一種提高Vγ9Vδ2T細胞擴增效率及活性的培養方法
【專利摘要】本發明提供一種提高Vγ9Vδ2T細胞擴增效率及活性的培養方法，應用IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼體外誘導Vγ9Vδ2T細胞的生成，得到了誘導效率更高及活性更高的Vγ9Vδ2T細胞本發明方法誘導培養過程簡單易行，周期短，成本低廉；誘導效率高，重復性好；誘導后得到的細胞活性增強，誘導培養后細胞數量和功能有望提高目前Vγ9Vδ2T細胞免疫治療腫瘤的療效，具有很好的應用潛能。
【專利說明】—種提高V Y 9V S 2T細胞擴增效率及活性的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫學與與細胞生物學研究領域，涉及一種提高細胞擴增效率及活性的體外誘導培養方法，是應用細胞因子聯合酪氨酸激酶抑制劑協同誘導V Y 9V S 2T細胞生成的培養方法。
【背景技術】 [0002]y 6 T細胞是近年來倍受關注的具有獨特的結構和生物學功能的T淋巴細胞亞群，雖然在外周血和淋巴器官中所占比例很小(1_5%)，但其在機體抗感染和抗腫瘤等方面起著舉足輕重的作用。VY9VS2T細胞是Y S T細胞的重要亞群，占外周Y S T細胞的5(T70%。自從Kunzmann等首次發現Vy 9V S 2T細胞能夠大量擴增后，越多越多的學者開始致力于該類細胞群體的研究。已在體外實驗和體內動物實驗中已證實V Y 9V S 2T細胞具有廣泛的腫瘤殺傷潛能；與傳統的a P T細胞不同，其殺傷腫瘤作用不受MHC限制，極大的拓寬了其應用。目前Vy 9V S 2T細胞免疫治療已在多項實體瘤及血液系統惡性腫瘤等I期和II期臨床研究中初具療效，安全性好，使很多患者從中受益。
[0003]細胞免疫抗腫瘤治療需要有充足的細胞來源,雖然通過目前的方法，通過人工合成的磷酸化合物或氨基二碳磷酸鹽化合物(Aminobisphosphonates, NBPs)類藥物可在體外或體內對V Y 9V S 2T細胞進行大量擴增。但為保證V Y 9V S 2T細胞治療理想的效靶比，仍有必要對目前的誘導方案進行優化。此外，目前誘導所得Vy 9V S 2T細胞的殺傷腫瘤效率不盡如人意，制約了 V Y 9V S 2T細胞免疫治療療效。通過聯合藥物提高目前V Y 9V S 2T細胞的體外誘導擴增效率及活性是Vy 9V S 2T細胞免疫治療研究的熱點。如能克服目前面臨的主要障礙，將使V Y 9V S 2 T細胞腫瘤免疫治療從真正意義上取得成功。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是克服現有方案中V Y 9V S 2T細胞誘導擴增效率及活性有限的缺點，提供一種提高細胞擴增效率及活性的培養方法，為進一步提高V Y 9V S 2T細胞為基礎的抗腫瘤免疫治療療效提供支持。本發明通過以下步驟實現:
1、人單個核細胞制備:取外周血標本，肝素抗凝，應用人淋巴細胞分離液分離制備外周血單個核細胞，用含10%胎牛血清完全RPMI 1640培養液重懸細胞；
2>Vy9V62T細胞誘導:步驟I中所制備的單個核細胞接種當日按第0天計算，在第0天加入唑睞膦酸2.24umol/L及IL-2 250 IU/ml刺激V y 9V 6 2T細胞擴增，在第I天加入達沙替尼lOnmol/L，接著于第3、6、9、12、15、18天進行半量換液，每次換液時加入新鮮IL-2及達沙替尼，濃度同前；
3、Vy9VS 2T細胞擴增效率檢測:于第9、12、15、18天時檢測Vy 9V S 2T細胞的擴增效率(包括純度及絕對數量檢測):收集步驟2中的細胞，采用流式細胞術檢測V Y 9V S 2T細胞的純度，以TCRV S 2陽性作為VY 9V S 2T細胞的表型特征，計算Vy 9V S 2T細胞占外周血單個核細胞的百分含量；采用細胞計數儀檢測活細胞密度，并根據以下公式計算V Y 9V S 2T細胞的絕對數量:
Vy 9V 6 2T細胞絕對數量=V Y 9V S 2T細胞純度X活細胞密度X總體積；
