提高多肽的纖維素分解增強活性的方法【專利摘要】本發明涉及提高多肽的纖維素分解增強活性的方法，具體的涉及提高具有纖維素分解增強活性的多肽的活性的方法，包括：向含有具有纖維素分解增強活性的多肽的組合物加入可溶性活化性二價金屬陽離子，其中與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高。本發明還涉及組合物、降解或轉化含纖維素材料的方法，以及產生發酵產物的方法。【專利說明】提高多肽的纖維素分解增強活性的方法[0001]本申請是申請日為2008年05月30日，申請號為“200880101442.8”(國際申請號為“PCT/US2008/065360”)，名稱為“提高多肽的纖維素分解增強活性的方法”的發明專利申請的分案申請。[0002]對序列表的援引[0003]本申請包含計算機可讀形式的序列表。本申請通過援引并入該序列表。[0004]對生物材料保藏物的援弓I[0005]本申請包含對生物材料保藏物的援引，并通過援引并入該生物材料保藏物。[0006]發明背景發明領域[0007]本發明涉及用于提高具有纖維素分解增強活性的多肽的活性的方法和組合物。[0008]相關技術的說明[0009]纖維素是一種由簡單糖類葡萄糖通過β_1，4-聯結共價鍵合而成的聚合物。許多微生物可產生水解β_聯結的葡聚糖的酶。這些酶包括內切葡聚糖酶(endoglucanases)、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolases)和β_葡糖苷酶(β-glucosidases)。內切葡聚糖酶在隨機的部位消化纖維素聚合物，使其暴露于纖維二糖水解酶的攻擊之下。纖維二糖水解酶從該纖維素聚合物的末端順序地釋放纖維二糖分子。纖維二糖是一種水溶性的葡萄糖β-1,4-聯結二聚物。β-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。[0010]將含纖維素原料轉化為乙醇具有大量原料易得、可理想地避免材料的焚燒和填埋，以及乙醇燃料的清潔性等優勢。木材、農業殘余物、草本作物，以及城市固體廢物已被考慮用來作為生產乙醇的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質素構成。一旦纖維素被轉化為葡萄糖，葡萄糖即被酵母容易地轉化為乙醇。[0011]WO2005/074647公開了來自土生梭抱殼(Thielaviaterrestris)的具有纖維素分解增強活性的分離多肽及其多核苷酸。WO2005/074656公開了來自橙色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的具有纖維素分解增強活性的分離的多肽及其多核苷酸。公布的美國專利申請序列號2007/0077630公開了來自里氏木霉的具有纖維素分解增強活性的分離的多肽及其多核苷酸。[0012]提高具有纖維素分解增強活性的多肽的活性在本領域中將會是有利的。[0013]本發明涉及用于提高具有纖維素分解增強活性的多肽的活性的方法和組合物。【
發明內容】[0014]本發明涉及提高具有纖維素分解增強活性的多肽的活性的方法，其包括:向包含具有纖維素分解增強活性的組合物添加可溶性活化性二價金屬陽離子，其中可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料的過程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在，且與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高。[0015]本發明還涉及降解或轉化含纖維素材料的方法，其包括:用有效量的纖維素分解酶組合物處理含纖維素材料，所述組合物包含有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在。[0016]本發明還涉及產生發酵產物的方法，其包括:(a)用有效量的纖維素分解酶組合物糖化含纖維素材料，所述組合物包含有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在；(b)用一種或多種發酵微生物發酵步驟(a)中經糖化的含纖維素材料以產生發酵產物；和(c)從發酵中回收發酵產物。[0017]本發明還涉及包含具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的組合物，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料的過程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在，且與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高。[0018]本發明還涉及包含有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料的過程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在，且與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提聞。[0019]具體地，本發明還涉及如下各項:[0020]1.提高具有纖維素分解增強活性的多肽的活性的方法，包括:向含有具有纖維素分解增強活性的多肽的組合物中加入可溶性活化性二價金屬陽離子，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料的過程中以優選約0.0OlmM-約50mM、更優選約0.0lmM-約25mM、更優選約0.1mM-約25mM、更優選約0.1mM-約10mM、進一步更優選約0.3mM-約5mM、最優選約0.3mM-約2.5mM、進一步最優選約0.3mM-約ImM的有效濃度存在，與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高。[0021]2.項I的方法，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。[0022]3.項I的方法，其中所述具有纖維素分解增強活性的多肽選自下組:[0023](a)含有[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，而X(4)是在4個鄰接位置上的任何氨基酸；和[0024](b)含有[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的具有纖維素分解增強活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，而X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；[0025]其中含有[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強活性的多肽還任選包含:[0026]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]、[0027][EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或[0028]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]—X—Y—X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],[0029]其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在I個位置或2個鄰接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸，而X(2)是在2個鄰接位置上的任何氨基酸。[0030]4.項I的方法，其中所述具有纖維素分解增強活性的多肽選自下組:[0031](a)含有與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有優選至少60%、更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、進一步更優選至少90%、最優選至少95%同一性的氨基酸序列的多肽；[0032](b)由在優選至少中嚴緊度條件、更優選至少中-高嚴緊度條件、最優選至少高嚴緊度條件下與(i)SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:USEQIDNO:3,SEQIDNO:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列中含有的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7、SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼的多肽；[0033](c)由如下多核苷酸編碼的多肽:該多核苷酸包含與SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優選至少60%、更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、進一步更優選至少90%、最優選至少95%同一'丨生的核苷酸序列；[0034](d)SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽包含一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和[0035](e)含有SEQIDN0:2、SEQIDNO:4,SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽或由SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽組成的具有纖維素分解增強活性的多肽；或其具有纖維素分解增強活性的片段。[0036]5.項4的方法，其中所述具有纖維素分解增強活性的多肽是由大腸桿菌NRRLB-30699中所含的質粒PEJG120、大腸桿菌NRRLB-30813中所含的質粒pTter61C、大腸桿菌NRRLB-30812中所含的質粒pTter61D、大腸桿菌NRRLB-30814中所含的質粒pTter61E、大腸桿菌NRRLB-30811中所含的質粒pTter61G、大`腸桿菌NRRLB-30704中所含的質粒PDZA2-7或大腸桿菌NRRLB-30878中所含的質粒pTr3337中包含的多核苷酸編碼的。[0037]6.降解或轉化含纖維素材料的方法，包括:用有效量的纖維素分解酶組合物處理含纖維素材料，所述纖維素分解酶組合物包含有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子以優選約0.00ImM-約50mM、更優選約0.0lmM-約25mM、更優選約0.1mM-約25mM、更優選約0.1mM-約10mM、進一步更優選約0.3mM-約5mM、最優選約0.3mM_約2.5mM、進一步最優選約0.3mM_約ImM的有效濃度存在。[0038]7.項6的方法，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。[0039]8.項6的方法，其中所述具有纖維素分解增強活性的多肽選自下組:[0040](a)包含[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，而X(4)是在4個鄰接位置上的任何氨基酸；和[0041](b)含有[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的具有纖維素分解增強活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，而X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；[0042]其中含有[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強活性的多肽還任選包含:[0043]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]、[0044][EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或[0045]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],[0046]其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在I個位置或2個鄰接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸，而X(2)是在2個鄰接位置上的任何氨基酸。[0047]9.項6的方法，其中所述具有纖維素分解增強活性的多肽選自下組:[0048](a)含有與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有優選至少60%、更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、進一步更優選至少90%、最優選至少95%同一性的氨基酸序列的多肽；[0049](b)由在優選至少中嚴緊度條件、更優選至少中-高嚴緊度條件、最優選至少高嚴緊度條件下與(i)SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:USEQIDNO:3,SEQIDN0:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列中含有的cDNA序列，或者包含SEQIDN0:7、SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼的多肽；[0050](c)由如下多核苷酸編碼的多肽:該多核苷酸包含與SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優選至少60%、更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、進一步更優選至少90%、最優選至少95%同一'丨生的核苷酸序列；[0051](d)SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDN0:8或SEQI`DNO:10,SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽包含一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和[0052](e)含有SEQIDN0:2、SEQIDNO:4,SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽或由SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽組成的具有纖維素分解增強活性的多肽；或其具有纖維素分解增強活性的片段。[0053]10.項9的方法，其中所述具有纖維素分解增強活性的多肽是由大腸桿菌NRRLB-30699中所含的質粒PEJG120、大腸桿菌NRRLB-30813中所含的質粒pTter61C、大腸桿菌NRRLB-30812中所含的質粒pTter61D、大腸桿菌NRRLB-30814中所含的質粒pTter61E、大腸桿菌NRRLB-30811中所含的質粒pTter61G、大腸桿菌NRRLB-30704中所含的質粒PDZA2-7或大腸桿菌NRRLB-30878中所含的質粒pTr3337中包含的多核苷酸編碼的。[0054]11.項6-10中任一項的方法，其還包括用有效量的β-葡糖苷酶處理含纖維素材料。[0055]12.項6-11中任一項的方法,其還包括用有效量的一種或多種選自下組的酶處理含纖維素材料:半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或其混合物。[0056]13.項6-12中任一項的方法，其還包括補充可溶性活化性二價金屬陽離子的濃度以維持可溶性活化性二價金屬陽離子的有效濃度為優選約0.0OlmM-約50mM、更優選約0.0lmM-約25mM、更優選約0.1mM-約25mM、更優選約0.1mM-約10mM、進一步更優選約0.3mM-約5mM、最優選約0.3mM-約2.5mM、進一步最優選約0.3mM-約ImM。[0057]14.項6-13中任一項的方法，其還包括回收經降解的含纖維素材料。[0058]15.產生發酵產物的方法，包括:(a)用有效量的包含有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的纖維素分解酶組合物糖化含纖維素材料，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子以優選約0.0OlmM-約50mM、更優選約0.0lmM-約25mM、更優選約0.1mM-約25mM、更優選約0.1mM-約10mM、進一步更優選約0.3mM-約5mM、最優選約0.3mM-約2.5mM、進一步最優選約0.3mM-約ImM的有效濃度存在；(b)用一種或多種發酵微生物發酵步驟(a)中經糖化的含纖維素材料以產生發酵產物；和(c)從發酵回收發酵產物。[0059]16.項15的方法，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。[0060]17.項15的方法，其中所述具有纖維素分解增強活性的多肽選自下組:[0061](a)包含[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，而X(4)是在4個鄰接位置上的任何氨基酸；和[0062](b)含有[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的具有纖維素分解增強活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，而X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸；[0063]其中含有[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強活性的多肽還任選包含:[0064]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]、[0065][EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或[0066]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]—X—Y—X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],[0067]其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在I個位置或2個鄰接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸，而X(2)是在2個鄰接位置上的任何氨基酸。[0068]18.項15的方法，其中所述具有纖維素分解增強活性的多肽選自下組:[0069](a)含有與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有優選至少60%、更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、進一步更優選至少90%、最優選至少95%同一性的氨基酸序列的多肽；[0070](b)由在優選至少中嚴緊度條件、更優選至少中-高嚴緊度條件、最優選至少高嚴緊度條件下與(i)SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:USEQIDNO:3,SEQIDNO:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列中含有的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7、SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼的多肽；[0071](c)由如下多核苷酸編碼的多肽:該多核苷酸包含與SEQIDNOiUSEQIDN0:3、SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優選至少60%、更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、進一步更優選至少90%、最優選至少95%同一'丨生的核苷酸序列；[0072](d)SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽包含一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和[0073](e)含有SEQIDN0:2、SEQIDNO:4,SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽或由SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽組成的具有纖維素分解增強活性的多肽；或其具有纖維素分解增強活性的片段。[0074]19.項18的方法，其中所述具有纖維素分解增強活性的多肽是由大腸桿菌NRRLB-30699中所含的質粒PEJG120、大腸桿菌NRRLB-30813中所含的質粒pTter61C、大腸桿菌NRRLB-30812中所含的質粒pTter61D、大腸桿菌NRRLB-30814中所含的質粒pTter61E、大腸桿菌NRRLB-30811中所含的質粒pTter61G、大腸桿菌NRRLB-30704中所含的質粒PDZA2-7或大腸桿菌NRRLB-30878中所含的質粒pTr3337中包含的多核苷酸編碼的。[0075]20.項15-19中任一項的方法,其還包括用有效量的β-葡糖苷酶處理含纖維素材料。[0076]21.項15-20中任一項的方法，其還包括用有效量的一種或多種選自下組的酶處理含纖維素材料:半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或其混合物。[0077]22.項15的方法，其還包括補充可溶性活化性二價金屬陽離子的濃度以維持可溶性活化性二價金屬陽離子的有效濃度為優選約0.0OlmM-約50mM、更優選約0.0lmM-約25mM、更優選約0.1mM-約25mM、更優選約0.1mM-約10mM、進一步更優選約0.3mM-約5mM、最優選約0.3mM-約2.5mM、進一步最優選約0.3mM-約ImM。[0078]23.項15-22中任一項的方法，其中所述發酵產物為醇、有機酸、酮、醛、氨基酸或氣體。[0079]24.包含具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料的過程中以優選約0.0OlmM-約50mM、更優選約0.0lmM-約25mM、更優選約0.1mM-約25mM、更優選約0.1mM-約10mM、進一步更優選約0.3mM-約5mM、最優選約0.3mM-約2.5mM、進一步最優選約0.3mM-約ImM的有效濃度存在,與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高。[0080]25.項24的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。[0081]26.包含具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的組合物，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料的過程中以優選約0.0OlmM-約50mM、更優選約0.0ImM-約25mM、更優選約0.1mM-約25mM、更優選約0.1mM-約10mM、進一步更優選約0.3mM-約5mM、最優選約0.3mM_約2.5mM、進一步最優選約0.3mM_約ImM的有效濃度存在，與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高。[0082]27.項26的組合物，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。[0083]附圖簡述[0084]圖1顯示pMJ04的限制性酶切圖。[0085]圖2顯示pCaHj527的限制性酶切圖。[0086]圖3顯示pMT2188的限制性酶切圖。[0087]圖4顯示pCaHj568的限制性酶切圖。[0088]圖5顯示pMJ05的限制性酶切圖。[0089]圖6顯示pSMail30的限制性酶切圖。[0090]圖7顯示米曲霉β-葡糖苷酶天然信號序列的DNA序列和氨基酸序列(SEQIDNO:57和58)。[0091]圖8顯示特異腐質霉(Humicolainsolens)內切葡聚糖酶V信號序列的DNA序列及氨基酸序列(SEQIDNO:61和62)。[0092]圖9顯示pSMail35的限制性酶切圖。[0093]圖10顯示pSMail40的限制性酶切圖。[0094]圖11顯示pSaMe-Fl的限制性酶切圖。[0095]圖12A、12B、12C和12D顯示米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:25和26)。[0096]圖13顯示pSaMe-FX的限制性酶切圖。[0097]圖14A、14B、14C和14D顯示米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:27和28)。[0098]圖15顯示pAlLo47的限制性酶切圖。[0099]圖16顯示向包括含有里氏木霉纖維素分解酶、米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白和具有纖維素分解增強活性的橙色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)GH61A多肽的發酵液的混合物中加入不同的可溶性二價金屬陽離子至終濃度為IOmM時，經預處理的玉米秸桿中的纖維素轉化為葡萄糖和纖維二糖的情況。[0100]圖17顯示向包括含有里氏木霉纖維素分解酶和米曲霉葡糖苷酶(加入或不加入具有纖維素分解增強活性的橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽)的發酵液的混合物中加入不同的二價金屬陽離子至終濃度為ImM時，經預處理的玉米秸桿中的纖維素轉化為葡萄糖和纖維二糖的情況。[0101]圖18顯示向包括含有里氏木霉纖維素分解酶、米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白和具有纖維素分解增強活性的橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽的脫鹽或未脫鹽發酵液的混合物中加入MgCl2和MnSO4至終濃度為0.0OOl-1OmM時，經預處理的玉米秸桿中的纖維素轉化為葡萄糖和纖維二糖的情況。[0102]定義[0103]纖維素分解增強活性(cellulolyticenhancingactivity):術語“纖維素分解增強活性”在此定義為增強具有纖維素分解活性的蛋白質對含纖維素材料的水解的生物學活性。為本發明的目的，纖維素分解增強活性是通過測量纖維素分解性蛋白質在下述條件下水解含纖維素材料所致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來加以確定的:l-50mg總蛋白，其包含80-99.5%w/w的纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素，及0.5-20%w/w的具有纖維素分解增強活性的蛋白質，50°C歷時1-7天，與用相等的無纖維素分解增強活性總蛋白加載量(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素)所進行的對照水解反應作比較。