for General Bacteriology”，美國細菌學學會，華盛頓特區，美國，1981)。培養基包括碳源、氮源、和痕量成分。碳源的實例包括碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖(moltose)、淀粉、纖維素；脂肪，諸如大豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油；脂肪酸，諸如棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸；醇類，諸如甘油和乙醇；以及有機酸，諸如醋酸。這些碳源可以單獨或聯合使用。氮源的實例包括有機物，諸如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、玉米漿(CSL)、和大豆；以及無機物，諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、和硝酸銨。這些氮源可以單獨或聯合使用。在培養基中可以包括磷酸源，諸如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、和相應的鈉鹽。同樣，培養基可以包括金屬鹽類，諸如硫酸鎂或硫酸亞鐵。另外，可以包括氨基酸、維生素、和合適前體。培養基或前體可以以分批或連續方式添加到培養物中。
在培養過程中向培養物中適當添加氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸或硫酸、等以調節培養物的pH。同樣，向培養物中添加消泡劑諸如脂肪酸聚乙二醇酯以預防泡沫形成。通過向培養物中注入氧氣或含氧氣體(如空氣)而在有氧條件下進行培養。培養溫度處于20-45℃范圍內，優選25-40℃。可以繼續培養直至獲得期望數量的L-蘇氨酸，優選10-160小時。
可以通過本領域知道的常規方法由培養物分離L-蘇氨酸。分離方法包括離心、過濾、離子交換層析、和結晶等。例如，可以將培養物低速離心以除去生物量而得到上清液，并通過離子交換層析進一步分離。
下面將通過實施例更加具體的描述本發明。但是，提供下列實施例只是為了舉例說明，因此本發明并不限于此或由此而受到限制。
具體實施例方式
實施例實施例1重組質粒的構建和tyrR基因的敲除在此實施例中，通過同源重組敲除了大腸桿菌染色體中的tyrR基因。為此，制備了包含部分tyrR基因的載體，然后轉化到大腸桿菌宿主細胞中，隨后選擇具有tyrR基因敲除的菌株。
使用QIAGEN Genomic-tip System由L-蘇氨酸生產大腸桿菌菌株編號KCCM 10236提取基因組DNA。使用提取的基因組DNA作為模板，通過PCR擴增包含tyrR基因ORF(開放讀碼框)的DNA片段(大約1.7kb)。所用引物是一對寡核苷酸(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。PCR進行30個循環，每個循環依次包括于94℃變性30秒、于60℃退火30秒、并于72℃延伸90秒。
將PCR產物施加到1.0％瓊脂糖凝膠上并進行電泳。由1.7kb tyrR基因條帶純化DNA。于16℃過夜，將純化的DNA連接到克隆載體pT7Blue(Novagen公司，美國)的EcoR V位點中，以構建重組質粒pT7Blue/tyrR(見圖1)。將由此產生的質粒構建體轉化到大腸桿菌NM522中。將轉化菌株涂布在含50mg/L羧芐青霉素的固體培養基上，并于37℃培養過夜。
用鉑絲接種環挑取形成的菌落，并接種3ml含羧芐青霉素的液體LB培養基。培養過夜后，使用QIAGEN Mini Prep Kit由培養物提取質粒DNA。用限制酶Xmn I消化質粒DNA提取物，并確認tyrR基因得到克隆。用限制酶Xmn I切割得到確認的質粒pT7Blue/tyrR，并由0.8％瓊脂糖凝膠上大約4.6kb的條帶純化DNA。將純化的DNA平端連接包含loxp區的氯霉素抗性基因的大約1.2kb片段，它是通過用Hinc II限制酶消化質粒ploxpCAT2(U.Guldenre等人，Nucleic Acid Research，24(13)，2519-2524，1996)得到的，從而構建大約5.8kb的重組質粒pT7ΔtyrR∷loxpCAT(見圖2)。
用重組質粒pT7ΔtyrR∷loxpCAT轉化大腸桿菌NM522。將由此產生的轉化子在含50mg/L羧芐青霉素和50mg/L氯霉素的固體LB培養基平板上劃線，并于32℃培養過夜。用鉑絲接種環挑取形成的菌落，并接種3ml含羧芐青霉素和氯霉素的液體LB培養基。培養過夜后，使用QIAGENMini Prep Kit提取質粒DNA。使用提取的質粒DNA作為模板，通過PCR擴增包含tyrR基因ORF和loxpCAT位點的DNA片段(大約2.9kb)。所用引物是一對寡核苷酸(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。PCR進行30個循環，每個循環依次包括于94℃變性30秒、于60℃退火30秒、并于72℃延伸60秒。