4、誘導的VY 9V S 2T細胞表面活化分子及死亡受體檢測:于第18天收集步驟2中的細胞，采用流式細胞術檢測V Y 9V S 2T細胞表面活化分子⑶69、HLA-DR及死亡受體Fas分子表達的比例，以TCRV 6 2陽性作為V Y 9V S 2T細胞的表型特征，計算公式為:
Vy 9V 8 2T 細胞 CD69/HLA-DR/ Fas 表達(％)= CD69/HLA_DR/Fas 和 TCRV 8 2 雙陽性細胞/ TCRV 8 2單陽性細胞X 100 ；
5、誘導的Vy9V S 2T細胞效應型亞群比例檢測:于第18天收集步驟2中的細胞，采用流式細胞術檢測V Y 9V S 2T細胞的功能亞型分布，以TCRV 6 2陽性作為V Y 9V S 2T細胞的表型特征，以CD27分子為區分效應型亞群的表型特征，計算公式為:
Vy 9V 8 2T細胞效應型亞群比例(%)= CD27陰性TCRV 8 2陽性細胞/ TCRV 8 2單陽性細胞XlOO ；
6、誘導的Vy9V S 2T細胞對腫瘤細胞的的穿孔素、顆粒酶釋放效應檢測:于第18天收集步驟2中的細胞，采用流式細胞術檢測V Y 9V S 2T細胞與急性髓系白血病(AML)細胞株K562共同孵育4個小時后檢測V Y 9V S 2T細胞對AML細胞刺激的穿孔素、顆粒酶釋放效應，以TCRV 6 2陽性作為V Y 9V S 2T細胞的表型特征，以⑶107a分子陽性作為穿孔素、顆粒酶釋放效應的檢測標記，計算公式為:
VY 9V S 2T細胞穿孔素、顆粒酶釋放效應(％)=⑶107a和TCRV S 2雙陽性細胞/TCRV 8 2單陽性細胞X 100 ；
7、誘導的Vy9V S 2T細胞IFN-Y細胞因子分泌能力檢測:于第18天收集步驟2中的細胞，采用流式細胞術檢測V Y 9V S` 2T細胞在PMA/離子霉素刺激4個小時后檢測V Y 9V S 2T細胞干擾素-Y (IFN- y )細胞因子的分泌能力，以TCRV 6 2陽性作為V Y 9V S 2T細胞的表型特征，以胞內IFN- y分子陽性作為V Y 9V S 2T細胞分泌IFN- y細胞因子的檢測標記，計算公式為:
Vy 9V 8 2T細胞IFN- y分泌能力(％) =IFN- y和TCRV 8 2雙陽性細胞/ TCRV 8 2單陽性細胞X 100。
[0005]本發明的另一個目的是提供所述方法在體外誘導培養V y 9V 6 2T細胞中的應用。
[0006]本發明通過應用IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼體外誘導
VY 9V 6 2T細胞的生成，得到了誘導效率更高及活性更高的V Y 9V S 2T細胞。其具有如下特點:(I)誘導培養過程簡單易行，周期短，成本低廉；(2)誘導效率高，重復性好；(3)誘導后得到的細胞活性增強，誘導培養后細胞數量和功能有望提高目前V Y 9V S 2T細胞免疫治療腫瘤的療效，具有很好的應用潛能。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]圖1是IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼的改進方法誘導組和單用IL-2及唑來膦酸的常規方法誘導組在誘導過程第9、12、15、18天V Y 9V S 2T細胞純度比較圖。
[0008]圖2是IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼的改進方法誘導組和單用IL-2及唑來膦酸的常規方法誘導組第18天V Y 9V S 2T細胞純度比較的統計分析圖。[0009]圖3是IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼的改進方法誘導組和單用IL-2及唑來膦酸的常規方法誘導組在誘導過程第9、12、15、18天V Y 9V S 2T細胞絕對數量比較圖。