在一個優選的方面，將存在占纖維素酶蛋白加載3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根據WO02/095014在米曲霉中重組表達的)或3%的煙曲霉(Aspergillusfumigatus)β-葡糖苷酶(根據WO02/095014的實施例22在米曲霉中重組表達的)的CELLUCLAST?1.5L(NovozymesA/S,Bagsvserd,Denmark)混合物用作纖維素分解活性的標準。[0104]所述具有纖維素分解增強活性的多肽具有SEQIDN0:2、4、6、8、10、12或14的成熟多肽的至少20%，優選至少40%，更優選至少50%，更優選至少60%，更優選至少70%，更優選至少80%，進一步更優選至少90%，最優選至少95%，進一步最優選至少100%的纖維素分解增強活性。[0105]所述具有纖維素分解增強活性的多肽以下述方式增強由具有纖維素分解活性的蛋白質所催化的含纖維素材料的水解:將為達到同樣水解程度所需的纖維素分解酶的量減少優選至少0.1倍，更優選至少0.2倍、更優選至少0.3倍、更優選至少0.4倍、更優選至少0.5倍、更優選至少I倍、更優選至少3倍、更優選至少4倍、更優選至少5倍、更優選至少10倍、更優選至少20倍、進一步更優選至少30倍、最優選至少50倍、進一步最優選至少100倍。[0106]纖維素分解活性(cellulolyticactivity):術語“纖維素分解活性”在本文中定義為水解含纖維素材料的纖維素酶活性(如內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶或其組合)。纖維素分解蛋白可水解或水解羧甲基纖維素(CMC)，從而降低溫育混合物的粘度。由此造成的粘度下降可以用振動粘度計(例如Sofraser,France產的MIVI3000)來測定。纖維素酶活性(以纖維素粘度單位(CellulaseViscosityUnit，CEVU)作為量度)測定是通過測量樣品降低羧甲基纖維素(CMC)溶液粘度的能力來確定樣品中催化活性的量。測定在適合纖維素分解蛋白和底物的溫度和PH進行。[0107]為本發明的目的，纖維素分解活性是通過測量在下述條件下纖維素分解組合物對含纖維素材料的水解的增加來確定的:l_50mg纖維素分解蛋白質/gPCS中的纖維素，歷時1-7天，50°C，與不加纖維素分解蛋白的對照水解相比較。[0108]內切葡聚糖酶:術語“內切葡聚糖酶”在本文中定義為一種內切-1，4-(1，3;1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.N0.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(諸如羧甲基纖維素和羥甲基纖維素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷聯結；混合型β_1，3葡聚糖如谷物(cereal)β-D-葡聚糖或木葡聚糖，和其他含纖維素性組分的植物材料中的β-1,4鍵的內水解(endohydrolysis)。為本發明的目的，內切葡聚糖酶活性是根據Ghose,1987，PureandAppl.Chem.59:257-268所述的程序利用竣甲基纖維素(CMC)水解來確定的。[0109]纖維二糖水解酶:術語“纖維二糖水解酶”在本文中定義為一種1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化水解纖維素、纖維寡糖、或任何含β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-葡糖苷聯結，從鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖。為本發明的目的，纖維二糖水解酶活性是依照Lever等，1972,Anal.Biochem.47:273-279和vanTilbeurgh等，1982,FEBSLettersl49:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters187:283-288中記載的程序加以測定的。在本發明中，Lever等人的方法被用來評估玉米秸桿中纖維素的水解，而vanTilbeurgh等人的方法被用于測定對一種熒光性二糖衍生物的纖維二糖水解酶活性。[0110]β-葡糖苷酶:術語“β-葡糖苷酶”在本文中定義為一種β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化水解末端非還原性β-D-葡萄糖殘基，釋放β-D-葡萄糖。為本發明的目的，β-葡糖苷酶活性是根據Venturi等，2002,J.BasicMicrobiol.42:55-66記載的基本程序來測定的，只是使用了如本文所述的不同條件。一個單位的葡糖苷酶活性定義為:在IOOmM檸檬酸鈉、0.01%TWEEN?20中，50°C、pH5條件下每分鐘從作為底物的4mM對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷產生1.0微摩爾對硝基苯酚。[0111]家族7、12、45或61葡糖苷水解酶:術語“家族7糖苷水解酶”或“家族GH7”、“家族12糖苷水解酶”或“家族GH12”、“家族45糖苷水解酶”或“家族GH45”，以及“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”在本文中定義為根據Henrissat,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316以及HenrissatB.,andBairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696分別落入糖苷水解酶家族7、家族12、家族45和家族61的多肽。目前，Henrissat將GH61家族歸于未分類之列，表明該家族所屬的多肽的機制、催化性親核體/堿、催化性質子供體以及3D結構等性質均系未知。GH7、GH12或GH45蛋白分別又被稱為CEL7、CEL12或CEL45蛋白。[0112]含纖維素材料:生物質的初生細胞壁中主要的多糖是纖維素，豐度第二高的是半纖維素，第三是果膠。在細胞停止生長后產生的次生細胞璧也含有多糖，并且被與半纖維素共價交聯的多聚體木質素所增強。纖維素是脫水纖維二糖的同聚物，因此是一種直鏈β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有復雜的分枝結構和一系列取代基。雖然纖維素一般是無定形的，但植物組織中發現的纖維素主要呈現為由平行葡聚糖鏈構成的不溶性晶體基質。半纖維素通常通過氫鍵連接于纖維素以及其他半纖維素上，這有助于細胞壁基質的穩定化。[0113]含纖維素材料可以是任何含有纖維素的材料。纖維素通常存在于例如植株的莖、葉、果/種殼(hulls)、果/種皮(husks)和穗軸(cobs),或者樹的葉、枝、和木材等之中。含纖維素材料可以是，但不限于，草質材料(herbaceousmaterial)、農業殘余物(agriculturalresidues)、林業殘余物(forestryresidues)、城市固體廢物(municipalsolidwastes)、廢紙(wastepaper),以及紙衆和造紙廠殘余物(pulpandpapermillresidues)。含纖維素材料可以是任何類型的生物質,包括但不限于木材資源、城市固體廢物、廢紙、作物和作物殘余物(見例如Wiselogel等，1995，《HandbookonBioethanol〉〉(CharlesE.Wyman編)，第105-118頁，Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719；Mosier等，1999，RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,((AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology)),T.Scheper總編，第65卷,第23-40頁，Springer-Verlag,NewYork)。在本文中應當理解,含纖維素材料優選地為木素纖維素的形式，例如在混合的基質中包含木質素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。[0114]在一個優選的方面,含纖維素材料是玉米稻桿(cornstover)。在另一個優選的方面，含纖維素材料是玉米纖維。在另一個優選的方面，含纖維素材料是玉米穗軸。在另一個優選的方面，含纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個優選的方面，含纖維素材料是稻草(ricestraw)0在另一個優選的方面，含纖維素材料是紙和紙漿加工廢物。在另一個優選的方面，含纖維素材料是木本或草本植物。在另一個優選的方面，含纖維素材料是甘蔗渣。[0115]含纖維素材料可以直接使用，或者可以使用本領域已知的常規技術對其進行預處理。例如，物理預處理技術可包括各種類型的粉碎(milling)、福射(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆破(steaming/steamexplosion)、和濕熱分解作用(hydrothermolysis)；化學預處理技術可包括稀酸、堿、有機溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳、和PH受控的濕熱分解作用；而生物預處理技術可涉及施加溶木質素性微生物(參見，例如HsujT.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,《HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization》，Wyman，C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.，1994，Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,《EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction》，Himmel，M.E.，Baker，J.0.和Overend，R.P.編，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong，C.S.，CaojN.J.，DujJ.和Tsao，G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,((AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology))，ScheperjT.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；01sson,L.和Hahn-HagerdaljB.,1996，Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；以及VallanderjL.和Eriksson，Κ.-Ε.L，1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。[0116]預處理玉米秸桿:術語“PCS”或“預處理的玉米秸桿”在本文中定義為通過熱和稀酸處理從玉米秸桿獲得的含纖維素材料。為本發明的目的，PCS是通過本文中說明的方法制備的。為本發明的目的，PCS是由實施例20所述方法或改變其時間、溫度和酸量的變化形式來制備的。[0117]分離的多肽:本文所用的術語“分離的多肽”是指從一個來源分離的多肽。在一個優選的方面，所述多肽是通過SDS-PAGE測定為至少1%純、優選至少5%純、更優選至少10%純、更優選至少20%純、更優選至少40%純、更優選至少60%純、進一步更優選至少80%純、最優選至少90%純的。[0118]基本上純的多肽:術語“基本上純的多肽”在本文是指這樣的多肽制備物，其含有以重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%，更優選至多3%，進一步更優選至多2%，最優選至多1%，進一步最優選至多0.5%的與其天然地或重組地相伴隨的其他多肽物質。因此，優選的是，基本上純的多肽以制備物中存在的總多肽物質的重量計是至少92%純、優選至少94%純、更優選至少95%純、更優選至少96%純、更優選至少96%純、更優選至少97%純、更優選至少98%純、進一步更優選至少99%、最優選至少99.5%純、進一步最優選100%純的。本發明的多肽優選是基本上純的形式，即，多肽制備物實質上不含與其天然地或重組地相伴隨的其他多肽物質。這可以通過例如用公知的重組技術或通過經典的純化方法制備所述多肽來實現。[0119]成熟多肽:術語“成熟多肽”在本文中定義為經過翻譯和任何翻譯后修飾(如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等)之后，處于其最終形式的具有生物學活性(例如酶活性)的多肽。[0120]成熟多肽編碼序列:術語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼成熟的具有生物學活性的多肽的核苷酸序列。[0121]同一性:兩個氨基酸序列之間或者兩個核苷酸序列之間的相關性用參數“同一性”來描述。[0122]為本發明的目的，兩個氨基酸序列之間同一性程度的確定使用如EMBOSS軟件包(EMB0SS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsinGenetics16:276-277),優選3.0.0或更新的版本中的Needle程序所執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)。所用的可選參數為缺口形成罰分(gapopenpenalty)10、缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5、和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。將Needle的標記為“longestidentity”(“最長同一'丨生”)(使用-nobrief(無簡述)選項獲得)的輸出結果作為百分比同一性使用，它是這樣計算出來的:[0123](相同的殘基數XlOO)/(比對長度-比對中的缺口總數)[0124]為本發明的目的，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度的確定使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,同上),優選3.0.0或更新的版本中的Needle程序所執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)。所用的可選參數為缺口形成罰分10、缺口延伸罰分0.5、和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。將Needle的標記為“longestidentity”(“最長同一性”)(使用-nobrief選項獲得)的輸出結果作為百分比同一性使用，它是這樣計算出來的:[0125](相同的脫氧核糖核苷酸數χ100)/(比對長度-比對中的缺口總數)[0126]同源序列:術語“同源序列”在本文中定義為:用blastp(對蛋白質數據庫而言)或tblastn(對核酸數據庫而言)算法得出的E值(或稱期望值)小于0.001的序列，該算法用BL0SUM62矩陣，字長(wordsize)3、缺口出現罰分(gapexistencecost)ll、缺口延伸罰分(gapextensioncost)I,無低復雜度過濾,并用成熟蛋白序列查詢。參見Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.25:3389-3402。[0127]多肽片段:術語“多肽片段”在本文中定義為從成熟多肽的氨基端和/或羧基端缺失一個或多個(數個)氨基酸而得到的多肽；或其同源序列；其中所述片段具有其成熟多肽的活性。[0128]子序列:術語“子序列”在本文中定義為從成熟多肽編碼序列的5’端和/或3’端缺失了一個或多個(數個)核苷酸的核苷酸序列；或者其同源序列；其中所述子序列編碼具有其成熟多肽活性的多肽片段。[0129]等位變體(allelicvariant):術語“等位變體”是指基因的占據同一染色體座位的兩種或更多種可選形式中的任一種。等位變異在天然情況下通過突變產生，并可導致群體中的多態性。基因突變可以是沉默的(被編碼的多肽中沒有變化)，或者可以編碼氨基酸序列被改變的多肽。多肽的等位變體是基因的等位變體所編碼的多肽。[0130]分離的多核苷酸:本文中所用的術語“分離的多核苷酸”是指從一個來源分離而來的多核苷酸。在一個優選的方面，所述多核苷酸通過瓊脂糖凝膠電泳測定為至少1%純、優選至少5%純、更優選至少10%純、更優選至少20%純、更優選至少40%純、更優選至少60%純、進一步更優選至少80%純、最優選至少90%純。[0131]基本上純的多核苷酸:本文中所用的術語“基本上純的多核苷酸”是指這樣的多核苷酸制備物，其不含有其他無關或不需要的核苷酸，并且處于適合在經基因工程改造的蛋白質的生產系統中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有以重量計至多10%，優選至多8%,更優選至多6%,更優選至多5%,更優選至多4%,更優選至多3%,進一步更優選至多2%，最優選至多1%，進一步最優選至多0.5%的與其天然地或重組地相伴隨的其他多核苷酸物質。但是，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區，如啟動子和終止子。優選的是，基本上純的多核苷酸以重量計為至少90%純、優選至少92%純、更優選至少94%純、更優選至少95%純、更優選至少96%純、更優選至少97%純、進一步更優選至少98%純、最優選至少99%純、進一步最優選至少99.5%純。本發明的多核苷酸優選是處于基本上純的形式，即多核苷酸制備物基本上不含與其天然地或重組地相伴隨的其他多核苷酸物質。多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或者上述來源的任意組合。[0132]cDNA:術語“cDNA”在本文中定義為這樣的DNA分子，它能夠從獲自真核細胞的成熟的、經剪接的mRNA分子通過逆轉錄制備得到。cDNA缺少在對應的基因組DNA中通常存在的內含子序列。最初的初級RNA轉錄物是mRNA的前體，它經歷一系列步驟被加工之后作為成熟的、經剪接的mRNA出現。這些步驟包括通過一個稱為剪接的過程去除內含子序列。因此，從mRNA衍生而來的cDNA缺少任何內含子序列。[0133]核酸構建體:術語“核酸構建體”在用于本文時是指這樣的單鏈或雙鏈核酸分子:其是從天然存在的基因分離的，或者經過修飾而以原本不會存在于自然界中的方式包含核酸的片段，或者是合成的。當核酸構建體包含本發明的編碼序列的表達所需的控制序列時，術語“核酸構建體”與術語“表達盒”是同義的。[0134]控制序列:術語“控制序列”在本文中定義為包括編碼本發明多肽的多核苷酸的表達所必需的所有組件。每個控制序列對于編碼多肽的核苷酸序列而言，或者對于其它控制序列而言，可以是天然的或者外來的。這樣的控制序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽(prop印tide)序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。在最低程度上，控制序列包括啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。控制序列可以具有接頭，用來引入特異性限制性位點以幫助將控制序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區連接。[0135]可操作地連接:術語“可操作地連接”在本文中是指這樣一種構型，其中控制序列相對于多核苷酸序列的編碼序列被置于合適的位置上，使得該控制序列指導多肽編碼序列的表達。[0136]編碼序列:當用于本文時，術語“編碼序列”是指這樣的核苷酸序列，它直接規定其蛋白質產物的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般是由可讀框決定的，后者通常以ATG起始密碼子或其他可選的起始密碼子如GTG及TTG開始，而以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的、或重組的核苷酸序列。[0137]表達:術語“表達”包含多肽產生過程中涉及的任何步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。[0138]表達載體:術語“表達載體”在本文中定義為一種線性或環狀DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，且可操作地連接于為其表達提供條件的其他核苷酸。[0139]宿主細胞:術語“宿主細胞”在用于本文時包括任何易于被包含多核苷酸的核酸構建體或表達載體所轉化、轉染、轉導等的細胞類型。`[0140]修飾:術語“修飾”在本文中意指對成熟多肽或其同源序列進行的任何化學修飾；以及對編碼此類多肽的DNA進行的遺傳操作。修飾可以是一個或多個(數個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(數個)氨基酸側鏈的替換。[0141]人工變體:當在本文中使用時，術語“人工變體”是指由這樣的生物體所產生的多肽:所述生物體表達成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾型核苷酸序列。所述修飾型多核苷酸序列是對所述多核苷酸序列或其同源序列通過修飾加以人工干預而獲得的。[0142]發明詳述[0143]本發明涉及提高具有纖維素分解增強活性的多肽的活性的方法，其包括:向含有具有纖維素分解增強活性的多肽的組合物加入可溶性活化性二價金屬陽離子，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料的過程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在，且與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高。[0144]本發明還涉及降解或轉化含纖維素材料的方法，其包括:用有效量的含有有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的纖維素分解酶組合物處理含纖維素材料，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在。[0145]本發明還涉及產生發酵產物的方法，其包括:(a)將含纖維素材料用有效量的含有有效量具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的纖維素分解酶組合物糖化，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在；(b)用一種或多種發酵微生物將步驟(a)中經糖化的含纖維素材料發酵；和(c)從發酵中回收發酵產物。[0146]本發明還涉及含有具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的組合物，其中所述可溶性活化性二價陽離子在含纖維素材料的降解或轉化過程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存，且與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高。[0147]本發明還涉及包含有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料的過程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在，且與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提聞。[0148]二價金屬陽離子[0149]本發明可以使用任何可溶性活化性二價金屬陽離子。在一個優選的方面，所述可溶性活化性二價金屬陽離子選自由Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合組成的組。在一個更優選的方面，所述可溶性活化性二價金屬陽離子是Mn++。在另一個更優選的方面，所述可溶性活化性二價金屬陽離子是Co++。在另一個更優選的方面，所述可溶性活化性二價金屬陽離子是Mg++。在另一個更優選的方面，所述可溶性活化性二價金屬陽離子是Ca++。在另一個更優選的方面，所述可溶性活化性二價金屬陽離子是兩種或更多種(數種)選自由Mn++、Co++、Mg++和Ca++組成的組中的陽離子。在最優選的方面，所述可溶性活化性二價金屬陽離子是Mn++。在另一個最優選的方面，可溶性活化性二價金屬陽離子是Mg++。[0150]可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素底物的過程中以優選約0.0OlmM-約50mM，更優選約0.0lmM-約25mM，更優選約0.1mM-約25mM，更優選約0.1mM-約IOmM,進一步更優選約0.3mM-約5mM，最優選約0.3mM-約2.5mM,進一步最優選約0.3mM-約ImM的有效濃度加入。[0151]在一個優選的方面，可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素底物的過程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度加入。在一個更優選的方面,可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素底物的過程中以約0.0lmM-約25mM的有效濃度加入。在一個更優選的方面，可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素底物的過程中以約0.1mM-約25mM的有效濃度加入。在一個更優選的方面，可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素底物的過程中以約0.1mM-約IOmM的有效濃度加入。在一個進一步更優選的方面，可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素底物的過程中以約0.3mM-約5mM的有效濃度加入。在一個最優選的方面,可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素底物的過程中以約0.3mM-約2.5mM的有效濃度加入。在一個進一步最優選的方面，可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素底物的過程中以約0.3mM-約ImM的有效濃度加入。[0152]可溶性活化性二價金屬陽離子優選作為可溶性鹽加入，諸如，例如硫酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氟化物或碘化物。不過，本領域公知纖維素類生物質(cellulosicbiomass)可以含有多種二價金屬陽離子。參見,例如F.B.Salisbury和C.ff.Ross:PlantPhysiology,WadsworthsPublishingCompany,Belmont,California(1992)。因此纖維素類生物質可以部分地或全部地作為金屬陽離子的來源使用。活化性二價金屬陽離子可以是可溶的或不溶的。術語“可溶性活化性二價金屬陽離子”在本文定義為在溶液中可得的提高具有纖維素分解增強活性的多肽的活性的二價金屬陽離子。術語“不溶性活化性二價金屬陽離子”在本文定義為在溶液中不可獲得的提高具有纖維素分解增強活性的多肽的活性的二價金屬陽離子。二價金屬陽離子不可獲得可以是由于，例如其被螯合(例如被EDTA或EGTA螯合)，或其與纖維素類生物質的組分(例如焦磷酸鹽)絡合。[0153]纖維素類生物質也可提供抑制纖維素分解的可溶性二價金屬陽離子(下稱“可溶性抑制性二價金屬陽離子”)。