人乳頭瘤病毒核酸檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于診斷人乳頭瘤病毒(HPV)感染的檢測方法，以及利用該方法制成的試劑盒檢測患者體內分離出的DNA樣本中HPV基因型以診斷其是否屬于所述24個型中的某一型。屬于生命科學和【技術領域】。本發明的方法包括一個以PCR為技術基礎聚合酶鏈式反應(PCR)，包含針對多種型別的熒光標記的上游引物和未標記簡并下游引物，在特定PCR條件下可在一個反應管中同時檢測HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4和cp8304等24種型的DNA，毛細管變性凝膠電泳后利用測序儀讀取數據，利用提供的軟件直接將其分為具體的型。
【專利說明】人乳頭瘤病毒核酸檢測方法和試劑盒
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及一種用于診斷人乳頭瘤病毒（HPV)感染的檢測方法，以及利用該方法 制成的試劑盒檢測患者體內分離出的DNA樣本中HPV基因型以診斷其是否屬于所述24個 型中的某一型。屬于生命科學和【技術領域】。
【背景技術】：
[0002] 由于感染HPV是引起子宮頸癌的一大原因，所以現在這一研究已成為子宮頸癌預 防的前沿學科。在西方工業化國家，對于所有的惡性腫瘤疾病，子宮頸癌也許是公共預防措 施做得最好的例子。
[0003] 子宮頸癌是婦女中最常見的惡性腫瘤，主要發生于多產婦女的早期絕經期。每年 全世界有約19萬人死于子宮頸癌，而其中超過3/4的死亡發生在發展中國家。子宮頸癌的 發生率在所有癌癥中排名第七，而在婦女中排名第三，僅次于乳腺癌和大腸癌。在發展中 國家，少于50 %的患子宮頸癌的婦女能存活5年以上，而在發達國家，5年存活率是66 %左 右。
[0004] 在過去的10年中，估計全世界每年有將近371000例新的侵入性子宮頸癌，占到整 個婦女癌癥的10%。子宮頸癌高發病區主要位于中南美洲、南非、東非和加勒比地區，這些 地區每年的平均發病率達到萬分之四。東歐和北美的發病率低于每年萬分之三，但在巴西 東北部，發病率要比北美高10倍，一生中累積風險性可高達10%。
[0005] 現有子宮頸癌的篩查技術可分兩類，基于形態學的方法是在細胞或組織水平檢查 以識別不正常，基于分子生物學的方法是檢查子宮頸上皮瘤的子宮頸癌的標志物。進一步 區分這些方法可根據他們釋放借助于顯微鏡或物理和電光學的特性。表1總結了當前各種 子宮頸癌篩查的方法，而其中最關聯或最有先兆的方法總結在如下幾節。
[0006] Pap細胞學：Pap檢測是最早的癌癥檢測方法之一，毫無疑問，它同時也是現代醫 學中最有成效的一種方法。Pap檢測主要是檢查子宮頸癌先兆，通過重復檢測，可以密切監 測可疑的或低度異常，或提議病人立即進行陰道鏡、細胞切片檢查，并對高度或嚴重的損害 進行治療。通過Pap檢測預防侵入性子宮頸癌，可在它還只是上皮組織時就阻止其惡性發 展。
[0007] 薄層液相為基礎的細胞學：ThinPrepTM和Autocyte Prep系統是兩種基于液體的 用于代替傳統Pap涂片的制片方法。從子宮頸取得的樣本被溶于細胞保存液而不是直接涂 在玻璃片上。通過這種方法幾乎所有的細胞都可給予檢測。在傳統Pap涂片法中，約20% 從子宮頸收集的細胞會被置于玻璃片上，而在薄層樣本中，多余的血細胞和炎癥細胞會被 裂解，而含有約50000細胞的隨機樣本會由自動細胞處理機轉移到玻璃片，并形成一薄層 涂片，這涂片經染色后由細胞技術員進行檢查。這種自動的薄層技術可以使涂片更清晰、均 一，并且沒有血細胞、炎癥細胞碎片和細胞集落這些影響顯微鏡檢測的因子，從而提高對非 典型細胞、癌癥先兆和癌癥的檢出率。
[0008] 自動化細胞學：自動化的系統正處于測試和市場推廣的階段。這些系統包括一種 能自動把子宮頸癌細胞懸浮液制成標準薄層玻璃片的裝置，及通過計算機輔助掃描來首先 發現不正常細胞，并把這些涂片分離處理以便作進一步的人工細胞學檢測。這些方法最關 鍵的優點是可減輕因缺乏合格的細胞學家而引起的人員緊張。現在在北美和歐洲，有許多 私人公司贊助的比較性實驗正在驗證這些自動化機器的篩查效率和經濟效益。
[0009] 醋酸法目視篩查（VIA):在低收入國家，目查法已成為一種技術要求低、能代替細 胞學篩查的方法。這些目查法包括直接檢查子宮頸，借助醋酸的目查法（也稱為直接目查 DVI，子宮鏡和輔助目查），低倍鏡醋酸目查（VIAM)，Lugol' s碘酒目查法（VILI)和子宮頸 圖像。
[0010] 篩查中檢查HPV :目前研究人員正在比較HPV檢測與Pap檢測作為子宮頸癌篩查 方法的優缺點。由于HPV難以進行體外培養，而且不是所有的感染者都有可檢測的抗體反 應。因此，HPVDNA的檢測是非介入式檢測HPV感染最好方法。目前HPV檢測的方法主要有 三類：
[0011] 第一類是直接探針結合，如southern印跡和點印跡，原位雜交過濾法等。這些方 法普遍存在靈敏度低，操作繁瑣等缺點。
[0012] 第二類是信號放大法，大多數的研究所采用的是唯一經FDA批準的Digene的第一 和第二代Hybrid Capture(HC)系統。另一些用不同的PCR方法來檢測HPV。相比于HC法， PCR的檢測靈敏度更高，但第二代HC2的檢測靈敏度已大大提高，接近于PCR的水平。HC2 檢查是通過微孔板化學發光信號擴增的核酸雜交技術，定性檢查子宮頸樣本中高危HPV病 毒，這些病毒通常與子宮頸癌有聯系，它們是：16、18、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。
