一種利用磷霉素選育達托霉素高產菌株的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用篩選對磷霉素敏感的玫瑰孢鏈霉菌從而獲得達托霉素高產菌株的方法，屬于菌種的選育技術。該方法包括以下過程：斜面孢子用無菌水制成孢子懸液，經UV處理后，涂布于分離培養基上，用無菌竹簽將長出的菌落挑出接種于含有不同濃度的磷霉素的固體篩選培養基上，選取對不同濃度磷霉素敏感的菌落，接種于斜面培養基上培養，最終進行液體培養，從中選出具有穩定遺傳性狀的高產菌株。
【專利說明】 一種利用磷霉素選育達托霉素高產菌株的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物菌種篩選的【技術領域】，特別涉及利用磷霉素篩選達托霉素高產菌株的技術。
【背景技術】
[0002]隨著抗生素藥物在臨床上的廣泛應用，細菌的耐藥性問題越來越嚴重，引起人們的廣泛關注。萬古霉素長期以來一直作為防御許多嚴重革蘭氏陽性菌感染的最后防線，但隨著頻繁的臨床應用，其耐藥菌株也越來越多，萬古霉素目前臨床應用已非十分理想。因此研發新型的抗耐藥菌抗生素就具有非常重要的意義。
[0003]達托霉素是由禮來([117)公司最初研究，(^1)3181:制藥公司開發的一種環脂肽類抗生素。2003年9月，作為一種全新結構類別的抗生素在美國首次上市。這種抗生素是從玫瑰孢鏈霉菌(31^61)1:01117068發酵液中提取得到的一個環脂肽類物質，它不僅具有新穎的化學結構，而且其作用模式也與任何一個已獲批準的抗生素都不同，它通過擾亂細胞膜對氨基酸的轉運，從而阻礙細菌細胞壁肽聚糖的生物合成，改變細胞質膜的性質；另外，它還能通過破壞細菌的細胞膜，使其內容物外泄而達到殺菌的目的。
[0004]由于其獨特的抗菌特性及良好的市場前景，近幾年來，國內不少單位陸續開始研究。2006年，天津大學公開了一種激光誘變玫瑰孢鏈霉菌選育達托霉素高產菌株的方法:2007年由中國科學院上海有機化學研究所公開了一種達托霉素的合成方法。國內也有人在做菌種的篩選和遺傳育種工作，但是都是剛剛開始，還沒能夠達到工業化生產的要求，所以，如何提高!'086081)01*118鏈霉菌中的達托霉素的產量將對其產業化生產，以及產品的銷售和市場占有份額都具有重要的意義。
[0005]磷霉素是通過阻礙細胞壁合成中仙？41。嫩丙酮酸轉移酶的反應，從而抑制細胞壁的合成。可以設想，如果以磷霉素$01)為“篩子”，凡是對？01敏感度高的菌株，則其細胞壁合成中的這一點就可能有缺陷，使之不能很好地合成細胞壁，而轉向合成抗生素，達到選育聞廣菌株的目的。范銘綺等利用憐霉素篩選氣基糖昔類抗生素6101&聞廣菌株中獲得了成功，與親株相比效價提高了 75?101%。而把磷霉素應用與達托霉素產生菌的選育方面，則未見相關的專利和文獻的報道。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提出一種利用篩選對磷霉素敏感的玫瑰孢鏈霉菌從而獲得達托霉素高產菌株的方法，依此方法可有效的提高達托霉素的產量。
[0007]本發明的目的是通過如下的技術方案實現的:一種利用磷霉素選育達托霉素高產菌株的方法，其特征在于包括以下過程:玫瑰孢鏈霉菌(31^61)1:01117068親株的斜面孢子用無菌水制成105-107個孢子加1的單孢子懸液，將1-3“的孢子懸液分裝于玻璃皿中，于15瓦紫外燈下處理0.5-1.5分鐘，然后將輻射處理的孢子懸液用無菌水稀釋到10—3-10—5后，涂布于培養平板中26-281培養7-8天，用無菌竹簽將長出的菌落挑出接種于含有200-10009 8加1的磷霉素的篩選平板上，挑取對相應濃度磷霉素敏感的菌落，于斜面培養基培養6-7天后，接種于裝有3001液體發酵培養基的25001搖瓶，于28-301，轉速為200-22011)111的搖床中培養120-16011，通過!1？！^，檢測達托霉素產量，從而獲得高產的達托霉素產生菌。