例如，抑制性二價金屬陽離子是Zn++或Fe++。因此，在存在可溶性二價金屬陽離子的混合物的條件下，一些活化而另一些抑制纖維素分解，加入過量的可溶性活化性二價金屬陽離子以勝過抑制性二價金屬陽離子的抑制性效果。在這種情況下，為了防止抑制性二價金屬陽離子反向地影響具有纖維素分解增強活性的多肽，本發明的方法還包括補充可溶性活化性二價金屬陽離子的濃度以將可溶性活化性二價金屬陽離子的有效濃度在優選約0.0OlmM-約50mM，更優選約0.0lmM-約25mM，更優選約0.1mM-約25mM,更優選約0.1mM-約10mM，進一步更優選約0.3mM-約5mM，最優選約0.3mM-約2.5mM,而進一步最優選約0.3mM-約ImM的范圍保持一段足以降解或轉化含纖維素材料的時間。[0154]在一個優選的方面，在降解或轉化含纖維素底物的過程中補充可溶性活化性二價金屬陽離子以維持其有效濃度為約0.0OlmM-約50mM。在一個更優選的方面，在降解或轉化含纖維素底物的過程中補充可溶性活化性二價金屬陽離子以維持其有效濃度為約0.0lmM-約25mM。在一個更優選的方面，在降解或轉化含纖維素底物的過程中補充可溶性活化性二價金屬陽離子以維持其有效濃度為約0.1mM-約25mM。在一個更優選的方面，在降解或轉化含纖維素底物的過程中補充可溶性活化性二價金屬陽離子以維持其有效濃度為約0.1mM-約10mM。在一個進一`步更優選的方面，在降解或轉化含纖維素底物的過程中補充可溶性活化性二價金屬陽離子以維持其有效濃度為約0.3mM-約5mM。在一個最優選的方面，在降解或轉化含纖維素底物的過程中補充可溶性活化性二價金屬陽離子以維持其有效濃度為約0.3mM-約2.5mM。在一個進一步最優選的方面，在降解或轉化含纖維素底物的過程中補充可溶性活化性二價金屬陽離子以維持其有效濃度為約0.3mM-約ImM。[0155]纖維素類生物質中二價金屬陽離子的濃度可使用本領域公知的任何方法測定，例如原子吸收、電化學電極、金屬離子生物傳感器或光傳感器，或螯合滴定(參見，例如MethodsinEnzymology,v.158(!?),Haugland,R.P.HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals,6thed.;MolecularProbes,Inc.:Eugene,OR,1996.，Thompson等Anal.Chem.，70(22)，4717-4723，1998，InductivelyCoupledPlasmaMassSpectrometry,AkbarMontaser(Editor)May1998)。[0156]在本發明的方法中，可溶性活化性二價金屬陽離子提高具有纖維素分解增強活性的多肽的活性優選至少0.1倍，更優選至少0.2倍，更優選至少0.3倍，更優選至少0.4倍，更優選至少0.5倍，更優選至少I倍，更優選至少3倍，更優選至少4倍，更優選至少5倍，更優選至少10倍，更優選至少20倍，進一步更優選至少30倍，最優選至少50倍，進一步最優選至少100倍。[0157]纖維素分解酶組合物[0158]本發明還涉及包含具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的組合物，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料過程中以優選約0.0OlmM-約50mM，更優選約0.0lmM-約25mM，更優選約0.1mM-約25mM，更優選約0.1mM-約10mM，進一步更優選約0.3mM-約5mM，最優選約0.3mM-約2.5mM,而進一步最優選約0.3mM-約ImM的有效濃度存在，且與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高。[0159]本發明還涉及包含有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料過程中以優選約0.0OlmM-約50mM，更優選約0.0lmM-約25mM，更優選約0.1mM-約25mM,更優選約0.1mM-約IOmM,進一步更優選約0.3mM-約5mM,最優選約0.3mM-約2.5mM,而進一步最優選約0.3mM-約ImM的有效濃度存在，且與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高。[0160]在本發明的方法中，纖維素分解酶組合物可以包含在將含纖維素材料加工成葡萄糖，或將半纖維素加工成木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖、它們的聚合物，或如下所述的它們的衍生產物的加工中涉及的任何蛋白質。在一個方面，所述纖維素分解酶組合物包含內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β_葡糖苷酶，或它們的組合。在另一個方面，所述纖維素分解酶組合物還包含一種或多種附加的用于改善含纖維素材料降解的酶活性。優選的附加酶有半纖維素酶、酯酶(例如脂肪酶、磷脂酶、和/或角質酶)、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶、或它們的混合物。[0161]纖維素分解酶組合物可以是單組分制備物，例如一種內切葡聚糖酶，多組分制備物，例如一種或多種內切葡聚糖酶，一種或多種纖維二糖水解酶；和一種或多種葡糖苷酶，或者多組分蛋白制備物與單組分蛋白制備物的組合。纖維素分解蛋白可在酸性、中性或堿性PH范圍內具有活性，即，水解含纖維素材料。[0162]如上文所述，本發明中使用的纖維素分解蛋白可以是單組分制備物，即基本上不含其它纖維素分解性組分的組分。單個組分可以是重組組分，即通過克隆編碼該單個組分的DNA序列，然后用該DNA序列轉化細胞，并在宿主中表達而產生的(參見例如WO91/17243和WO91/17244)。宿主細胞可以是異源宿主(酶對宿主而言是外來的)或者宿主也可以是野生型宿主(酶對宿主而言是天然的)。單組分纖維素分解蛋白還可以通過從發酵液中純化此類蛋白來加以制備。[0163]本發明使用的酶可以是任何適合在本文所述的方法中使用的形式，例如含或不含細胞的粗發酵液、干粉或顆粒劑、非粉化性顆粒劑(non-dustinggranulate)、液體、穩定化液體、或經保護的酶。顆粒劑例如可如在美國專利4，106，991和4，661，452中所公開的方法制備，并可任選使用本領域已知的方法進行包衣。例如，液體酶制備物可根據既定的方法通過加入穩定劑諸如糖、糖醇或其它多元醇、和/或乳酸或其它有機酸來穩定化。經保護的酶可根據EP238，216中所公開的方法制備。[0164]具有纖維素分解酶活性的多肽可以從任何屬的微生物獲得。術語“從...獲得”(或“獲自...在此處意思是指所述酶可以是從天然產生所述酶作為天然酶的生物體分離而來的。“從...獲得”(或“獲自...在此處還意指所述酶可以是在宿主生物體中重組產生的，其中重組產生的酶對于宿主生物體而言為天然的或外來的，或者具有經修飾的氨基酸序列，例如缺失、插入和/或取代了一個或多個氨基酸，即作為天然氨基酸序列的突變體和/或片段的重組產生的酶或通過本領域已知的核酸改組方法產生的酶。天然酶的意義中涵蓋天然變體，外來酶的意義中涵蓋通過化學或重組誘變，如通過定點誘變或改組獲得的變體。因此，纖維素分解性蛋白的經過化學修飾或蛋白質工程改造的突變體也可以用于本發明。在一個優選的方面，獲自給定來源的多肽是胞外分泌的。[0165]具有纖維素分解酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，該多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽，諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)的具有纖維素分解酶活性的多肽，或革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)或尿枝原體屬(Ureaplasma)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0166]在一個優選的方面,所述多肽是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、環狀芽抱桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝結芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽抱桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacilluslautus)、緩慢芽抱桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0167]在另一個優選的方面，所述多肽是似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0168]在另一個優選的方面，所述多肽是不產色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)、或淺青紫鏈霉菌(StreptomycesIividans)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0169]具有纖維素分解酶活性的多肽還可以是真菌多肽，更優選酵母多肽，如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉屬(Yarrowia)的具有纖維素分解酶活性的多肽；或者更優選絲狀真菌多肽，如枝頂孢霉屬(Acremonium)、蘑菇屬(Agaricus)、鏈格抱屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、葡萄座腔菌屬(Botryospaeria)、擬錯菌屬(Ceriporiopsis)、毛殼菌屬(Chaetomidium)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、麥角屬(Claviceps)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、Coprinopsis、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、栗疫病菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二抱屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、網抱菌屬(Filibasidium)、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質霉屬(Humicola)、把菌屬(Irpex)、香燕屬(Lentinula)、小球腔菌屬(Leptospaeria)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、Trichophaea、輪枝抱屬(Verticillium)、小包腳菇屬(Volvariella)、或炭角菌屬(Xylaria)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0170]在一個優選的方面所述多肽是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0171]在另一個優選的方面，所述多肽是解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉、嗜角質金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(Fusariumreticulatum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰色腐質酶(Humicolagrisea)、特異腐質霉、疏棉狀腐質霉(Humicolalanuginosa)、乳白奉巴菌(IrpexIacteus)、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無色梭抱殼(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimet1、小抱子梭抱殼(Thielaviamicrospora)、Thielaviaovispora、Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱殼、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉、綠色木霉(Trichodermaviride)或Trichophaeasaccata的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0172]在本發明的方法中，任何內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和/或β_葡糖苷酶，以及任何其它纖維素分解酶都可以使用。[0173]可以用于本發明的細菌內切葡聚糖酶的例子包括但不限于解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內切葡聚糖酶(WO91/05039；W093/15186;美國專利5，275，944；W096/02551;美國專利5，536，655，WO00/70031,WO05/093050);褐色喜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)內切葡聚糖酶III(W005/093050);和褐色喜熱裂孢菌內切葡聚糖酶V(W005/093050)。[0174]可以用于本發明的真菌內切葡聚糖酶的例子包括但不限于里氏木霉內切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253-263;GenBank?登錄號M15665);里氏木霉內切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene63:11-22;GenBank?登錄號M19373);里氏木霉內切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GenBank?登錄號AB003694);里氏木霉內切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249:584-591；GenBank?登錄號Yllll3);和里氏木霉內切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiology13:219-228;GenBank?登錄號Z33381);棘孢曲霉內切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearch18:5884)；川地曲霉(Aspergilliskawachii)內切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435-439);金抱子菌屬菌種(Chrysosporiumsp.)C1(美國專利6，573，086；GenPept登錄號AAQ38150)；Corynascusheterothallicus(美國專利6，855，531;GenPept登錄號AAY00844)；Erwiniacarotovara內切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9-14);尖鐮孢內切葡聚糖酶(GenBank?登錄號L29381);灰腐質霉thermoidea變體菌株內切葡聚糖酶(GenBank?登錄號AB003107)；Melanocarpusalbomyces內切葡聚糖酶(GenBank?登錄號MAL515703);粗糙脈孢菌內切葡聚糖酶(GenBank?登錄號XM—324477);馬瘤胃弧菌(Piromycesequi)(Eberhardt等，2000，Microbiology146:1999-2008；GenPept登錄號CAB92325);米根霉(Rhizopusoryzae)(Moriya等，2003，J.Bacteriology185:1749-1756；GenBank?登錄號AB047927，AB056667、AB056668);和土生梭孢殼(W02004/053039;EMBL登錄號CQ827970)。[0175]公開了使用依照HenrissatB.，1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities，Biochem.J.280:309-316;以及HenrissatB.和BairochA.，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolasess，Biochem.J.316:695-696的分類法分類的超過13個糖基水解酶家族中的其它內切葡聚糖酶。[0176]在一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是里氏木霉內切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是里氏木霉內切葡聚糖酶II(CEL5A)。在另一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是里氏木霉內切葡聚糖酶III(CEL12A)。在另一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是里氏木霉內切葡聚糖酶V(CEL45A)。在另一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是嗜熱毀絲霉CEL7內切葡聚糖酶。在另一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是ChrysosporiumlucknowenseCEL12內切葡聚糖酶。在另一個優選的方面,所述內切葡聚糖酶是ChrysosporiumlucknowenseCEL45內切葡聚糖酶。[0177]在一個更優選的方面，所述里氏木霉內切葡聚糖酶I(CEL7B)是SEQIDNO:74的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述里氏木霉內切葡聚糖酶IKCEL5A)是SEQIDNO:76的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述里氏木霉內切葡聚糖酶III(CEL12A)是SEQIDNO:78的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述里氏木霉內切葡聚糖酶V(CEL45A)是SEQIDNO:80的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述嗜熱毀絲霉CEL7內切葡聚糖酶是SEQIDN0:82的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述MyceliophthorathermophilaCEL12內切葡聚糖酶是SEQIDN0:84的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述MyceliophthorathermophilaCEL45內切葡聚糖酶是SEQIDN0:86的成熟多肽或其直向同源物或變體。[0178]在另一個更優選的方面，所述里氏木霉內切葡聚糖酶I(CEL7B)由SEQIDNO:73的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述里氏木霉內切葡聚糖酶II(CEL5A)由SEQIDNO:75的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述里氏木霉內切葡聚糖酶III(CEL12A)由SEQIDNO:77的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述里氏木霉內切葡聚糖酶V(CEL45A)由SEQIDNO:79的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述嗜熱毀絲霉CEL7內切葡聚糖酶由SEQIDN0:81的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述金孢子菌CEL12內切葡聚糖酶由SEQIDNO:83的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述金孢子菌CEL45內切葡聚糖酶由SEQIDN0:85的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。[0179]所述里氏木霉內切葡聚糖酶I(CEL7B)可根據Penttila等，1986，Gene45:253-263獲得。所述里氏木霉內切葡聚糖酶II(CEL5A)可根據Saloheimo等，1988，Gene63:11-22獲得。所述里氏木霉內切葡聚糖酶III(CEL12A)可根據Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563獲得。所述里氏木霉內切葡聚糖酶V(CEL45A)可根據Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiologyl3:219-228獲得。所述嗜熱毀絲霉CEL7內切葡聚糖酶可根據WO95/024471獲得。所述ChrysosporiumlucknowenseCEL12內切葡聚糖酶可根據WO2001/25468獲得。所述ChrysosporiumlucknowenseCEL45內切葡聚糖酶可根據WO2000/20555獲得。[0180]在另一個優選的方面，所述纖維二糖水解酶是里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)。在另一個優選的方面，所述纖維二糖水解酶是里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)。在另一個優選的方面，所述纖維二糖水解酶是具有纖維素結合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶。在另一個優選的方面，所述纖維二糖水解酶是不具有纖維素結合域的嗜熱毀絲霉CEL7纖維二糖水解酶。在另一個優選的方面，所述纖維二糖水解酶是土生梭孢殼纖維二糖水解酶。[0181]在另一個更優選的方面，所述里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)是SEQIDNO:88的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個優選的方面，所述里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)是SEQIDNO:90的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述具有纖維素結合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶是SEQIDNO:92的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述不具有纖維素結合域的嗜熱毀絲霉CEL7纖維二糖水解酶是SEQIDNO:94的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述土生梭孢殼纖維二糖水解酶是SEQIDN0:96的成熟多肽或其直向同源物或變體。[0182]在另一個更優選的方面，所述里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)纖維二糖水解酶由SEQIDNO:87的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)纖維二糖水解酶由SEQIDN0:89的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述具有纖維素結合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶由SEQIDN0:91的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述不具有纖維素結合域的嗜熱毀絲霉CEL7纖維二糖水解酶由SEQIDNO:93的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述土生梭孢殼纖維二糖水解酶由SEQIDNO:95的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。[0183]所述里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)可以依照Shoemaker等，1983，Biotechnology(N.Y.)1:691-696獲得。所`述里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)可以依照Terri等，1987，Gene51:43-52獲得。所述具有纖維素結合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶可以依照WO2001/79507獲得。所述不具有纖維素結合域的嗜熱毀絲霉CEL7纖維二糖水解酶可以依照WO2003/000941獲得。所述土生梭孢殼纖維二糖水解酶可以依照WO2006/074435獲得。[0184]在另一個優選的方面，所述葡糖苷酶獲自米曲霉。在另一個優選的方面，所述葡糖苷酶獲自煙曲霉。在另一個優選的方面，所述葡糖苷酶獲自巴西青霉(Penicilliumbrasilianum),例如巴西青霉IBT20888株。在另一個優選的方面，所述β_葡糖苷酶獲自黑曲霉。在另一個優選的方面，所述β_葡糖苷酶獲自棘孢曲霉。在一個更優選的方面，所述米曲霉β-葡糖苷酶是SEQIDNO:16的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述煙曲霉葡糖苷酶是SEQIDΝ0:18的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述巴西青霉葡糖苷酶是SEQIDNO:20的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述黑曲霉β_葡糖苷酶是SEQIDNO:22的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述棘孢曲霉β-葡糖苷酶是SEQIDNO:24的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述米曲霉β-葡糖苷酶由SEQIDNO:15的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述煙曲霉葡糖苷酶由SEQIDΝ0:17的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述巴西青霉葡糖苷酶由SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述黑曲霉β-葡糖苷酶由SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述棘孢曲霉葡糖苷酶由SEQIDΝ0:23的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。[0185]所述具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可以根據WO2002/095014獲得。所述具有β-葡糖苷酶活性的煙曲霉多肽可以根據WO2005/047499獲得。