一種茄病鐮刀菌熒光定量pcr檢測技術及其應用的制作方法

一種茄病鐮刀菌熒光定量pcr檢測技術及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種茄病鐮刀菌的熒光定量PCR檢測技術及應用。專用于檢測瓜類、菜豆、豌豆、胡椒、山椒農作上的茄病鐮刀菌。該技術包括如下步驟：樣本中DNA提取，特異性引物設計，應用以SYBRGreenI為基礎的染料法熒光定量PCR檢測技術對茄病鐮刀菌的ITS區基因片段進行實時熒光定量PCR檢測，構建標準曲線，計算待測樣本中的ITS區基因片段拷貝數和茄病鐮刀菌的濃度。該檢測技術操作簡便、快速；特異性強、靈敏度高；檢測靈敏度最高可達到40個拷貝數每個反應，并且可以同時進行大批量的土壤、種子樣本分析，為病害的早期預測預報提供了良好的基礎，因此該方法適于在植物病害診斷檢測領域廣泛推廣應用。
【專利說明】-種茄病鐮刀菌熒光定量PCR檢測技術及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明為一種茄病鐮刀菌的熒光定量PCR檢測技術及應用，專用于檢測瓜類、菜 豆、豌豆、胡椒、山椒農作上的茄病鐮刀菌，屬于農作物病害診斷與防治【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 爺病鐮刀菌[/7W1Sariiffl? (Mart. ) Sacc.]是一類世界性分布重要 的植物病原真菌，在真菌分類系統中隸屬于無性型真菌（Anamorphic fungi)、絲孢綱 、瘤座抱目、瘤座抱科、鎌刀菌屬 (/7W1SarittT?)，馬特組（Section Martiella)。有性階段屬于肉座菌科（Hypocreaceae)、叢赤 殼屬(Afeciria)。茄病鐮刀菌分布非常廣泛，普遍存在于土壤，植物和動物體內等，對人類的 生產、生活造成了很大的危害。引起各種糧食作物、園藝作物、中草藥等的根腐、莖腐、莖基 腐，造成作物萎蔫死亡，侵染寄主植物維管束系統，破壞植物的輸導組織維管束，并在生長 發育代謝過程中產生毒素危害作物，其寄主范圍廣泛，僅蔬菜上的寄主就包括5類蔬菜，分 別由瓜類、菜豆、豌豆、胡椒、山椒，是生產上最難防治的重要病害之一(李鵬，2009 ;林清洪， 2007 ;周黎，2008 ;薛彩云，2007)。
[0003] 在病害癥狀明顯表現之前不容易預測和避免茄病鐮刀菌的侵染，而且土壤中的病 原菌也會隨著灌溉水從一個地方的土壤傳播到另一個地方，病害表現前是防治的最佳時 期，一旦發病癥狀顯現就難以治愈，嚴重威脅到產量，因此，發展有效且快速的茄病鐮刀菌 快速檢測技術，有效的避免該病的蔓延和傳播，對于茄病鐮刀菌引起的土傳病害的防治具 有十分重要的意義。
[0004] 實時突光定量 PCR 技術（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 簡稱（RT-PCR))是在常規定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。通常實時熒光定 量PCR技術所使用的熒光化學劑包括TaqMan熒光探針和SYBR熒光染料。該技術作為一種 快速，靈敏，特異性高并且可以定量檢測病原菌的檢測方法現已廣泛應用于植物真菌的檢 測。采用SYBR Green實時定量PCR方法對小麥種傳病害進行檢測取得了較好效果（McEwan et al.，2000)，應用實時定量PCR方法檢測不同感染比例小麥種子上的鐮刀菌的含量，表 明種子感染的程度與種子上鐮刀菌的含量的相關性（Glynn et al.，2010)。這為我們檢測 茄病鐮刀菌技術的研究提供了有力基礎。
[0005] RT-PCR是通過PCR在指數擴增期間連續檢測熒光信號的強弱來即時檢測特異性 產物的量，并據此評估目的基因的起始模板量。與常規PCR相比，具有操作簡便、高效快速、 敏感性強、可重復性好和特異性高的優點。SYBR Green I熒光定量PCR的工作原理是在常 規PCR的體系中加入熒光染料SYBR Green I，SYBR Green I是一種結合于雙鏈DNA小溝 中的熒光染料，與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強。