[0013] 第三類是基于PCR的把序列片段擴增，PCR方法是用型別特異或通用引物擴增目 標片段并與特異性探針雜交。實時定量PCR(real-time quantitative PCR)技術便是一種 具有革命性意義的定量PCR技術，所謂實時定量PCR是指在PCR指數擴增期間通過連續監 測熒光信號強弱的變化來M：測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量。實時 PCR技術較之與以前的以終點法進行定量的PCR技術具有無與倫比的優勢。首先，它不僅操 作簡便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴 增并進行實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴增后進行操作。另外，它還可以 通過不同的引物設計在同一反應體系中同時對多個靶基因分子進行擴增，即多重擴增。
[0014] 基于多重PCR技術所進行的分型技術有多種，包括：水解探針或Taqman探針、膜 雜交、懸浮芯片等。相比較于水解探針或Taqman探針、膜雜交、懸浮芯片等具有分析靈敏度 高等優點，缺點在于價格昂貴。本發明在使用熒光標記引物的基礎上，通過優化引物序列和 PCR反應體系，使用電泳后讀取熒光的技術同樣達到準確檢測的目的。
[0015] 目前進行HPV分型檢測的產品有
[0016] 1.上海之江生物科技有限公司的高危型人乳頭瘤病毒（HPV)分型核酸測定試劑 盒（熒光 PCR 法），分別檢測 13 個型別（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)。
[0017] 2.亞能生物技術（深圳）有限公司的人乳頭瘤病毒基因分型（23型）檢測試劑盒 (PCR-反向點雜交法），分別檢測 23 個型別（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、 68、6、11、42、43、44、53、66、73、82、83)。
[0018] 3.上海透景生命科技有限公司的高危型人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒（流式熒 光雜交法），分別檢測 13 個型別（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)。
[0019] 4.港龍生物技術（深圳）有限公司的人乳頭瘤病毒分型檢測試劑盒（基因芯片 法），分別檢測 26 個型別（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、40、42、 43、44、53、54、55、57、66、67、73)。
[0020] 上述專利和產品，分別使用Taqman探針、膜雜交技術和懸浮芯片技術，存在通量 低或易污染或者配套耗材價格高等問題使得難以進行應用于臨床診斷。
[0021] 基于上述內容，盡管HPV DNA檢測已發展諸多技術，但開發一種操作簡單、準確、便 宜及具有多型HPV檢測能力的方法是十分有用的。
【發明內容】
：
[0022] 已知與宮頸癌高度相關的HPV約有20多個型，能導致皮膚疣狀病變的HPV約有5 個型，臨床上需要一種能針對多種HPV進行檢測，尤其是能快速、準確和高通量的方法。結 合了 PGR的高靈敏度，DNA長度多樣性和光檢測的高精確性等優點，具有操作簡單，結果直 觀和無污染的特點。
[0023] 本方法涉及一種使用熒光標記的引物的PGR檢測方法，本方法在在單一管中進 行 24 個型別 HPV(6、11、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、53、66、73、 83、MM4和cp8304)的檢測，利用毛細管電泳后使用測序儀讀取結果，判讀所檢測人乳頭瘤 病毒的具體型別。
[0024] 為達到上述目的，采取的技術方案：
[0025] -種人類乳頭瘤病毒檢測的方法和試劑盒，其特征在于：
[0026] 該試劑盒含有：
[0027] (I)DNA 提取：NP-40 ;cheIex 100 JRIS-HCL ;
[0028] (2) DNA 聚合酶：Taq DNA 聚合酶；UNG 酶；
[0029] (3) PCR反應液：dNTPs，熒光標記引物，DNA聚合酶Buffer ;
[0030] (4) PCR反應體系：DNA聚合酶選擇Taq HSDNA聚合酶及熒光標記引物：
[0031]
【權利要求】
1. 一種人類乳頭瘤病毒檢測的方法和試劑盒，其特征在于： 該試劑盒含有： (1) DNA 提取：NP-40 ;chelexlOO ;TRIS-HCL。 (2) DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶；UNG酶。 (3) PCR反應液：dNTPs，熒光標記引物，DNA聚合酶Buffer。 (4) PCR反應體系：DNA聚合酶選擇Taq HS DNA聚合酶及熒光標記引物，如表1。
表1 (5) 標準品為為SIZ熒光標記引物擴增的長度為345、355、360、365、370和380的PCR 產物。
2. 根據權利要求1所述的檢測，其特征在于將24個型的人類乳頭瘤病毒分為4組，5' 端標記熒光基團為是FAM、HEX、TAMRA和R0X4種。分組和標記方法如表2所述。
表2。
3. 根據權利要求1所述的檢測，其特征在于根據擴增產物長度分為6組，分組方法如表 3所述。
表3。
4.根據權利要求1中的HPV熒光檢測，使用的方法為多重引物的PCR反應，由一組特異 性上游引物和一條下游簡并引物進行如下反應： A) 模板變性，特征在于，模板變性溫度在95°C。 B) 引物退火及延伸，特征在于，引物退火溫度在52°C，延伸溫度在72°C。 C) 按A-B循環進行擴增，特征在于循環數為35-45個。
【文檔編號】C12Q1/70GK104293974SQ201310303335
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月19日 優先權日:2013年7月19日
【發明者】浦艷 申請人:浦艷