所述具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可以根據WO2007/019442獲得。所述具有β_葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可以根據Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980獲得。所述具有β_葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可以根據Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288獲得。[0186]在另一個優選的方面，SEQIDNO:16的成熟多肽是由大腸桿菌DSM14240中所含質粒中含有的多核苷酸編碼的。在另一個優選的方面，SEQIDNO:18的成熟多肽是由大腸桿菌NRRLB-30695中所含質粒pEJG113中含有的多核苷酸編碼的。在另一個優選的方面，SEQIDNO:20的成熟多肽是由大腸桿菌NRRLB-30860中所含質粒pKKAB中含有的多核苷酸編碼的。[0187]在另一個優選的方面，所述葡糖苷酶是SEQIDNO:26的米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白。在另一個優選的方面，所述米曲霉葡糖苷酶變體BG融合蛋白由SEQIDNO:25的多核苷酸編碼。在另一個優選的方面，所述β-葡糖苷酶是SEQIDΝ0:28的米曲霉β_葡糖苷酶融合蛋白。在另一個優選的方面，所述米曲霉β_葡糖苷酶融合蛋白由SEQIDNO:27的多核苷酸編碼。[0188]本發明可用的其它β_葡糖苷酶實例包括但不限于米曲霉β_葡糖苷酶(W002/095014;WO04/099228);棘孢曲霉β-葡糖苷酶(Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288)；Aspergillusavenaceusβ-葡糖苷酶(GenBank?登錄號ΑΥ943971);煙曲霉葡糖苷酶(GenBank?登錄號ΧΜ745234);川地曲霉β-葡糖苷酶(GenBank?登錄號AB003470);黑曲霉β-葡糖苷酶(GenBank?AJl32386);灰色梨抱菌(Magnaporthegrisea)β-葡糖苷酶(GenBank?登錄號ΑΥ849670);黃孢平革菌β-葡糖苷酶(GenBank?登錄號AB253327)；Talaromycesemersoniiβ-葡糖苷酶(GenBank?登錄號ΑΥ072918)和里氏木霉β-葡糖苷酶(GenBank?登錄號U09580,AB003110,AY281374,AY281375,AY281377,AY281378和AY281379)。β-葡糖苷酶的變體也可使用，如WO04/099228中記載的那些。[0189]其它葡糖苷酶在根據以下文獻分類得到的13個以上的糖基水解酶家族中公開:HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316和HenrissatB.,andBairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696。[0190]應當理解的是，就前文所述的物種而言，本發明涵蓋了它們的完全和不完全狀態，以及其它分類學上的等同物，例如無性型，不管它們已知的種名是什么。本領域技術人員可以很容易地識別出合適的等同物的身份。[0191]公眾可以在若干保藏機構容易地獲取這些物種的菌株，這樣的機構諸如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)和北方區域研究中心農業研究機構專利培養物保藏中心(NRRL)。[0192]此外，還可以使用上文所述的探針，從包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等等)分離的微生物在內的來源鑒定和獲取這樣的多肽。用于從天然生境分離微生物的技術是本領域中公知的。然后可以通過類似地篩選此類微生物的基因組文庫或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用探針檢測到了編碼多肽的多核苷酸序列，就可以使用本領域普通技術人員公知的技術(參見例如Sambrook等，1989同上)分離或者克隆該多核苷酸。[0193]具有纖維素分解酶活性的多肽還包括融合的多肽或者可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在所述多肽或其具有纖維素分解酶活性的片段的N-末端或C-末端。融合的多肽是通過將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到編碼具有纖維素分解酶活性的多肽的核苷酸序列(或其部分)而產生的。用于產生融合多肽的技術是本領域已知的，包括將編碼各多肽的編碼序列連接起來使它們符合閱讀框，并使得被融合的多肽的表達處于相同的啟動子和終止子的控制之下。[0194]融合多肽還可以包含切割位點。融合蛋白一旦被分泌，該位點就被切割，從融合蛋白中釋放出具有纖維素分解酶活性的多肽。切割位點的實例包括但不限于:Kex2位點，其編碼二肽Lys-Arg(Martin等,2003,J.1nd.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-ffiIson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；ffard等，1995，Biotechnology13:498-503；和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其被因子Xa蛋白酶在精氛酸殘基之后切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其被腸激酶在賴氨酸之后切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其被GenenaseI切割(Carter等，1989，Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其被凝血酶在Arg之后切割(Stevens,2003,DrugDiscoveryWorld4:35-48);Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其被TEV蛋白酶在Gln之后切割(Stevens,2003,同上)；以及Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其被一種基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶在Gln之后切割(Stevens，2003，同上)。[0195]在一個優選的方面，纖維素分解酶組合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內切葡聚糖酶I(CEL7B)。[0196]在另一個優選的方面，纖維素分解酶組合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內切葡聚糖酶I(CEL7B)，其還包含一種或多種選自下組的酶:里氏木霉內切葡聚糖酶11(CEL5A)、里氏木霉內切葡聚糖酶V(CEL45A)和里氏木霉內切葡聚糖酶III(CEL12A)。[0197]在另一個優選的方面，纖維素分解酶組合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內切葡聚糖酶I(CEL7B)，其還包含土生梭孢殼纖維二糖水解酶。[0198]在另一個優選的方面，纖維素分解酶組合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內切葡聚糖酶I(CEL7B)，其還包含(I)一種或多種選自下組的酶:里氏木霉內切葡聚糖酶II(CEL5A)、里氏木霉內切葡聚糖酶V(CEL45A)和里氏木霉內切葡聚糖酶III(CEL12A)，和/或還包含(2)土生梭孢殼纖維二糖水解酶。[0199]在另一個優選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含選自下組的一種或多種(數種)組分:有內切葡聚糖酶活性的嗜熱毀絲霉CEL7多肽，有內切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL12多妝，有內切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL45多肽,有纖維二糖水解酶活性并具有纖維素結合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7多肽，和有纖維二糖水解酶活性而沒有纖維素結合域的嗜熱毀絲霉CEL7多肽。在另一個優選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含有內切葡聚糖酶活性的嗜熱毀絲霉CEL7多肽,有內切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL12多肽,有內切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL45多肽，有纖維二糖水解酶活性并具有纖維素結合域的CEL7多肽，和有纖維二糖水解酶活性而沒有纖維素結合域的嗜熱毀絲霉CEL7多肽。在另一個優選的方面，上述組合物還包含一種或多種(數種)具有β_葡糖苷酶的多肽。[0200]所述纖維素分解酶組合物還可以是商業制備物。適用于本發明的商業纖維素分解酶制備物的實例包括，例如，CELLUCLAST?(可獲自NovozymesA/S)和N0V0ZYM?188(可獲自NovozymesA/S)。其它可用的商品化制備物包括CELLUZYME?、CEREFL0?和ULTRAFL0?(NovozymesA/S)，LAMINEX?和SPEZYME?CP(GenencorInt.),R0HAMENT?7069ff(RohmGmbH)，和FIBREZYME?LDI，FIBREZYME?LBR,或VISCOSTAR?150L(DyadicInternational,Inc.,Jupiter,FL,USA)。[0201]可用于本發明的其它纖維素分解蛋白在下列文獻中有記載:EP495，257、EP531，315、EP531，372、WO89/09259、WO94/07998、WO95/24471、WO96/11262、WO96/29397、WO96/034108、WO97/14804、WO98/08940、WO98/012307、WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO98/028411、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025846、WO99/025847、WO99/031255、WO2000/009707,WO2002/050245、WO2002/0076792、WO2002/101078、WO2003/027306,WO2003/052054,WO2003/052055,WO2003/052056,WO2003/052057、WO2003/052118,WO2004/016760,WO2004/043980,WO2004/048592,WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050,WO2005/093073,WO2006/074005,WO2006/117432、WO2007/071818、W`O2007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美國專利4，435，307、美國專利5，457，046、美國專利5，648，263、美國專利5，686，593、美國專利5，691，178、美國專利5，763，254、和美國專利5，776，757。[0202]本發明的方法中使用的纖維素分解蛋白可以通過利用本領域已知的程序，用含有合適的碳源及氮源和無機鹽的營養培養基發酵上文提到的微生物菌株來加以生產(參見例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(編輯)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress，CA，1991)。合適的培養基可以從供應商獲得，或者可以依照公開的組成(例如美國典型培養物保藏中心的目錄中)來制備。適于生長和纖維素分解蛋白產生的溫度范圍及其它條件是本領域已知的(參見例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。[0203]發酵可以是任何培養細胞而導致纖維素分解蛋白的表達或分離的方法。因此，發酵可以理解為包括在實驗室或工業發酵罐中實施的搖瓶培養、或小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)，其在合適的培養基中，在容許纖維素分解蛋白表達或分離的條件下進行。依照上述方法所得的纖維素分解蛋白可以從發酵培養基回收并通過如本文描述的常規程序加以純化。[0204]具有纖維素分解增強活性的多肽[0205]在第一方面，具有纖維素分解增強活性的分離的多肽包含以下基序:[0206][ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV],[0207]其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸并且X(4)是在4個連鄰接位置上的任何氨基酸。[0208]包含上述基序的分離的多肽可進一步包含:[0209]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]，[0210][EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或[0211]H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[0212][EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，[0213]其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在I個位置或2個鄰接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸并且X(2)是在2個鄰接位置上的任何氨基酸。在以上基序中，采用公認的IUPAC單字母氨基酸縮寫。[0214]在優選的方面，具有纖維素分解增強活性的分離的多肽進一步包含H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]0在另一優選的方面，具有纖維素分解增強活性的分離的多肽還包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一優選的方面，具有纖維素分解增強活性的分離的多肽還包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]_X_Y_X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。[0215]在第二方面，具有纖維素分解增強活性的分離的多肽包含以下基序:[0216][ILMV]-P-X(4，5)—G—x—Y—[ILMV]—x—R—x—[EQ]-χ(3)-Α-[HNQ]，[0217]其中χ是任何氨基酸，χ(4，5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸以及χ(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸。在以上基序中，采用公認的IUPAC單字母氨基酸縮寫。[0218]在第三個方面，具有纖維素分解增強活性的分離的多肽具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有優選至少60%，更優選至少65%，更優選至少70%，更優選至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，并且甚至最優選至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，所述多肽具有纖維素分解增強活性(下文中的“同源多肽”)。在優選的方面，所述同源多肽具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽有十個氨基酸，優選五個氨基酸，更優選四個氨基酸，甚至更優選三個氨基酸，最優選兩個氨基酸以及甚至最優選一個氨基酸的不同。[0219]具有纖維素分解增強活性的多肽優選包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:2的成熟多肽。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸20至326，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸20至326。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體組成；或者由它們具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:2的氨基酸序列組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:2的成熟多肽組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸20至326或其等位變體組成；或者由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸20至326組成。[0220]具有纖維素分解增強活性的多肽優選包含SEQIDN0:4的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:4的氨基酸序列。在另一優選的方面，多肽包含SEQIDN0:4的成熟多肽。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸18至240，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:4的氨基酸18至240。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:4的氨基酸序列組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:4的成熟多肽組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的氨基酸18至240或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:4的氨基酸18至240組成。[0221]具有纖維素分解增強活性的多肽優選包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:6的氨基酸序列。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:6的成熟多肽。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸20至258，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸20至258。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:6的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:6的氨基酸序列組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:6的成熟多肽組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:6的氨基酸20至258或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:6的氨基酸20至258組成。`[0222]具有纖維素分解增強活性的多肽優選包含SEQIDNO:8的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:8的氨基酸序列。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:8的成熟多肽。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:8的氨基酸19至226，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:8的氨基酸19至226。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:8的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:8的氨基酸序列組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:8的成熟多肽組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:8的氨基酸19至226或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:8的氨基酸19至226組成。[0223]具有纖維素分解增強活性的多肽優選包含SEQIDNO:10的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸序列。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的成熟多肽。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸20至304，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸20至304。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸序列組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的成熟多肽組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸20至304或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸20至304組成。[0224]具有纖維素分解增強活性的多肽優選包含SEQIDNO:12的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的成熟多肽。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸23至250，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸23至250。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸序列組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的成熟多肽組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸23至250或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸23至250組成。[0225]具有纖維素分解增強活性的多肽優選包含SEQIDNO:14的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的氨基酸序列。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的成熟多肽。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的氨基酸20至249，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在另一優選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的氨基酸20至249。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸序列組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的成熟多肽組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸20至249或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸20至249組成。[0226]SEQIDNO:2的成熟多肽的片段優選包含至少277個氨基酸殘基、更優選至少287個氨基酸殘基、最優選至少297個氨基酸殘基。SEQIDNO:4的成熟多肽的片段優選包含至少185個氨基酸殘基、更優選至少195個氨基酸殘基、最優選至少205個氨基酸殘基。SEQIDN0:6的成熟多肽的片段優選包含至少200個氨基酸殘基、更優選至少212個氨基酸殘基、最優選至少224個氨基酸殘基。SEQIDNO:8的成熟多肽的片段優選包含至少175個氨基酸殘基、更優選至少185個氨基酸殘基、最優選至少195個氨基酸殘基。SEQIDNO:10的成熟多肽的片段優選包含至少240個氨基酸殘基、更優選至少255個氨基酸殘基、最優選至少270個氨基酸殘基。SEQIDNO:12的成熟多肽的片段優選包含至少175個氨基酸殘基、更優選至少190個氨基酸殘基、最優選至少205個氨基酸殘基。SEQIDNO:14的成熟多肽的片段優選包含至少200個氨基酸殘基、更優選至少210個氨基酸殘基、最優選至少220個氣基酸殘基。[0227]SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的子序列優選包含至少831個核苷酸、更優選至少861個核苷酸、最優選至少891個核苷酸。SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列的子序列優選包含至少555個核苷酸、更優選至少585個核苷酸、最優選至少615個核苷酸。SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列的子序列優選包含至少600個核苷酸、更優選至少636個核苷酸、最優選至少672個核苷酸。SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列的子序列優選包含至少525個核苷酸、更優選至少555個核苷酸、最優選至少585個核苷酸。SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列的子序列優選包含至少720個核苷酸、更優選至少765個核苷酸、最優選至少810個核苷酸。SEQIDNO:11核苷酸67-796的成熟多肽編碼序列的子序列優選包含至少525個核苷酸、更優選至少570個核苷酸、最優選至少615個核苷酸。SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的子序列優選包含至少600個核苷酸、更優選至少630個核苷酸、最優選至少660個核苷酸。