通過電穿孔將由此產生的DNA片段ΔtyrR∷loxpCAT轉化到L-蘇氨酸生產大腸桿菌菌株編號KCCM 10236中，并將由此產生的轉化子在含氯霉素的固體LB培養基上劃線以選擇具有tyrR基因敲除的菌落。對選擇的菌落測試它們在搖瓶培養物中的L-蘇氨酸產量。
實施例2錐形瓶中使用選擇菌株的L-蘇氨酸產量在裝有下文表1所列蘇氨酸滴定培養基的錐形瓶中培養實施例1中選擇的30個菌落，并比較L-蘇氨酸產量。
表1蘇氨酸滴定培養基
將每個菌落在LB固體培養基上在32℃溫箱中培養過夜。然后，將一鉑絲環培養物接種25ml滴定培養基，并于32℃以250rpm培養48小時。
通過高效液相層析(HPLC)分析來自培養物的L-蘇氨酸。下文表2列出了分析結果。可以由結果看出，原型菌株編號KCCM 10236生成23g/LL-蘇氨酸，而本發明中敲除了tyrR基因的大腸桿菌FTR7624生成26g/LL-蘇氨酸。因此，觀察到該轉化微生物將L-蘇氨酸產量與原型菌株相比提高了大約8％。選擇的大腸桿菌FTR7624于2003年12月4日保藏于韓國微生物培養物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)，編號KCCM-10538。
表2菌株的搖瓶滴定測試結果
通過實施例證明，微生物的L-蘇氨酸生物合成能力通過tyrR基因的敲除得到了改進。這可能是因為tyrB基因的表達通過tyrR基因的敲除得到提高，從而提高天冬氨酸(APP)的供應速率，而它是L-蘇氨酸生物合成的中間體。然而，微生物生產力的改進并非只是基于這種機制。
如上所述，本發明具有滅活tyrR基因的微生物可以通過發酵高產率地生產L-蘇氨酸。
同樣，依照本發明的L-蘇氨酸生產方法，可以生產高產率的L-蘇氨酸。
盡管已經參照本發明的例示性實施方案而具體顯示并描述了本發明，本領域普通技術人員可以理解，在為脫離由后附的權利要求定義的本發明的精神和范圍條件下，其中的形式和細節可以進行多種變化。
IA050587-序列表<110>CJ株式會社<120>生產L-蘇氨酸的微生物、生產其的方法、及使用其生產L-蘇氨酸的方法<130>PN052459<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1gcccgctgcc gtggattgac gat 23<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2agtttgcgcg tgctgggata attg 2權利要求
1.一種微生物，其能夠生成L-蘇氨酸且具有滅活tyrR基因。
2.權利要求1的微生物，它屬于腸桿菌科。
3.權利要求2的微生物，它是大腸桿菌。
4.權利要求3的微生物，其中大腸桿菌耐受L-甲硫氨酸，L-蘇氨酸和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸，而且對甲硫氨酸具有營養需要，對異亮氨酸具有滲漏需要。
5.權利要求4的微生物，其中L-甲硫氨酸類似物是D，L-乙硫氨酸，正亮氨酸，α-甲基甲硫氨酸或L-甲硫氨酸-D，L-sulfoxymine。
6.權利要求4的微生物，其中L-蘇氨酸類似物是α-氨基-β-羥基戊酸或D，L-蘇氨酸氧肟酸。
7.權利要求4的微生物，其中L-賴氨酸類似物是S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸或δ-甲基-L-賴氨酸。
8.權利要求1的微生物，其中除了內在ppc基因及thrA，thrB，和thrC基因以外，將至少一個拷貝的磷酸烯醇丙酮酸羧酶(ppc)基因及thrA，thrB和thrC基因插入染色體DNA中。
9.權利要求1的微生物，它是大腸桿菌FTR7624(KCCM-10538)。
10.一種生成L-蘇氨酸生產微生物的方法，該方法包括制備滅活tyrR基因或其DNA片段；將滅活tyrR基因或其DNA片段導入能夠生成L-蘇氨酸的微生物以引起與所述微生物染色體上存在的tyrR基因的重組；和選擇具有滅活tyrR基因的微生物。
11.權利要求10的方法，其中滅活tyrR基因或其DNA片段是通過將含抗生素標記(loxpKAN)的盒插入tyrR基因而制備的。
12.一種生產L-蘇氨酸的方法，包括培養依照權利要求1-9任一項的微生物；和由培養物分離L-蘇氨酸。
全文摘要
本發明提供了能夠生成L－蘇氨酸且具有滅活tyrR基因的微生物、生成該微生物的方法、以及使用該微生物來生產L－蘇氨酸的方法。該微生物可用于高產率生產L－蘇氨酸。
文檔編號C07K14/195GK1654624SQ200510007928
公開日2005年8月17日 申請日期2005年2月5日 優先權日2004年2月5日
發明者樸英薰, 李炳春, 樸宰鏞, 趙光命, 申容旭 申請人:Cj株式會社