[0010]圖4是IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼的改進方法誘導組和單用IL-2及唑來膦酸的常規方法誘導組第18天V Y 9V S 2T細胞絕對數量比較的統計分析圖，*表不 P〈0.05。
[0011]圖5是IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼的改進方法誘導組和單用IL-2及唑來膦酸的常規方法誘導組活化分子CD69表達水平比較的統計分析圖，*表示P〈0.05。
[0012]圖6是IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼的改進方法誘導組和單用IL-2及唑來膦酸的常規方法誘導組活化分子HLA-DR表達水平比較的統計分析圖，*表示P〈0.05。
[0013]圖7是IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼的改進方法誘導組和單用IL-2及唑來膦酸的常規方法誘導組死亡受體Fas表達水平比較的統計分析圖，*表示P〈0.05。
[0014]圖8是IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼的改進方法誘導組和單用IL-2及唑來膦酸的常規方法誘導組⑶27陰性效應型亞群比例比較的統計分析圖，*表示P〈0.05。
[0015]圖9是IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼的改進方法誘導組和單用IL-2及唑來膦酸的常規方法誘導組V Y 9V S 2T細胞的穿孔素、顆粒酶釋放效應比較的統計分析圖，*表示P〈0.05。
`[0016]圖10是IL-2、唑來膦酸聯合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼的改進方法誘導組和單用IL-2及唑來膦酸的常規方法誘導組V Y 9V S 2T細胞IFN- y細胞因子分泌能力比較的統計分析圖，*表示P〈0.05。
【具體實施方式】
[0017]本發明結合實施例和附圖作進一步的說明。
[0018]本實驗所用IL-2購自美國PeproTech公司，流式細胞術檢測用單克隆熒光抗體購自BDdBioscience公司，唑睞膦酸(商品名擇泰)為諾華制藥有限公司贈送，達沙替尼購自施貴寶公司。本實驗所用外周血均來自商業血庫。
[0019]本實驗重復了 5份血庫的外周血標本，均取得了類似效果。
[0020]實施例1:人單個核細胞制備:
1.取外周血標本IOml,肝素抗凝；
2.在15ml離心管中加入5ml淋巴細胞分離液；
3.將10ml外周血與等量Hank’s液充分混勻，按淋巴細胞分離液的兩倍體積用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面，水平離心600gX20分鐘；
4.離心后見管內分為三層，上層為血漿和Hank’s液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶；
5.用滴管插到云霧層，吸取單個核細胞，置入另一15ml離心管中，加入5倍體積的Hank’s液，300gX5分鐘離心,洗漆細胞2次；
6.末次離心后，棄上清，加入含有10%胎牛血清和1%雙抗的完全RPMI1640培養液，重懸細胞，調整細胞密度至4X 106/ml。
[0021]實施例2:單個核細胞分組及V Y 9V S 2T細胞誘導
將實施例1中所獲得的細胞接種于12孔板，分為常規方法誘導組和改進方法誘導組，常規方法誘導組為單用白介素-2 (IL-2)和唑來膦酸誘導，改進方法誘導組為IL-2、唑來膦酸聯合lOnmol/L達沙替尼協同誘導。各組分別設立3個復孔，每孔2ml，各孔于第0天加用IL-2和唑睞膦酸(制備單個核細胞接種當日按第0天計算)，量及終濃度如表1所示；改進方法誘導組各孔于第I天加用達沙替尼，量如表1所示，終濃度為lOnmol/L ;接著于第3、