[0228]在第四個方面，所述具有纖維素分解增強活性的分離的多肽是由在至少非常低嚴緊度條件、優選至少低嚴緊度條件、更優選至少中嚴緊度條件、更優選至少中-高嚴緊度條件、進一步更優選至少高嚴緊度條件、最優選至少非常高嚴緊度條件下與以下序列雜交的多核苷酸編碼的:(i)SEQIDN0:USEQIDNO:3,SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9,SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:KSEQIDN0:3、SEQIDN0:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列含有的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7,SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)⑴或(ii)的子序列，或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,同上)。SEQIDNO:USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:`13的成熟多肽編碼序列的子序列包含至少100個鄰接核苷酸或優選至少200個鄰接核苷酸。而且，所述子序列可編碼具有纖維素分解增強活性的多肽片段。在一個優選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸388-1332、SEQIDNO:3的核苷酸98-821、SEQIDNO:5的核苷酸126-978、SEQIDN0:7的核苷酸55-678、SEQIDNO:9的核苷酸58-912、SEQIDNO:11的核苷酸67-796或SEQIDNO:13的核苷酸77-766。[0229]同上所述，SEQIDNO:USEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的核苷酸序列，或其子序列；以及SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDN0:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10,SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的氨基酸序列，或其片段可用于設計核酸探針以從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的DNA。[0230]就本發明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9,SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列、包含在SEQIDNO:KSEQIDNO:3,SEQIDN0:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列、或包含SEQIDNO:7,SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列、它的全長互補鏈或其亞序列，如上文所述。[0231]在優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332。在另一優選的方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一優選的方面,核酸探針是包含在質粒pEJG120中的多核苷酸序列,所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30699中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一優選的方面，核酸探針是包含在質粒PEJG120中的成熟多肽編碼序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30699中。[0232]在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDN0:3的核苷酸98至821。在另一優選的方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:4的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3。在另一優選的方面,核酸探針是包含在質粒pTter61C中的多核苷酸序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30813中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一優選的方面，核酸探針是包含在質粒pTter61C中的成熟多肽編碼序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30813中。[0233]在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:5的核苷酸126至978。在另一優選的方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:6的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDN0:5。在另一優選的方面,核酸探針是包含在質粒pTter61D中的多核苷酸序列,所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30812中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一優選的方面，核酸探針是包含在質粒pTter61D中的成熟多肽編碼序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30812中。[0234]在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7的核苷酸55至678。在另一優選的方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:8的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7。在另一優選的方面,核酸探針是包含在質粒pTter6IE中的多核苷酸序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30814中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一優選的方面，核酸探針是包含在質粒PTter61E中的成熟多肽編碼序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30814中。[0235]在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDN0:9的核苷酸58至912。在另一優選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:10的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDN0:9。在另一優選的方面,核酸探針是包含在質粒pTter61G中的多核苷酸序列,所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30811中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一優選的方面，核酸探針是包含在質粒pTter61G中的成熟多肽編碼序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30811中。[0236]在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:11的核苷酸67至796。在另一優選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:12的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNOill0在另一優選的方面，核酸探針是包含在質粒PDZA2-7中的多核苷酸序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一優選的方面，核酸探針是包含在質粒PDZA2-7中的成熟多肽編碼序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。[0237]在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:13的核苷酸77至766。在另一優選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:14的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:13ο在另一優選的方面，核酸探針是包含在質粒pTr333中的多核苷酸序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一優選的方面，核酸探針是包含在質粒PTr333中的成熟多肽編碼序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中。[0238]對于長度至少100個核苷酸的長探針，非常低至非常高的嚴緊條件如在本文中所定義。[0239]對于長度至少100個核苷酸的長探針，載體材料的最終洗滌如在本文中定義。[0240]對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，嚴緊條件如本文所定義。[0241]對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，載體材料的最終洗滌如在本文中定義。[0242]在第五方面，具有纖維素分解增強活性的多肽由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列組成的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優選至少60%，更優選至少65%，`更優選至少70%，更優選至少75%，甚至更優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，并且甚至最優選至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，其編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。[0243]在一個優選的方面，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332、SEQIDNO:3的核苷酸98至821、SEQIDNO:5的核苷酸126至978、SEQIDNO:7的核苷酸55至678、SEQIDNO:9的核苷酸58至912、SEQIDNO:11的核苷酸67至796、SEQIDNO:13的核苷酸77至766。參見本文中的多核苷酸部分。[0244]在第六個方面，具有纖維素分解增強活性的多肽是人工變體，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的SEQIDNO:2,SEQIDNO:4、SEQIDN0:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10,SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽或其同源序列。制備這樣的人工變體的方法如上所述。[0245]SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數是10，優選9，更優選8，更優選7，更優選至多6，更優選5，更優選4，甚至更優選3，最優選2，并且甚至最優選I。[0246]具有纖維素分解增強活性的多肽的來源[0247]具有纖維素分解增強活性的多肽可從任何屬的微生物獲得。在一個優選的方面，從給定來源獲得的多肽分泌至胞外。[0248]具有纖維素分解增強活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽，例如具有纖維素分解增強活性的芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬或海洋芽孢桿菌屬多肽；或者可以是革蘭氏陰性細菌多肽，例如具有纖維素分解增強活性的大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬或脲原體屬多肽。[0249]在優選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌多肽。[0250]在另一優選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種多肽。[0251]在另一優選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的不產色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌或淺青紫鏈霉菌多肽。[0252]具有纖維素分解增強活性的多肽還可以是真菌多肽，并且更優選是酵母多肽例如具有纖維素分解增強活性的念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬多肽；或更優選是絲狀真菌多肽例如具有纖維素分解增強活性的枝頂孢霉屬、蘑菇屬、鏈格孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、葡萄座腔菌屬、擬蠟菌屬、毛殼菌屬、金孢子菌屬、麥角屬、旋孢腔菌屬、Coprinopsis、Coptotermes、棒囊殼屬、栗疫病菌屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、網孢菌屬、鐮孢屬、赤霉屬、全鞭毛蟲屬、腐質霉屬、IE菌屬、香燕屬、小球腔菌屬、梨孢菌屬、Melanocarpus、多孔菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、Poitrasia、假黑盤菌屬、Pseudotrichonympha、根毛霉屬、裂褶菌屬、柱頂孢屬、踝節菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬或木霉屬、Trichophaea、輪枝孢屬、小包腳燕屬、或炭角菌屬(Xylaria)多肽。[0253]在優選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。[0254]在另一個優選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉黑曲霉、米曲霉、嗜角質金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質霉(Humicolagrisea)、特異腐質霉、疏棉狀腐質霉、乳白耙菌、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉、產紫青霉、黃抱平革菌、無色梭抱殼、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼、Thielaviafimet1、小抱子梭抱殼、Thielaviaovispora>Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭孢殼、Thielaviasubthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、綠色木霉或Trichophaeasaccata多肽。[0255]在更優選的方面，多肽是具有纖維素分解增強活性的土生梭孢霉多肽。在最優選的方面。多肽是具有纖維素分解增強活性的土生梭孢霉NRRL8126多肽，例如，SEQIDNO:2、4、6、8或10的成熟多肽或其具有纖維素分解增強活性的片段。[0256]在另一更優選的方面，多肽是橙色嗜熱子囊菌多肽，例如，SEQIDN0:12的成熟多肽。[0257]在另一更優選的方面，多肽是具有纖維素分解增強活性的里氏木酶多肽。在另一最優選的方面，多肽是具有纖維素分解增強活性的里氏木酶RutC30(ATCC56765)多肽，例如，SEQIDNO:14的成熟多肽或其具有纖維素分解增強活性的片段。[0258]可理解的是對于前述的種，本發明包含完全和不完全階段兩種，和其它分類學的等同物，例如無性型，無論它們已知的種名。本領域熟練技術人員將輕易地識別適合的等同物的身份。[0259]公眾可以在若干保藏機構容易地獲取這些物種的菌株，這樣的機構諸如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DSM)，真菌菌種保藏中心(CBS)和北方區域研究中心農業研究機構專利培養物保藏中心(NRRL)。[0260]此外，還可以使用本文描述的上述探針，從包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等等)分離的微生物在內的其它來源鑒定和獲取這樣的多肽。[0261]具有纖維素分解增強活性的多肽還包括融合多肽或者可切割的融合多肽，其中另一多肽融合于具有纖維素分解增強活性的所述多肽或其片段的N-末端或C-末端，并如本文所述，還可以包含切割位點。[0262]具有纖維素分解活性的多肽及其多核苷酸的更多細節，請參見以參考方式并入本文的WO2005/074647、WO2005/074656和公布的美國專利申請序列號2007/0077630。[0263]編碼具有纖維素分解增強`活性的多肽的多核苷酸[0264]包含編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸可以被分離并用于實踐本文所述的本發明的方法。[0265]多肽包含如下多核苷酸序列，所述多核苷酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDN0:11*4SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優選至少60%，更優選至少65%，更優選至少70%，更優選至少75%，甚至更優選至少80%,更優選至少85%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，以及甚至最優選至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，其編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。[0266]在優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1或由SEQIDNO:1組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含質粒PEJG120中包含的序列或由該序列組成，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30699中。在另一個優選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質粒PEJG120中包含的成熟多肽編碼序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30699中。本發明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDN0:1。本發明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強活性的SEQIDNO:2的片段。[0267]在另一優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:3或由SEQIDNO:3組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質粒pTter61C中包含的序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30813中。在另一個優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含質粒pTter61C中包含的成熟多肽編碼序列或由質粒pTter61C中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30813中。本發明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:4的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:3。本發明還涉及SEQIDN0:3的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強活性的SEQIDN0:4的片段。[0268]在另一優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:5或由SEQIDNO:5組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質粒pTter61D中包含的序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30812中。在另一個優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含質粒pTter61D中包含的成熟多肽編碼序列或由質粒pTter61D中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30812中。本發明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:6的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:5。本發明還涉及SEQIDN0:5的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強活性的SEQIDN0:6的片段。[0269]在另一優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:7或由SEQIDNO:7組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質粒pTter61E中包含的序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30814中。在另一個優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含質粒pTter61E中包含的成熟多肽編碼序列或由質粒pTter61E中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30814中。本發明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:8的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDN0:7。本發明還涉及SEQIDN0:7的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強活性的SEQIDN0:8的片段。[0270]在另一優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:9或由SEQIDNO:9組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質粒pTter61G中包含的序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30811中。在另一個優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含質粒pTter61G中包含的成熟多肽編碼序列或由質粒pTter61G中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30811中。本發明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:10的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDN0:9。本發明還涉及SEQIDN0:9的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強活性的SEQIDNO:10的片段。[0271]在另一優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDN0:11或由SEQIDN0:11組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質粒PDZA2-7中包含的序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。在另一個優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含質粒PDZA2-7中包含的成熟多肽編碼序列或由質粒PDZA2-7中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。本發明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:22的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNOill0本發明還涉及SEQIDNO:11的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強活性的SEQIDNO:12的片段。[0272]在另一優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDN0:13或由SEQIDN0:13組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質粒pTr3337中包含的序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中。在另一個優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含質粒pTr3337中包含的成熟多肽編碼序列或由質粒pTr3337中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中。本發明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:14的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:13或其成熟多肽編碼序列。本發明還涉及SEQIDNO:13的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強活性的SEQIDNO:14的片段。[0273]本發明還涉及在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9,SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變的突變多核苷酸，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDN0:2、SEQIDNO:4,SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10,SEQIDN0:12或SEQIDNO:14的成熟多肽。