[0008]上述的篩選平板中磷霉素的含量為:200^ 8加1或400^1 8加1或600 ^ 或
800 9或 1000 9 邑/爪工。
[0009]上述的液體發酵培養基組成及質量含量為:可溶性淀粉6-10&酵母粉4-68，糊精10-208，干酪素3-58，胰蛋白胨4-108，^28043~58？卜天冬酰胺1-38，溶于11自來水中，？抓5。
[0010]本發明采用的通過篩選磷霉素敏感菌株來獲得達托霉素高產菌株，設備簡單、方法宜行、效果良好，選育出的菌株正突變率為1-25 %，發酵單位比出發菌株提高0.3-2.9倍。
【具體實施方式】
[0011]下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明，但應理解本發明的范圍非僅限于這些實施例的范圍。
[0012]實施例1親株的斜面孢子用無菌水制成105-107個孢子加1的單孢子懸液，將21111的孢子懸液分裝于玻璃皿中，于15瓦紫外燈下處理0.5分鐘，然后將輻射處理的孢子懸液用無菌水稀釋到10—3-10—5后，涂布于培養平板中261培養7天，用無菌竹簽將長出的菌落挑出接種于含有1000^ 8加1的磷霉素的篩選平板上(組成為，酵母粉如，麥芽浸出粉此，葡萄糖38，磷霉素18，瓊脂208，去離子水1匕1?自然)，挑取對該濃度磷霉素敏感的菌落，于斜面培養基培養6天后，接種于裝有30“液體發酵培養基的250“搖瓶(組成為可溶性淀粉8@，酵母粉如，糊精108，干酪素5@，胰蛋白胨如，1^230438，[-天冬酰胺18，溶于自來水中，5)，于281，轉速為200印111的搖床中培養120卜，通過!1？！^，檢測達托霉素產量，正突變率為1-2%。發酵單位比親株提高0.3-0.4倍。
[0013]實施例2
[0014]親株的斜面孢子用無菌水制成105-107個孢子加1的單孢子懸液，將21111的孢子懸液分裝于玻璃皿中，于15瓦紫外燈下處理0.6分鐘，然后將輻射處理的孢子懸液用無菌水稀釋到10—3-10—5后，涂布于培養平板中261培養7天，用無菌竹簽將長出的菌落挑出接種于含有800 ^ 8加1的磷霉素的篩選平板上(組成為，酵母粉如，麥芽浸出粉此，葡萄糖如，磷霉素0.88，瓊脂208，去離子水1匕？11自然)，挑取對該濃度磷霉素敏感的菌落，于斜面培養基培養6天后，接種于裝有3001液體發酵培養基的25001搖瓶(組成為可溶性淀粉徹，酵母粉5@，糊精10&干酪素如，胰蛋白胨6@，130438，1-天冬酰胺18，溶于自來水中，戶取.5)，于281，轉速為200印111的搖床中培養120卜，通過即!^，檢測達托霉素產量，正突變率為4-5%。發酵單位比親株提高0.8-1.0倍。
[0015]實施例3
[0016]親株的斜面孢子用無菌水制成105-107個孢子加1的單孢子懸液，將21111的孢子懸液分裝于玻璃皿中，于15瓦紫外燈下處理1.0分鐘，然后將輻射處理的孢子懸液用無菌水稀釋到10—3-10—5后，涂布于培養平板中261培養7天，用無菌竹簽將長出的菌落挑出接種于含有600^ 8加1的磷霉素的篩選平板上(組成為，酵母粉如，麥芽浸出粉此，葡萄糖38，磷霉素0.68，瓊脂208，去離子水1匕1?自然)，挑取對該濃度磷霉素敏感的菌落，于斜面培養基培養6天后，接種于裝有3001液體發酵培養基的25001搖瓶(組成為可溶性淀粉徹，酵母粉5@，糊精10&干酪素如，胰蛋白胨6@，130438，1-天冬酰胺18，溶于自來水中，戶取.5)，于281，轉速為200印111的搖床中培養120卜，通過即!^，檢測達托霉素產量，正突變率為12-13%。發酵單位比親株提高1.4-1.6倍。
[0017]實施例4