6、9天兩組細胞各孔均進行半量換液，每孔去除Iml培養液，再加入新鮮含10%胎牛血清的PRMI 1640完全培養液1ml，并加入IL-2，各孔IL-2量見表2。各種試劑儲存濃度:IL_2為10000U/ml，唑睞膦酸儲存濃度為280umol/L，達沙替尼儲存濃度為20umol/L。
【權利要求】
1.一種提高V Y 9V S 2T細胞擴增效率及活性的培養方法，其特征在于，通過以下步驟實現: (1)人單個核細胞制備:應用人淋巴細胞分離液分離制備外周血單個核細胞，用含10%胎牛血清完全RPMI 1640培養液重懸細胞； (2)Vy9V62T細胞誘導:步驟(1)中所制備的單個核細胞接種當日按第0天計算，在第0天加入唑睞膦酸及IL-2，在第I天加入達沙替尼，接著于第3、6、9、12、15、18天進行半量換液，每次換液時加入新鮮IL-2及達沙替尼； (3)Vy9VS2T細胞擴增效率檢測:于第9、12、15、18天收集步驟(2)中的細胞，采用流式細胞術檢測V Y 9V S 2T細胞的純度，以TCRV 6 2陽性作為V Y 9V S 2T細胞的表型特征，計算V y9V S 2T細胞占外周血單個核細胞的百分含量；采用細胞計數儀檢測活細胞密度，并根據以下公式計算V Y 9V S 2T細胞的絕對數量: Vy 9V 6 2T細胞絕對數量=V Y 9V S 2T細胞純度X活細胞密度X總體積； (4)誘導的Vy9V S 2T細胞表面活化分子及死亡受體檢測:于第18天收集步驟(2)中的細胞，采用流式細胞術檢測V Y 9V S 2T細胞表面活化分子⑶69、HLA-DR及死亡受體Fas分子表達的比例，以TCRV 6 2陽性作為V Y 9V S 2T細胞的表型特征，計算公式為:
Vy 9V 8 2T 細胞 CD69/HLA-DR/ Fas 表達(％)= CD69/HLA_DR/Fas 和 TCRV 8 2 雙陽性細胞/ TCRV 8 2單陽性細胞X 100 ； (5)誘導的Vy9V S 2T細胞效應型亞群比例檢測:于第18天收集步驟(2)中的細胞，采用流式細胞術檢測V Y 9V S 2T細胞的功能亞型分布，以TCRV 6 2陽性作為V Y 9V S 2T細胞的表型特征，以CD27分子為區分效應型亞群的表型特征，計算公式為:
Vy 9V 8 2T細胞效應型亞群比例(%)= CD27陰性TCRV 8 2陽性細胞/ TCRV 8 2單陽性細胞XlOO ； (6)誘導的VY 9V 8 2T細胞對腫瘤細胞的的穿孔素、顆粒酶釋放效應檢測:于第18天收集步驟(2)中的細胞，采用流式細胞術檢測V Y 9V S 2T細胞與急性髓系白血病細胞株K562共同孵育4個小時后檢測V Y 9V S 2T細胞對AML細胞刺激的穿孔素、顆粒酶釋放效應，以TCRV S 2陽性作為V Y 9V S 2T細胞的表型特征，以CD107a分子陽性作為穿孔素、顆粒酶釋放效應的檢測標記，計算公式為: VY 9V S 2T細胞穿孔素、顆粒酶釋放效應(％)=⑶107a和TCRV S 2雙陽性細胞/TCRV 8 2單陽性細胞X 100 ； (7)誘導的Vy9V S 2T細胞干擾素-Y細胞因子分泌能力檢測:于第18天收集步驟(2)中的細胞，采用流式細胞術檢測V Y 9V S 2T細胞在PMA/離子霉素刺激4個小時后檢測Vy 9V 6 2T細胞干擾素-Y細胞因子的分泌能力，以TCRV 6 2陽性作為V Y 9V S 2T細胞的表型特征，以胞內干擾素-Y分子陽性作為Vy 9V S 2T細胞分泌干擾素-Y細胞因子的檢測標記，計算公式為: Vy 9V 8 2T細胞IFN- y分泌能力(％)=干擾素_ Y和TCRV 8 2雙陽性細胞/ TCRV 8 2單陽性細胞X 100。
2.根據權利要求1所述的一種提高VY 9V 6 2T細胞擴增效率及活性的培養方法在體外誘導培養V Y 9V S 2T細胞中的應用。
【文檔編號】C12N5/0783GK103555666SQ201310299928
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年7月17日 優先權日:2013年7月17日
【發明者】黃河, 吳康妮, 胡永仙, 盛立霞 申請人:浙江大學