在優選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至326，SEQIDNO:4的氨基酸18至240，SEQIDNO:6的氨基酸20至258，SEQIDNO:8的氨基酸19至226或SEQIDNO:10的氨基酸20至304，SEQIDNO:12的氨基酸23至250或SEQIDNO:14的氨基酸20至249。在另一優選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332，SEQIDN0:3的核苷酸98至821，SEQIDNO:5的核苷酸126至978，SEQIDNO:7的核苷酸55至678，SEQIDNO:9的核苷酸58至912，SEQIDNO:11的核苷酸67至796，SEQIDNO:13的核苷酸77至766。[0274]如早前所述，用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。[0275]所述多核苷酸也可以是編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸在至少極低嚴緊條件下，優選至少低嚴緊條件下，更優選至少中嚴緊條件下，更優選至少中-高嚴緊條件下，甚至更優選至少高嚴緊條件下，并且最優選至少非常高嚴緊條件下，與以下雜交:(i)SEQIDN0:USEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3,SEQIDN0:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列或包含SEQIDN0:7、SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；或其等位變體和亞序列(Sambrook等，1989,同上)，如本文所定義。在優選的方面，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332，SEQIDN0:3的核苷酸98至821，SEQIDNO:5的核苷酸126至978，SEQIDNO:7的核苷酸55至678，SEQIDN0:9的核苷酸58至912，SEQIDNO:11的核苷酸67至796，或SEQIDNO:13的核苷酸77至766。[0276]核酸構建體[0277]可以將編碼具有纖維素分解增強活性的多肽或具有纖維素分解酶活性的多肽的分離的多核苷酸用多種方法進行操作，以通過構建核酸構建體提供多肽的表達，所述核酸構建體含有與一種或多種控制序列可操作連接的編碼所述多肽的分離的多核苷酸，所述控制序列指導編碼序列在合適的宿主細胞中在與這些控制序列相容的條件下表達。取決于表達載體，在插入載體之前對多核苷酸的序列進行操作可能是理想的或者必要的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域公知的。[0278]控制序列可以是合適的啟動子序列，啟動子序列是被宿主細胞所識別來表達編碼這樣的多肽的多核苷酸的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子序列可以是任何在所選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性的核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，而且可以從對宿主細胞而言為同源或異源的胞外或胞內多肽獲得。[0279]適于指導核酸構建體的轉錄，尤其是在細菌宿主細胞中轉錄的啟動子的例子是獲自大腸桿菌Iac操縱子、天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、以及原核β-內酰胺酶基因的啟動子(Villa-KamarofT等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),和tac啟動子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。ScientificAmerican,1980,242:74-94中"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"和Sambrook等，1989(同上)中描述了其它啟動子。[0280]適于在絲狀真菌宿主細胞中指導核酸構建體的轉錄的啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子:米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉喊性蛋白酶、米曲霉憐酸丙糖異構酶、構桌曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W0`00/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內切葡聚糖酶1、里氏木霉內切葡聚糖酶I1、里氏木霉內切葡聚糖酶II1、里氏木霉內切葡聚糖酶IV、里氏木霉內切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉β-木糖苷酶；以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖異構酶基因的啟動子的雜合體)；以及它們的突變、截短和雜合的啟動子。[0281]在酵母宿主中，有用的啟動子是從釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母磷酸丙糖異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因獲得的。對酵母宿主細胞有用的其他啟動子在Romanos等，1992，Yeast8:423-488中有記載。[0282]控制序列還可以是合適的轉錄終止子序列。終止子序列是被宿主細胞識別來終止轉錄的序列。終止子序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的3’末端。任何可在所選的宿主細胞中發揮功能的終止子都可以用于本發明。[0283]優選的用于絲狀真菌宿主細胞的終止子是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因獲得的。[0284]優選的用于酵母宿主細胞的終止子是從釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得的。對酵母宿主細胞有用的其他終止子在Romanos等,1992(同上)中有記載。[0285]控制序列也可以是合適的前導序列，前導序列是mRNA中的一種不被翻譯的區域，它對于宿主細胞進行的翻譯而言是重要的。前導序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’末端。任何可在所選擇的宿主細胞中發揮功能的前導序列都可以用于本發明。[0286]優選的用于絲狀真菌宿主細胞的前導序列是從米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉磷酸丙糖異構酶的基因獲得的。[0287]用于酵母宿主細胞的前導序列是從釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因獲得的。[0288]控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，聚腺苷酸化序列是一段與核苷酸序列的3’末端可操作連接的序列，轉錄后被宿主細胞所識別，作為向被轉錄的mRNA添加聚腺苷酸殘基的信號。任何可在所選擇的宿主細胞中發揮功能的聚腺苷酸化序列都可以用于本發明。[0289]優選的用于絲狀真菌宿主細胞的聚腺苷酸化序列是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖昔酶的基因獲得的。[0290]Guo和Sherman,1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990記載了在酵母宿主細胞中有用的聚腺苷酸化序列。[0291]控制序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼的氨基酸序列連接于多肽的氨基末端，并引導被編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列的5’端可以固有地包含信號肽編碼序列，該序列天然地以符合翻譯閱讀框的方式連接于編碼區中編碼分泌型多肽的區段。或者，編碼序列的5’端可以包含對該編碼序列而言為外源的信號肽編碼序列。在編碼序列天然地不包含信號肽編碼序列的場合，可能需要外源信號肽編碼序列。或者，可以簡單地用外源信號肽編碼序列取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，引導被表達的多肽進入所選的宿主細胞的分泌途徑，即分泌到培養基中的任何信號肽編碼序列都可以用于本發明。[0292]對細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從芽孢桿菌NCIB11837產麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢桿菌prsA的基因獲得的信號妝編碼序列。Simonen和Palva,1993，MicrobiologicalReviews57:109-137記載了其它信號肽。[0293]對絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質霉纖維素酶、特異腐質霉內切葡聚糖酶V、和疏棉狀腐質霉脂肪酶的基因獲得的信號肽編碼序列。[0294]在一個優選的方面，信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1_19或者由SEQIDNO:2的氨基酸1-19組成。在另一個優選的方面，信號肽編碼區包含SEQIDNO:1的核苷酸330-387或者由SEQIDNO:1的核苷酸330-387組成。[0295]在另一個優選的方面，信號肽包含SEQIDNO:4的氨基酸1_17或者由SEQIDN0:4的氨基酸1-17組成。在另一個優選的方面，信號肽編碼區包含SEQIDN0:3的核苷酸47-97或者由SEQIDNO:3的核苷酸47-97組成。[0296]在另一個優選的方面，信號肽包含SEQIDNO:6的氨基酸1_19或者由SEQIDN0:6的氨基酸1-19組成。在另一個優選的方面，信號肽編碼區包含SEQIDN0:5的核苷酸69-125或者由SEQIDNO:5的核苷酸69-125組成。[0297]在另一個優選的方面，信號肽包含SEQIDN0:8的氨基酸1_18或者由SEQIDNO:8的氨基酸1-18組成。在另一個優選的方面，信號肽編碼區包含SEQIDNO:7的核苷酸1-54或者由SEQIDNO:7的核苷酸1-54組成。[0298]在另一個優選的方面，信號肽包含SEQIDNO:10的氨基酸1_19或者由SEQIDNO:10的氨基酸1-19組成。在另一個優選的方面，信號肽編碼區包含SEQIDNO:9的核苷酸1-57或者由SEQIDNO:9的核苷酸1-57組成。[0299]在另一個優選的方面，信號肽包含SEQIDNO:12的氨基酸1_22或者由SEQIDNO:12的氨基酸1-22組成。在另一個優選的方面，信號肽編碼區包含SEQIDNO:11的核苷酸1-66或者由SEQIDNO:11的核苷酸1_66組成。[0300]在另一個優選的方面，信號肽包含SEQIDNO:14的氨基酸1_19或者由SEQIDNO:14的氨基酸1-19組成。在另一個優選的方面，信號肽編碼區包含SEQIDNO:13的核苷酸20-76或者由SEQIDNO:13的核苷酸20-76組成。[0301]對酵母宿主細胞有用的信號肽是從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶獲得的。其它有用的信號肽編碼序列在Romanos等，1992，同上文中有記載。`[0302]控制序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽的氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽被稱為酶原(proenzyme)或原多肽(propolypeptide)(或者在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是沒有活性的，并且通過將前肽從原多肽中催化或自催化切割出來可以轉化為成熟的活性多肽。前肽編碼序列可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶的基因獲得(W095/33836)。[0303]在信號肽和前肽序列都存在于多肽氨基末端的場合，前肽序列位于多肽氨基末端的相鄰位置，而信號肽序列位于前肽序列的氨基末端的相鄰位置。[0304]添加這樣的調控序列可能也是理想的:該序列容許相對于宿主細胞的生長調節多肽的表達。調控系統的例子有導致基因的表達響應于化學或物理刺激(包括調控性化合物的存在)而開啟或關閉的那些調控系統。原核系統中的調控系統包括lac、tac、和trp操縱基因系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GALl系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調控序列。其他調控序列的例子有使基因能夠擴增的調控序列。在真核系統中，這些調控序列包括在甲氨蝶呤存在下被擴增的二氫葉酸還原酶基因，和在重金屬存在下被擴增的金屬硫蛋白基因。在這些場合，編碼多肽的核苷酸序列將與調控序列可操作地連接。[0305]表達載體[0306]可以將本文中描述的各種核酸和控制序列連接起來產生重組表達載體，其包含編碼具有纖維素分解增強活性的多肽或具有纖維素分解酶活性的多肽、啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。所述表達載體可包括一個或多個便利的限制性位點以便于在這些位點上插入或替換編碼多肽的多核苷酸序列。或者，可以將多核苷酸序列或包含該序列的核酸構建體插入合適的表達用載體來表達編碼這樣的多肽的多核苷酸序列。在生成表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中使得該編碼序列與合適的表達用控制序列可操作地連接。[0307]重組表達載體可以是任何可便利地進行重組DNA程序并且能夠帶來多核苷酸序列的表達的載體(例如質粒或病毒)。載體的選擇通常將取決于載體與該載體要導入的宿主細胞的相容性。載體可以是線性的或者閉合環狀的質粒。[0308]所述載體可以是自主復制的載體，即作為染色體外實體存在，其復制不依賴于染色體復制的載體，例如質粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可含有任何用于保證自我復制的工具。或者，載體可以是這樣的載體，當它被導入宿主細胞時，整合到基因組中并隨同它整合到其中的染色體一起復制。另外，可以使用單一的載體或質粒，或兩個或更多個共同包含要導入宿主細胞基因組的總DNA的載體或質粒，或者轉座子。[0309]載體優選含有一個或多個選擇標記,這些標記容許容易地選擇經過轉化、轉染、轉導等的細胞。選擇標記是這樣的基因，其產物可提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性，對營養缺陷型的原養性，等等。[0310]細菌選擇標記的例子有來自枯草芽孢桿菌或者地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性的標記。用于酵母宿主細胞的合適標記有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉移酶)、bar(草銨膦乙酰轉移酶)、hph(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脫羧酶)、SC(硫酸腺苷轉移酶)，和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，以及它們的等同物。優選用于曲霉細胞的是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，以及吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。[0311]載體優選包含容許載體整合到宿主細胞的基因組或者容許載體在細胞中不依賴基因組自主復制的元件。[0312]為了整合到宿主細胞基因組中，載體可能依賴多核苷酸的編碼多肽的序列或者載體的任何其它元件來通過同源或異源重組整合到基因組中。或者，載體可含有附加的核苷酸序列，用來指導通過同源重組在染色體上的精確位置整合到宿主細胞的基因組中。為了增加在精確位置上整合的機率，整合元件優選應含有足夠數目的與相應靶序列具有高度同一性的核酸，諸如100-10，000個堿基對，優選400-10，000個堿基對，最優選800-10，000個堿基對，以提高同源重組的概率。整合元件可以是任何與宿主細胞基因組中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非編碼的或者編碼的核苷酸序列。此外，載體可以通過非同源重組整合到宿主細胞基因組中。[0313]為了自主復制,載體可進一步包含復制起點，該起點使得載體能夠在所討論的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是在細胞中發揮功能的任何介導自主復制的質粒復制子。術語“復制起點”或“質粒復制子”在本文中定義為使質粒或載體能夠在體內復制的核苷酸序列。[0314]細菌復制起點的實例有容許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，以及容許在芽孢桿菌屬中復制的質粒pUB110、pE194、pTA1060和ρΑΜβI的復制起點。[0315]用于在酵母宿主細胞中的復制起點的例子有2微米復制起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合，以及ARS4和CEN6的組合。[0316]在絲狀真菌細胞中有用的復制起點的例子有AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175；W000/24883)。AMAl基因的分離，以及包含該基因的質粒或載體的構建，可以根據WO00/24883中公開的方法來實現。[0317]可以向宿主細胞中插入編碼這樣的多肽的多核苷酸的多于一個拷貝以增加所述多肽的生產。可以通過下述方法獲得多核苷酸的拷貝數的增加:向宿主細胞基因組中插入至少一個額外拷貝的序列；或者納入伴隨該多核苷酸的可擴增選擇標記基因，由此通過在合適的選擇劑的存在下培養細胞，可以選擇出含有擴增拷貝數的選擇標記基因，從而也就含有更多拷貝的所述多核苷酸的細胞。[0318]用于連接上述元件來構建重組表達載體的程序是本領域技術人員公知的(參見例如Sambrook等,1989,同上文)。[0319]宿主細胞[0320]包含編碼具有纖維素分解增強活性的多肽或具有纖維素分解酶活性的多肽的多核苷酸的重組宿主細胞可以有利地用于多肽的重組生產。將包含這樣的多核苷酸的載體導入宿主細胞使得載體作為染色體整合子或者如前文所述的自復制的染色體外載體被保持。術語“宿主細胞”涵蓋親本細胞的任何因復制過程中的突變而與親本細胞不同的后代。宿主細胞的選擇在很大程度上將取決于編碼多肽的基因及其來源。[0321]宿主細胞可以是單細胞微生物，例如原核生物，或者非單細胞微生物，例如真核生物。[0322]細菌宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏球菌屬或尿枝原體屬。[0323]細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。本發明的實踐中可以使用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。[0324]在一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在一個更優選的方面，所述細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，所述細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，所述細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，所述細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。[0325]細菌宿主細胞也可以是任何鏈球菌屬細胞。本發明的實踐中可以使用的鏈球菌屬細胞包括但不限于似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌、和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。[0326]在一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。[0327]細菌宿主細胞也可以是任何鏈霉菌屬細胞。本發明的實踐中可以使用的鏈霉菌屬細胞包括但不限于不產色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細胞。[0328]在一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是不產色鏈霉菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是除蟲鏈霉菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是天藍色鏈霉菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是灰色鏈霉菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是淺青紫鏈霉菌細胞。[0329]向芽孢桿菌屬細胞中導入DNA可以通過例如原生質體轉化(參見例如Chang和Cohen,1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)、使用感受態細胞(參見例如Young和Spizizen,1961,JournalofBacteriology81:823-829,或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209-221)、通過電穿孔(參見例如Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)，或通過接合(參見例如Koehler和Thorne,1987，JournalofBacteriology169:5271-5278)來實現。向大腸桿菌細胞中導入DNA可以通過例如原生質體轉化(參見例如Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見例如Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127-6145)來實現。向鏈霉菌屬細胞中導入DNA可以通過例如原生質體轉化和電穿孔來實現(參見例如Gong等，2004，FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)、接合(參見例如Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)、或轉導(參見例如Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:6289-6294)來實現。向假單胞菌屬細胞中導入DNA可以通過例如電穿孔(參見例如Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)、或接合(參見例如Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)來實現。向鏈球菌屬細胞中導入DNA可以通過例如天然感受態(參見例如Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Tm`mun.32:1295-1297)、原生質體轉化(參見例如Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-2070)>電穿孔(參見例如Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)>或接合(參見例如Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)來實現。盡管如此，本領域已知的任何用于將DNA導入宿主細胞的方法都可以使用。[0330]宿主細胞也可以是真核生物，諸如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細胞。[0331]在一個優選的方面，所述宿主細胞是真菌細胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等在AinsworthandBisbyjsDictionaryofTheFungi,第八版,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中定義的)，和卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，同上文，第171頁引用的)等門，以及全部有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995,同上文)。[0332]在一個更優選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。本文所用的“酵母”包括產子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內抱霉目(Endomycetales))、產擔子抱子囊酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在將來可能有所改變，為了本發明的目的，酵母將如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.和Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesN0.9,1980)中所述加以定義。[0333]在一個進一步更優選的方面，酵母宿主細胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細胞。[0334]在一個最優選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是乳克魯維酵母(KluyveromycesIactis)細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)細胞。[0335]在另一個更優選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。“絲狀真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等，1995，同上文定義)。絲狀真菌的一般特征在于由幾丁質、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲壁。營養生長是通過菌絲延伸，且碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母如釀酒酵母的營養生長是通過單細胞菌體的芽殖，且碳分解代謝可以是發酵的。[0336]在一個進一步更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、網孢菌屬、鐮孢屬、腐質霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)、或木霉屬細胞。