[0018]親株的斜面孢子用無菌水制成105-107個孢子加1的單孢子懸液，將21111的孢子懸液分裝于玻璃皿中，于15瓦紫外燈下處理1.0分鐘，然后將輻射處理的孢子懸液用無菌水稀釋到10—3-10—5后，涂布于培養平板中261培養7天，用無菌竹簽將長出的菌落挑出接種于含有400^ 8加1的磷霉素的篩選平板上(組成為，酵母粉如，麥芽浸出粉此，葡萄糖38，磷霉素0.知，瓊脂208，去離子水1匕1?自然)，挑取對該濃度磷霉素敏感的菌落，于斜面培養基培養6天后，接種于裝有3001液體發酵培養基的25001搖瓶(組成為可溶性淀粉徹，酵母粉5@，糊精10&干酪素如，胰蛋白胨6@，130438，1-天冬酰胺18，溶于自來水中，戶取.5)，于281，轉速為200印111的搖床中培養120卜，通過即!^，檢測達托霉素產量，正突變率為15-16%。發酵單位比親株提高2.0-2.3倍。
[0019]實施例5
[0020]親株的斜面孢子用無菌水制成105-107個孢子加1的單孢子懸液，將21111的孢子懸液分裝于玻璃皿中，于15瓦紫外燈下處理1.0分鐘，然后將輻射處理的孢子懸液用無菌水稀釋到10—3-10—5后，涂布于培養平板中261培養7天，用無菌竹簽將長出的菌落挑出接種于含有200 ^ 8加1的磷霉素的篩選平板上(組成為，酵母粉如，麥芽浸出粉此，葡萄糖如，磷霉素0.知，瓊脂208，去離子水1匕？11自然)，挑取對該濃度磷霉素敏感的菌落，于斜面培養基培養6天后，接種于裝有3001液體發酵培養基的25001搖瓶(組成為可溶性淀粉徹，酵母粉5@，糊精10&干酪素5@，胰蛋白胨6@，1^230438，1-天冬酰胺18，溶于自來水中，戶取.5)，于281，轉速為200印111的搖床中培養120卜，通過即!^，檢測達托霉素產量，正突變率為20-21%。發酵單位比親株提高2.8-2.9倍。
【權利要求】
1.一種利用磷霉素選育達托霉素高產菌株的方法，其特征在于包括以下過程:將玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)親株的斜面孢子用無菌水制成15-1O7個孢子/ml的單孢子懸液,將l_3ml的孢子懸液分裝于玻璃皿中，于15瓦紫外燈下處理0.5-1.5分鐘，然后將輻射處理的孢子懸液用無菌水稀釋到10_3_10_5后，涂布于培養平板中26-28°C培養7-8天，用無菌竹簽將長出的菌落挑出接種于含有200-1000 μ g/ml的磷霉素的篩選平板上，挑取對相應濃度磷霉素敏感的菌落，于斜面培養基培養6-7天后，接種于裝有30ml液體發酵培養基的250ml搖瓶，于28-30°C，轉速為200_220rpm的搖床中培養120_160h，通過HPLC，檢測達托霉素產量，從而獲得高產的達托霉素產生菌。
2.按權利要求1所述的方法，其特征在于，篩選培養基組成及質量含量為:酵母粉2_5g，麥芽浸出粉8-12g，葡萄糖3-5g，磷霉素0.2_lg，瓊脂18_22g，去離子水1L，PH自然。
3.按權利要求1及2所述的方法，其特征在于，篩選平板中磷霉素的含量為:200μ g/ml 或 400 μ g/ml 或 600 μ g/ml 或 800 μ g/ml 或 1000 μ g/ml。
4.按權利要去I所述的方法，其特征在于，液體發酵培養基組成及質量含量為:可溶性淀粉6-10g，酵母粉4-6g，糊精10-20g，干酪素3-5g，胰蛋白胨4_10g，K2S043_5g，L-天冬酰胺l_3g，溶于IL自來水中，PH7.5。
【文檔編號】C12N1/20GK104342379SQ201310311308
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月23日 優先權日:2013年7月23日
【發明者】沈依群, 張曉來, 陸茂林, 錢國芬, 許春燕, 司竑飛, 楊曉偉 申請人:江蘇省微生物研究所有限責任公司