[0337]在一個更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另一個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬臘菌(Ceriporiopsisaneirina)、干擬臘菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角質金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質霉、疏棉狀腐質霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產紫青霉、黃孢平革菌、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、剌序側耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢殼、長域毛栓菌(Trametesvillosa)、雜色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。[0338]真菌細胞可以用包括方式本身已知的原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁再生的方法來加以轉化。用于曲霉屬和木霉屬宿主細胞轉化的合適方法描述于EP238023和Yelton等，1984,ProceedingsoftheNational.AcademyofSciencesUSA81:1470-1474。Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述了轉化鐮孢屬的種的合適方法。酵母可用Becker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon,M.1.編的GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,第194卷，第182-187頁，AcademicPress,NewYork;Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；和Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920中所述的方法轉化。[0339]生產方法[0340]生產具有纖維素分解增強活性的多肽或具有纖維素分解酶活性的多肽的方法包括:(a)在有助于產生多肽的條件下培養細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產生所述多肽；和(b)回收多肽。[0341]或者，生產具有纖維素分解增強活性的多肽或具有纖維素分解酶活性的多肽的方法包括:(a)在有助于產生多肽的條件下培養重組宿主細胞；和(b)回收多肽。[0342]在產生方法中，用本領域中公知的方法在適于多肽產生的營養培養基中培養細胞。例如，可在實驗室或工業發酵罐中通過搖瓶培養、和小規模或大規模發酵(包括連續發酵、分批發酵、分批補料發酵或固態發酵)培養細胞，這在合適的培養基中和使多肽能被表達和/或分離的條件下進行。用本領域中已知的程序，在含有碳源和氮源和無機鹽的合適營養培養基中進行培養。合適的培養基可從商業供應商得到或根據公開的組成(例如，于美國典型培養物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到營養培養基中，則可直接從培養基中回收該多肽。如果該多肽不被分泌，則可從細胞裂解產物中回收它。[0343]具有纖維素分解增強活性或纖維素酶活性的多肽用本文記載的方法檢測。[0344]得到的發酵液可以直接`使用，或者可以使用本領域已知的方法回收所述多肽。例如，可以通過常規方法，包括，但不限于，離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發或沉淀將多肽從營養培養基中回收出來。[0345]多肽可通過本領域中已知的多種方法進行純化，所述方法包括，但不限于，層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(見,例如，ProteinPurificationJ.-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989),來獲得基本上純的多妝。[0346]含纖維素材料的加工方法[0347]本發明的組合物和方法可以用來將含纖維素材料例如木素纖維素水解(糖化)成可發酵糖，并將可發酵糖轉化為許多有用的物質，例如化學品和燃料。從含纖維素材料生產期望的發酵產品通常涉及預處理、酶促水解(糖化)和發酵。[0348]本發明的含纖維素材料的加工可以使用本領域已知的方法來完成。此外，本發明的方法可以使用任何為了依照本發明運行而配置的生物質加工裝置來實現。[0349]單獨或同時進行的水解(糖化)和發酵包括，但不限于:單獨水解和發酵(SHF)、同時糖化和發酵(SSF)、同時糖化和共發酵(SSCF)、混合水解和發酵(hybridhydrolysisandfermentation,HHF)、SHCF(單獨水解和共發酵)、HHCF(混合水解和發酵)、及直接微生物轉化(DMC)。本文中應當理解，本領域中任何包括預處理、酶促水解(糖化)、發酵或它們的組合的方法都可用于實施本發明的方法。[0350]常規裝置可以包括補料分批攪拌反應器、分批攪拌反應器、帶超濾的連續流動攪拌反應器、和/或連續活塞流動柱反應器(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin和IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33—38;Gusakov,A.V.和Sinitsyn,A.P.，1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、碾磨反應器(Ryu,S.K.和Lee,J.M.,1983,Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)>或具有電磁場誘發的強烈攪拌的反應器(Gusakov,A.V.，Sinitsyn,A.P.，Davydkin,1.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反應器類型包括，例如，用于水解和/或發酵的流化床型、厭氧污泥床(upflowblanket)型、固定化型、以及擠出機型反應器。[0351]預處理.在本發明的方法的實施中，本領域已知的任何預處理方法都可以用來破壞含纖維素材料的植物細胞壁組分。在預處理之前還可以使用本領域已知的方法對含纖維素材料進行預浸泡、潤濕、或調制(conditioning)。常規的預處理包括但不限于蒸汽預處理(有或沒有爆破)、稀酸預處理、熱水預處理、石灰預處理、濕氧化、濕爆破、氨纖維爆破(ammoniafiberexplosion)、有機溶劑預處理(organosolvpretreatment)、和生物預處理。其它預處理包括超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界H20、和氨滲濾(ammoniapercolation)。[0352]可以在水解和/或發酵之前預處理含纖維素材料。預處理優選在水解之前進行。或者，預處理可以和水解同時進行，諸如在用一種或多種纖維素分解酶或其它酶活性處理含纖維素材料以釋放可發酵糖如葡萄糖和/或麥芽糖的同時進行預處理。在大多數情況下預處理步驟本身會導致一些生物質轉化成可發酵糖(即使沒有酶存在)。[0353]蒸汽預處理.在蒸汽預處理中，將含纖維素材料加熱以破壞植物細胞壁組分，包括木質素、半纖維素、和纖維素，以使得纖維素和其它部分如半纖維素(hemicellulase)暴露于酶。使纖維素材料通至或通過反應容器，在那里噴射蒸汽以升溫到需要的溫度和壓力，并在其中保持需要的反應時間。蒸汽預處理優選在140-230°C、更優選160-200°C、最優選170-190°C進行，其中最優的溫度范圍取決于化學催化劑的添加。蒸汽預處理的停留時間優選1-15分鐘、更優選3-12分鐘、最優選4-10分鐘，其中最優的停留時間取決于溫度范圍和化學催化劑的添加。蒸汽預處理容許相對較高的固形物載量，使得含纖維素材料在預處理過程中一般僅是輕微潮濕的。蒸汽預處理通常與預處理后對材料的爆破性出料(explosivedischarge)相結合,后者被稱為蒸汽爆破(steamexplosion),即將材料急速瞬時置于大氣壓和湍流下，以通過碎裂作用增加暴露的表面積(Duff和Murray,1996，BioresourceTechnology855:1-33;Galbe和Zacchi,2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美國專利申請20020164730)。[0354]在蒸汽預處理之前往往添加催化劑如H2SO4或SO2(典型地為0.3_3%w/w)，催化劑可減少時間和溫度，增加收率，以及改善酶促水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.BiotechnoI.I29-132:496-508;Varga等，2004，AppI.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523；Sassner等，2006,EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)。[0355]化學預處理:術語“化學預處理”是指任何可促進纖維素、半纖維素和/或木質素的分離和/或釋放的化學預處理。合適的化學預處理過程的例子包括稀酸預處理、石灰預處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆破(AFEX)、氨滲濾(APR)、和有機溶劑預處理。[0356]在稀酸預處理中，將含纖維素材料與稀酸，通常是H2SO4,以及水混合形成漿液，蒸汽加熱到希望的溫度，然后經過一段停留時間瞬時變化到大氣壓。稀酸預處理可以用多種反應器設計來實施，例如活塞流動反應器、逆流反應器、或連續逆流收縮床反應器(Duff和Murray,1996,同上文；Schell等,2004,BioresourceTechnol.91:179-188;Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。[0357]還可以采用數種堿性條件下的預處理方法。這些堿性預處理包括，但不限于石灰預處理、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆破(AFEX)。[0358]石灰預處理用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨在85_150°C的低溫下進行，停留時間為I小時至數日(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.96:1959-1966；Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673-686)。WO2006/110891、TO2006/11899、WO2006/11900和WO2006/110901公開了使用氨的預處理方法。[0359]濕氧化是一種熱預處理，典型地在180_200°C進行5_15分鐘，同時添加氧化劑如過氧化氫或氧過壓(Schmidt和Thomsen,1998,BioresourceTechnol.64:139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預處理優選在1-40%干物質、更優選2-30%干物質、最優選5-20%干物質的條件下進行，并且經常通過添加堿，如碳酸鈉來提高初始pH。`[0360]濕氧化預處理方法的一種變化形式，稱為濕爆破(濕氧化和蒸汽爆破的結合)，可以處理高達30%的干物質。在濕爆破中，在預處理過程中經過一定的停留時間后引入氧化齊U。然后瞬間變化到大氣壓而終止預處理(W02006/032282)。[0361]氨纖維爆破(AFEX)涉及用液態或氣態的氨在中等溫度如90_100°C和高壓如17-20巴的條件下處理含纖維素材料5-10分鐘，其中干物質含量可高達60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等，2005,BioresourceTechnol.96:2014-2018)。[0362]有機溶劑預處理通過使用乙醇水溶液(40-60%乙醇)在160-200°C萃取30_60分鐘來使含纖維素材料脫木質素(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851-861;Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。通常添加硫酸作為催化劑。在有機溶劑預處理中，大部分的半纖維素被去除。[0363]Schell等，2003，Appl.Biochem.andBiotechnol.第105-108卷，第69-85頁和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686以及美國專利申請公布2002/0164730描述了其他合適的預處理方法的例子。[0364]在一個方面，化學預處理作為酸處理，更優選作為連續稀酸和/或弱酸(mildacid)處理來實施。所述酸通常是硫酸，但也可以用其它的酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或它們的混合物。弱酸處理在優選1-5，更優選1-4，最優選1-3的pH范圍內進行。在一個方面，酸濃度在優選0.01-20wt%酸，更優選0.05-10wt%酸，進一步更優選0.l-5wt%酸，最優選0.2-2.0wt%酸的范圍。將所述酸與含纖維素材料接觸，并在一定溫度如160-200°C，優選165-195°C的范圍內保持自若干秒到若干分鐘不等的時間，例如I秒至60分鐘。[0365]在另一個方面，預處理作為氨纖維爆破步驟(AFEX預處理步驟)來實施。[0366]在另一個方面，預處理在水漿液中進行。在優選的方面，含纖維素材料在預處理過程中以優選10-80wt%之間，更優選20-70wt%之間，最優選30-60wt%之間，諸如50wt%左右的量存在。經過預處理的含纖維素材料可以不予洗滌，或者可以用任何本領域已知的方法洗滌，例如用水洗滌。[0367]機械預處理:術語“機械預處理”是指各類研磨(grinding)或粉碎(milling)(例如干粉碎，濕粉碎或振動球粉碎(vibratoryballmilling))。[0368]物理預處理:術語“物理預處理”是指任何可促進纖維素、半纖維素和/或木質素從含纖維素材料分離和/或釋放的預處理。例如，物理預處理可涉及輻射(例如微波輻射)、蒸汽處理/蒸汽爆破、濕熱分解作用，和它們的組合。[0369]物理預處理可涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆破)。在一個方面，高壓是指在優選約300-約600psi，更優選約350-約550psi，最優選約400-約500psi的范圍，如450psi左右。在另一個方面，高溫意指約100-約300°C，優選約140-約235°C范圍的溫度。在一個優選的方面，機械預處理在使用如上定義的高壓及高溫的分批過程式蒸汽噴射水解裝置系統(batch-process,steamgunhydrolyzersystem)中，如可獲自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中進行。[0370]物理和化學聯合預處理:可以既以物理方式又以化學方式處理含纖維素材料。例如，預處理步驟可涉及稀酸或弱酸處理以及高溫和/或高壓處理。根據需要，物理預處理和化學預處理可以順序地或同時地進行。還可以包含機械預處理。[0371]于是，在一個優選的方面，對含纖維素材料進行機械、化學、或物理預處理，或它們的任何組合，來促進纖維素、半纖維素和/或木質素的分離和/或釋放。[0372]生物預處理:術語“生物預處理”是指任何可促進纖維素、半纖維素和/或木質素從含纖維素材料分離和/或釋放的生物預處理。生物預處理技術可涉及施用溶木質素微生物(參見例如Hsu,T.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,《HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization》，Wyman,C.E.編,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMiIlan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,《EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction》，Himmel,M.E.，Baker,J.0.和Overend,R.P.編,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,((AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology)),Scheper,T.編,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；01sson和Hahn-HagerdaI,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331,及Vallander和Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。[0373]糖化.在水解步驟，又稱糖化中，經過預處理的含纖維素材料被水解以將纖維素或者半纖維素降解成可發酵糖，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解以酶促方式進行，使用本發明的包含有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽和水溶性活化性二價金屬陽離子的纖維素分解酶組合物。該組合物的酶組分也可以順序地添加。[0374]酶促水解優選在合適的含水環境中于本領域技術人員可容易確定的條件下進行。在一個優選的方面，水解在適合于一種或多種酶的活性的條件，即對一種或多種酶而言最適的條件下進行。水解可以作為補料分批或者連續過程進行，例如經預處理的含纖維素材料(底物)被逐漸添加到例如含酶的水解溶液中。[0375]糖化通常在攪拌槽式反應器或發酵罐中在受控的pH、溫度和混合條件下進行。合適的過程時間、溫度和pH條件可以由本領域技術人員容易地確定。例如,糖化可持續最多達200個小時，但通常進行優選約12個到約96個小時，更優選約16個到約72個小時，最優選約24個到約48個小時。溫度范圍為優選約25°C-約70°C，更優選約30°C-約65°C，更優選約40°C-60°C，尤其是約50°GpH范圍為優選約3-約8，更優選約3.5-約7，最優選約4-約6，尤其是大約pH5。干固形物含量范圍為優選約5-約50wt%，更優選約10-約40wt%，最優選約20-約30wt%。[0376]具有纖維素分解增強活性的酶和多肽的最適量取決于數種因素，包括但不限于作為成分的纖維素分解蛋白的混合物，含纖維素底物，含纖維素底物的濃度，含纖維素底物的一種或多種預處理，溫度，時間，pH,以及發酵生物的選用(例如用于同時糖化和發酵的酵母)。[0377]在一個優選的方面，一種或多種纖維素分解蛋白對含纖維素材料的有效量為大約0.5-約50mg,優選約0.5-約40mg,更優選約0.5-約25mg,更優選約0.75-約20mg,更優選約0.75-約15mg,進一步更優選約0.5-約IOmg,最優選約2.5-約IOmg每克含纖維素材料。[0378]在另一個優選的方面，具有纖維素分解增強活性的多肽對含纖維素材料的有效量為約0.5-約50mg,優選約0.5-約40mg,更優選約0.5-約25mg,更優選約0.75-約20mg,更優選約0.75-約15mg,進一步更優選約0.5-約IOmg,最優選約2.5-約IOmg每克含纖維素材料。[0379]在另一個優選的方面，具有纖維素分解增強活性的一種或多種多肽對含纖維素材料的有效量為約0.01-約50.0mg,優選約0.01-約40mg，更優選約0.01-約30mg，更優選約0.01-約20mg,更優選約0.01-約IOmg,更優選約0.01-約5mg,更優選約0.025-約1.5mg,更優選約0.05-約1.25mg,更優選約0.075-約1.25mg,更優選約0.1-約1.25mg,進一步更優選約0.15-約1.25mg,最優選約0.25-約1.0mg每克含纖維素材料。[0380]在另一個優選的方面，一種或多種具有纖維素分解增強活性的多肽對纖維素分解蛋白的有效量為約0.005-約1.0g,優選約0.01-約1.0g,更優選約0.15-約0.75g，更優選約0.15-約0.5g，更優選約0.1-約0.5g，進一步更優選約0.1-約0.5g，最優選約0.05-約0.2g每克一種或多種纖維素分解蛋白。[0381]對于從經過預處理和水解的含纖維素材料獲得的可發酵糖，可以用一種或多種能夠直接或間接將糖發酵為期望的發酵產物的發酵微生物來加以發酵。“發酵”或“發酵過程”是指任何發酵過程或任何包含發酵步驟的過程。發酵過程還包括生物燃料工業、食用酒精工業(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工業(例如發酵乳產品)、皮革工業及煙草工業上使用的發酵過程。發酵條件取決于期望的發酵產物及發酵生物，可以由本領域技術人員容易地予以確定。[0382]在發酵步驟中，作為預處理和酶促水解步驟的結果從含纖維素材料釋放的糖被發酵生物如酵母發酵成產物，例如乙醇。水解(糖化)和發酵可以分別或同時進行。這樣的方法包括，但不限于，分別水解和發酵(SHF)、同時糖化和發酵(SSF)、同時糖化和共發酵(SSCF)、混合水解和發酵(HHF)、SHCF(分別水解和共發酵)、HHCF(混合水解和發酵)、以及直接微生物轉化(DMC)。[0383]任何合適的經水解的含纖維素材料都可以用于本發明實施中的發酵步驟。如本領域中公知的，所述材料的選擇通常基于期望的發酵產物，即要通過發酵獲得的物質，以及所采用的過程。[0384]術語“發酵培養基”在本文中理解為指添加一種或多種發酵微生物之前的培養基，例如由糖化過程得到的培養基，以及例如在同時糖化和發酵過程(SSF)中使用的培養基。[0385]“發酵微生物”是指適合在期望的發酵過程中使用來產生發酵產物的任何微生物，包括細菌和真菌生物。發酵微生物可以是(:6和/或C5發酵生物，或它們的組合。(:6和(:5發酵生物都是本領域中公知的。合適`的發酵微生物能夠將糖類，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖，直接或間接發酵，即轉化成期望的發酵產物。[0386]Lin等,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642記載了產生乙醇的細菌及真菌發酵微生物的例子。[0387]能夠發酵C6糖的發酵微生物的例子包括細菌和真菌生物，如酵母。優選的酵母包括酵母屬一些種，優選釀酒酵母的菌株。[0388]能夠發酵C5糖的發酵微生物的例子包括細菌和真菌生物，如酵母。優選的發酵C5的酵母包括:畢赤酵母屬的菌株，優選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis),如樹干畢赤酵母CBS5773;假絲酵母屬的菌株,優選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、蕓苔假絲酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產I元假絲酵母(Candidautilis)。[0389]其它發酵生物包括發酵單孢菌屬(Zymomonas)如運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株；漢遜酵母屬(Hansenula)如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克魯維酵母屬如脆壁克魯維酵母(K.fragilis)的菌株；裂殖酵母屬如粟酒裂殖酵母的菌株；以及大腸桿菌，尤其是已經過遺傳修飾而改善了乙醇產率的大腸桿菌菌株。[0390]在一個優選的方面，所述酵母是酵母屬的一些種(Saccharomycesspp)。在一個更優選的方面，所述酵母是釀酒酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是糖化酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個優選的方面，所述酵母是克魯維酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)。在另一個更優選的方面,所述酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個優選的方面，所述酵母是假絲酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是蕓苔假絲酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是產朊假絲酵母。在另一個優選的方面，所述酵母是棍孢屬(Clavispora)。在另一個更優選的方面，所述酵母是葡萄牙棍孢(ClavisporaIusitaniae)。在另一個更優選的方面,所述酵母是仙人掌棍孢(Clavisporaopuntiae)。在另一個優選的方面，所述酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個更優選的方面，所述酵母是嗜鞋管囊酵母(Pachysolentannophilus)。在另一個優選的方面，所述酵母是畢赤酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是樹干畢赤酵母。在另一個優選的方面，所述酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在另一個更優選的方面,所述酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,在Wyman,C.Ε.編的〈〈HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization))中,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。[0391]能夠高效地將己糖和戊糖發酵成乙醇的細菌包括，運動發酵單胞菌和熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis,1996,同上文)。[0392]在一個優選的方面，所述細菌是發酵單胞菌。在一個更優選的方面，所述細菌是運動發酵單胞菌。在另一個優選的方面，所述細菌是梭菌。在另一個更優選的方面，所述細菌是熱纖維梭菌。[0393]適用于乙醇生產的商品化酵母包括，例如，ETHANOLRED酵母(可獲自Fermentis/Lesaffre,USA)、FALI?(可獲自Fleischmann，sYeast,USA)，SUPERSTART?和THERMOSACC?鮮酵母(可獲自EthanolTechnology,WI,USA)、BIOFERMtmAFT和XR(可獲自NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA)>GERTSTRAND?(可獲自GertStrandAB,Sweden)，以及FERM10L?(可獲自DSMSpecialties)。[0394]在一個優選的方面，所述發酵微生物經過了遺傳修飾來提供發酵戊糖的能力，例如利用木糖的、利用阿拉伯糖的、以及共利用木糖和阿拉伯糖的微生物。[0395]通過克隆異源基因到各種發酵微生物中，已經構建出了能夠將己糖和戊糖轉化為乙醇(共發酵)的生物(Chen和Ho,1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等,1998,GeneticalIyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingSaccharomycescerevisiaeandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；KotterandCiriacy,1993,XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；ffalfridsson等,1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALIgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等,2004,MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4:655-664;Beall等,1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等,1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204-214；Zhang等,1995,MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267:240-243;Deanda等，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470)。[0396]在一個優選的方面，所述經過了遺傳修飾的發酵微生物是釀酒酵母。在另一個優選的方面，所述經過了遺傳修飾的發酵微生物是運動發酵單胞菌。在另一個優選的方面，所述經過了遺傳修飾的發酵微生物是大腸桿菌。在另一個優選的方面，所述經過了遺傳修飾的發酵微生物是產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。[0397]通常將一種或多種發酵微生物添加到經降解的纖維素或水解產物中，進行約8小時至約96小時，例如約24-約60小時的發酵。溫度通常為約26°C-約60°C，尤其是約32°C或50°C,pH為約3-8，如大約pH4-5，6，或7左右。[0398]在一個優選的方面，將一種或多種發酵微生物施加到經降解的纖維素或水解產物，并進行大約12小時至大約96小時，如通常24-60小時的發酵。在一個優選的方面，溫度優選為大約20°C至大約60°C，更優選大約25°C至大約50°C，最優選大約32°C至大約50°C，特別是大約32°C或50°C，pH—般為大約pH3至大約pH7，優選pH4_7左右。然而，某些發酵微生物如細菌發酵生物，具有更高的最適發酵溫度。一種或多種發酵微生物施加的量優選為每ml發酵液大約IO5至1012，優選大約IO7至101(1，特別是大約2xl08個活細胞計數。關于使用酵母進行發酵的更多指導可見例如“TheAlcoholTextbook”(K.Jacques,Τ.P.Lyons和D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999),本文援引并入該文獻。``[0399]為了生產乙醇，在發酵之后將經發酵的漿液蒸餾以提取乙醇。依照本發明的方法獲得的乙醇可以用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇即可飲用酒精(potableneutralspirits);或工業乙醇。[0400]發酵刺激物(fermentationstimulator)可與本文描述的任何酶促過程組合使用以進一步改進發酵方法，特別是發酵微生物的性能，諸如速率提高和乙醇產量。“發酵刺激物”指用于發酵微生物特別是酵母的生長的刺激物。優選的用于生長的發酵刺激物包括維生素和礦物質。維生素的實例包括多種維生素(multivitamins)、生物素、泛酸、煙酸、內消旋肌醇(meso-1nositol)、硫胺素、吡哆醇、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素、及維生素A、B、C、DPE。參見例如Alfenore等,ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag,2002,本文援引并入該文獻。礦物質的實例包括能夠提供營養的礦物質和礦物質鹽，包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。[0401]發酵產物:發酵產物可以是任何來源于發酵的物質。所述發酵產物包括，但不限于，醇類(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有機酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富馬酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮類(例如丙酮)；醛類(例如甲醛)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如甲烷、氫(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。發酵產物還可以是作為高價值產物的蛋白質。[0402]在一個優選的方面，所述發酵產物是醇。應理解的是術語“醇”涵蓋含有一個或多個羥基部分的物質。在一個更優選的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一個更優選的方面，所述醇是丁醇。在另一個更優選的方面，所述醇是乙醇。在另一個更優選的方面，所述醇是甘油。在另一個更優選的方面，所述醇是甲醇。在另一個更優選的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一個更優選的方面，所述醇是山梨糖醇。在另一個更優選的方面，所述醇是木糖醇。參見例如Gong,C.S.、CaojN.J.、DujJ.和TsaojG.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，在《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》中，Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany，65:207-241；SilveirajM.M.,和Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam,P.，和Singh,D.，1995，Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute，ProcessBiochemistry30(2):117-124;Ezeji，T.C.、Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping，WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595-603o[0403]在另一個優選的方面，所述發酵產物是有機酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是乙酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是醋酮酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是己二酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是抗壞血酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是檸檬酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是甲酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是富馬酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是葡糖二酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是葡糖酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是戊二酸。在另一個優選的方面，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是衣康酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是乳酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是蘋果酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是丙二酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是草酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是丙酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是琥珀酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是木糖酸。參見例如Chen,R.,和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63—65:435_4480[0404]在另一個優選的方面，所述發酵產物是酮。可以理解的是術語“酮”涵蓋含有一個或多個酮部分的物質。在另一個更優選的方面，所述酮是丙酮。參見例如Qureshi和Blaschek,2003,同上文。[0405]在另一個優選的方面，所述發酵產物是醛。在另一個更優選的方面，所述醛是甲醛。[0406]在另一個優選的方面，所述發酵產物是氨基酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是天冬氨酸。在另一個更優選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個更優選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個更優選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個更優選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個更優選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見例如Richard,A.，和Margaritis,A.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o[0407]在另一個優選的方面，所述發酵產物是氣體。在另一個更優選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個更優選的方面，所述氣體是H2。在另一個更優選的方面，所述氣體是C02。在另一個更優選的方面，所述氣體是CO。參見例如Kataoka,N.、A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41-47;及GunaseelanV.N.,BiomassandBioenergyVol.13(1-2),第83-114頁，1997，Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。[0408]任選地可以使用任何本領域已知的方法從發酵培養基回收一種或多種發酵產物，這些方法包括但不限于:層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦、和大小排阻)、電泳程序(例如制備性等電聚焦)、差異溶解度(例如硫酸銨沉淀)、蒸餾、或萃取。例如，從經過發酵的含纖維素材料通過常規蒸餾方法分離乙醇并純化。可以獲得純度最高達約96vol%的乙醇，它可以用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇即可飲用酒精(Po)，或工業乙醇。[0409]下面用實施例進一步描述本發明，這些實施例不應解釋為對本發明范圍的限制。實施例[0410]材料[0411]用作緩沖劑和底物的化學品是至少試劑級的商品。[0412]DNA測序[0413]DNA測序使用染料終止物化學(dyeterminatorchemistry)(Giesecke等，1992，JournalofVirol.Methods38:47-60)用AppliedBiosystemsModel3130XGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)進行。序列使用phred/phrap/consed(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)用序列特異性引物進行裝配。[0414]培養基[0415]NNCYP培養基的組成為每升5.0gNH4N03>0.5gMgSO4.7Η20、0.3gCaCl2、2.5g檸檬酸、1.0g細菌用蛋白胨(BactoP印tone)、5.0g酵母提取物、COVE痕量金屬溶液以及足量的K2HPO4使最終pH達到約5.4。[0416]COVE痕量金屬溶液的組成為每升0.04gNa2B4O7.10H20、0.4gCuS04.5Η20、1.2gFeSO4.7Η20、0.7gMnSO4.H2O,0.8gNa2MoO2.2H20和IOgZnSO4.7H20。[0417]YP培養基的組成為每升IOg酵母提取物和20g細菌用胰蛋白胨。[0418]纖維素酶誘導培養基的組成為每升20g纖維素、IOg玉米浸漿固形物、1.45g(NH4)2SO4'2.08gΚΗ2Ρ04、0.28gCaCl2,0.42gMgSO4.7H20和0.42ml痕量金屬溶液。[0419]痕量金屬溶液的組成為每升216gFeCl3.6H20、58gZnSO4.7H20、27gMnS04.H2O,IOgCuSO4.5Η20、2.4gH3BO3和336g檸檬酸。[0420]STC的組成為IM山梨醇、IOmMCaCl2和IOmMTris-HCl,pH7.5。[0421]COVE平板的組成為每升342g蔗糖、IOmlCOVE鹽溶液、IOmlIM乙酰胺、IOml1.5MCsCl和25g諾布爾瓊脂(Nobleagar)。[0422]COVE鹽溶液的組成為每升26gKCl、26gMgS04、76gKH2PO4和50mlC0VE痕量金屬溶液。[0423]C0VE2平板的組成為每升30g蔗糖、20mlCOVE鹽溶液、25g諾布爾瓊脂和IOmlIM乙酰胺。[0424]PDA平板的組成為每升39克馬鈴薯葡萄糖瓊脂。[0425]LB培養基的組成為每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉。[0426]2XYT-Amp平板的組成為每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉和15g細菌用瓊脂，然后在高壓滅菌后加入2ml50mg/ml的氨芐青霉素的過濾除菌溶液。[0427]MDU2BP培養基的組成為每升45g麥芽糖、IgMgSO4.7H20、IgNaCl、2gK2HS04、12gKH2PO4,2g尿素和500μIAMG痕量金屬溶液，將pH調至5.0并隨后用0.22μm過濾元件進行過濾除菌。[0428]AMG痕量金屬溶液的組成為每升14.3gZnSO4.7Η20、2.5gCuS04.5Η20、0.5gNiCl2.6Η20、13.8gFeSO4.H20,8.5gMnSO4.7H20和3g檸檬酸。[0429]基本培養基(minimalmedium)平板的組成為每升6gNaN03、0.52KC1、1.52gKH2PO4UmlCOVE痕量金屬溶液、20g諾布爾瓊脂、20ml50%葡萄糖、2.5ml20%MgS04.7H20和20ml生物素貯存溶液。[0430]生物素貯存溶液的組成為每升0.2g生物素。[0431]SOC培養基的組成為2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmMNaCl,2.5mMKClUOmMMgClj-PIOmMMgSO4,高壓滅菌后加入過濾除菌的葡萄糖至20mM。[0432]實施例1:pMJ04表達載體的構建[0433]使用如下所示的引物993429(反義)和993428(有義)從里氏木霉RutC30基因組DNAPCR擴增了里氏木霉外切纖維二糖水解酶I基因(cbhl，CEL7A)終止子，構建了表達載體PMJ04。經過工程改造，所述反義引物在5’末端具有一個PacI位點，有義引物在3’末端具有一個SpeI位點。[0434]引物993429(反義):[0435]5，-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3，(SEQIDNO:29)[0436]引物993428(有義):[0437]5’-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3’(SEQIDNO:30)[0438]用DNEASYΦPlantMaxiKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)分離里氏木霉RutC30基因組DNA。[0439]擴增反應物(50μI)組成為IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反映緩沖液)(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)>0.3mMdNTP、IOOng里氏木霉RutC30基因組DNA、0.3μM弓丨物993429,0.3μM弓丨物993428和2單位的VentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)。將所述反應物在如下編程的EPPEND0RF⑩MASTERCYCLER?5333(EppendorfScientific,Inc.,ffestbury,NY,USA)中溫育:進行94°C30秒、50°C30秒、72°C60秒的循環5次，然后進行94°C30秒、65°C30秒、72°C120秒的循環25次(最終延伸5分鐘)。反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上用40mMTris堿_20mM乙酸鈉-1mMEDTA二鈉(TAE)緩沖液分離，從凝膠上切下229bp的產物條帶，使用QIAQUICK?GelExtractionKit(QIAQUICK⑩凝膠提取試劑盒)(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)依照制造商的說明進行純化。[0440]所得的PCR片段用PacI和SpeI消化后,用RapidLigationKit(快速連接試劑盒)(Roche,Indianapolis,IN,USA)連接到經相同的限制酶消化的pAlLol(W005/067531)中產生pMJ04(圖1)。[0441]實施例2:pCaHj568的構建[0442]從pCaHjl70(美國專利5，763，254)和pMT2188出發構建質粒pCaHj568。質粒pCaHjl70包含特異腐質霉內切葡聚糖酶V(CEL45A)全長編碼區(SEQIDN0:31，編碼SEQIDNO:32的氨基酸序列)。pMT2188的構建最先是用如下所示的引物142779和142780從pCaHj483(W098/00529)PCR擴增出pUC19復制起點。引物142780在PCR片段中引入BbuI位點。[0443]引物142779:[0444]5，-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3，(SEQIDNO:33)[0445]引物142780:[0446]5，-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3，(SEQIDNO:34)[0447]該擴增使用EXPANDφPCRSystem(RocheMolecularBiochemicals,Basel,Switzerland)依照制造商的說明進行。在瓊脂糖凝膠上分離PCR產物，使用JetquickGelExtractionSpinKit(離心式快速凝膠提取試劑盒)(Genomed,ffielandstr,Germany)分離并純化出一個1160bp的片段。[0448]使用如下所示的引物140288和142778，利用EXPAND?PCRSystem從通用釀酒酵母克隆載體pYES2(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中擴增出URA3基因。引物140288在PCR片段中引入一個EcoRI位點。[0449]引物140288:[0450]5’-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3’(SEQIDNO:35)[0451]引物142778:[0452]5’-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3’(SEQIDNO:36)[0453]在瓊脂糖凝膠上分離PCR產物,使用JetquickGelExtractionSpinKit(離心式快速凝膠提取試劑盒)分離并純化出一個U26bp的片段。[0454]通過混合所述兩個PCR片段并用如上所示的引物142780和140288依照重疊剪接(overlapsplicing)法(Horton等，1989,Gene77:61-68)進行擴增,將這兩個片段融合起來。在瓊脂糖凝膠上分離PCR產物,使用JetquickGelExtractionSpinKit(離心式快速凝膠提取試劑盒)分離并純化出一個2263bp的片段。[0455]所得的片段用EcoRI和BbuI消化，并使用標準規程連接到用相同的限制酶消化過的pCaHj483的最大片段中。將連接混合物轉化到依照Mandel和Higa,1970，J.Mol.Biol.45:154的方法制成感受態的pyrF陰性大腸桿菌菌株DB6507(ATCC35673)中。在每升添加了Ig酪蛋白氨基酸、500μg硫胺素和IOmg卡那霉素的M9培養基(Sambrook等，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress)上選擇轉化子。分離了來自于一個轉化子的質粒,命名為pCaHj527(圖2)。[0456]使用EXPAND?PCRSystem并依照制造商的說明，通過PCR對pCaHj527上存在的NA2-tpi啟動子進行定點誘變。利用如下所示的誘變引物141223，將核苷酸134-144從GTACTAAAACC(SEQIDNO:37)轉變為CCGTTAAATTT(SEQIDNO:38)。[0457]引物141223:[0458]5’-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3’(SEQIDNO:39)[0459]利用如下所示的誘變引物141222，將核苷酸423-436從ATGCAATTTAAACT(SEQIDNO:40)轉變為CGGCAAITTAACGG(SEQIDNO:41)。[0460]引物141222:[0461]5’-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3’(SEQIDNO:42)[0462]所得的質粒命名為pMT2188(圖3)。[0463]將特異腐質霉內切葡聚糖酶V編碼區從pCaHjl70作為BamH1-SalI片段轉移到用BamHI和XhoI消化過的pMT2188中，生成pCaHj568(圖7)。質粒pCaHj568包含與特異腐質霉內切葡聚糖酶V全長編碼序列可操作地連接的突變的NA2-tpi啟動子。[0464]實施例3:pMJ05的構建[0465]質粒pMJ05的構建是通過使用如下所示的引物HiEGV-F和HiEGV-R從pCaHj568PCR擴增出915bp的特異腐質霉內切葡聚糖酶V全長編碼區。[0466]引物HiEGV-F(有義):[0467]5，-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3’(SEQIDNO:43)[0468]引物HiEGV-R(反義):【權利要求】1.提高具有纖維素分解增強活性的GH61多肽的活性的方法，包括:向含有具有纖維素分解增強活性的GH61多肽的纖維素分解酶組合物中加入可溶性活化性二價金屬陽離子，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料的過程中以0.3mM-5mM的有效濃度存在，與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的GH61多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的GH61多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高；且其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。2.降解或轉化含纖維素材料的方法，包括:用有效量的纖維素分解酶組合物處理含纖維素材料，所述纖維素分解酶組合物包含有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子以0.3mM-5mM的有效濃度存在；且其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。3.權利要求2的方法，其還包括用有效量的β_葡糖苷酶處理含纖維素材料。4.權利要求2的方法，其還包括用有效量的一種或多種選自下組的酶處理含纖維素材料:半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或其混合物。5.權利要求2的方法，其還包括補充可溶性活化性二價金屬陽離子的濃度以維持可溶性活化性二價金屬陽離子的有效濃度為0.3mM-5mM。6.權利要求2的方法，其還包括回收經降解的含纖維素材料。7.產生發酵產物的方法，包括:(a)用有效量的包含有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的纖維素分解酶組合物糖化含纖維素材料，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子以0.3mM-5mM的有效濃度存在；(b)用一種或多種發酵微生物發酵步驟(a)中經糖化的含纖維素材料以產生發酵產物；和(c)從發酵回收發酵產物；且其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。8.權利要求7的方法，其還包括用有效量的β_葡糖苷酶處理含纖維素材料。9.權利要求7的方法，其還包括用有效量的一種或多種選自下組的酶處理含纖維素材料:半纖維素酶、酯·酶、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或其混合物。10.權利要求7的方法，其還包括補充可溶性活化性二價金屬陽離子的濃度以維持可溶性活化性二價金屬陽離子的有效濃度為0.3mM-5mM。11.包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽和可溶性活化性二價金屬陽離子的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子在降解或轉化含纖維素材料的過程中以0.3mM-5mM的有效濃度存在,與沒有可溶性活化性二價金屬陽離子的具有纖維素分解增強活性的GH61多肽相比，可溶性活化性二價金屬陽離子和具有纖維素分解增強活性的GH61多肽的存在使纖維素分解酶組合物對含纖維素材料的降解或轉化提高；且其中所述可溶性活化性二價金屬陽離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。【文檔編號】C12P7/08GK103436509SQ201310336645【公開日】2013年12月11日申請日期:2008年5月30日優先權日:2007年5月31日【發明者】基思.麥克法蘭,保羅.哈里斯申請人:諾維信股份有限公司