在PCR反應體系中加入過量的SYBR Green I熒光染料，熒光染料能夠特異性地摻入到DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈 中的熒光染料分子不發射任何熒光信號。從而隨著PCR反應的進行，保證熒光信號的增強 與PCR產物增加完全同步，信號增強到某一閾值的循環次數(用循環閾值Ct表示)被記錄下 來，Ct值和PCR體系中起始模板的對數之間有嚴格的線性關系，利用陽性定量標準品擴增 的Ct值和標準曲線，再根據待測樣品的Ct值就可以準確計算出起始模板中某核酸的存在 及數量。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種爺病鐮刀菌的突光定量PCR快速檢測的方法。
[0007] 本發明的另一個目的在于提供一種熒光定量PCR檢測技術在瓜類、菜豆、豌豆、胡 椒、山椒茄病鐮刀菌引起的土傳病害流行監測預報，土壤帶菌以及種子帶菌檢測方面的應 用。
[0008] 該檢測技術，在植物病害診斷與防治領域可以大規模推廣。
[0009] 本發明的目的通過以下技術方案實現： 該方法的實驗步驟為：從待測樣本提取DNA ;將加入標準品及待測樣品的熒光定量反 應液上機，用熒光定量檢測儀進行PCR檢測；通過比較待測樣品和標準品的循環閾值，根據 標準曲線計算出待測樣品的起始DNA濃度。
[0010] 本發明的技術具體包括如下步驟： 1、 取田間自然發病土壤、發病植株、蔬菜種子，進行總DNA的提取純化，得到DNA樣本； 2、 特異性引物設計，為避免由于引物專化性較低，PCR反應中出現假陽性結果或 對非目標真菌產生非特異性擴增，本發明在系統分析茄病鐮刀菌的ITS區、18SrRNA和 5. 8SrRNA核酸序列系統發育的基礎上，對已經發表在GenBank上的不同國家和地區茄病 鐮刀菌rDNA-ITS基因的序列進行比較，利用Primer render 5.0軟件在茄病鐮刀菌基 因的 rDNA-ITS 區設計一對特異性引物 FSFl :5' -GCTAACAATCATCTACAGAC-3' ；FSR1 :5' -GACGGATGAGAGAGC-3'，擴增片段長度為 487 bp (圖 1)。
[0011] 腫 18S rRNA、ITS1、5. 8S rRNA 和 ITS2 部分序列 NCBI 登錄號為 (DQ986152. 1)。
[0012] 3、實時熒光定量PCR反應體系為：熒光定量PCR反應體系總體積為25μ1，其中 SYBR Premix Ex Taq(內含 TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I ) 12. 5μ1，濃度為lOMmol/L的正義引物FSFl和反義引物FSRl各0. 5μ1，標準品10倍梯度稀 釋液或待檢測樣品DNA溶液2μ1，CldH2O補齊至25μ1 ; 4、 PCR反應程序為：PCR采用兩步法，95°C預變性3min，接著進行35個循環，每個循環 包括95°C變性30s、60 °C退火30s、72 °C延伸1.5min;PCR完成后，按0. 1°C s-1升溫速 率從72°C升至95°C進行融解曲線的分析驗證； 5、 插入ITS區的pMD-18T載體轉化大腸桿菌DH5 α增殖后提取的質粒基因組DNA，DNA 經紫外分光光度計A260定量并10倍梯度稀釋，稀釋成6個濃度梯度，按照上述PCR反應體 系和程序進行擴增；反應結束后，根據各個濃度梯度的循環閾值（Ct)采用計算機自動繪制 熒光定量PCR標準曲線； 6、 取步驟1)中得到的DNA樣本作為模板，按上述熒光定量PCR反應體系和反應程序在 實時熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照的擴增，其中陰性對照 采用ddH 20,陽性對照采用質粒基因組DNA ;反應結束后，將DNA樣本的循環閾值（Ct)與標 準曲線對照，得到DNA樣本中的ITS區基因片段拷貝數，進而得到原來樣本中根腫病菌的濃 度。
[0013] 檢測茄病鐮刀菌的熒光定量PCR檢測技術可以轉化成商品化的試劑盒，包括標準 陽性DNA模板、熒光定量反應液。
[0014] 標準陽性DNA模板由含有插入目的片段的pGM-T (購自天根公司）載體制備而成。 標準品的制備過程為：采用引物ITSl和ITS4擴增根腫病菌的ITS區，PCR產物電泳后切下 含有目標片段的凝膠，目標片段用凝膠試劑盒回收純化后與PGM-T載體16°C過夜連接，轉 化大腸桿菌DH5a感受態細胞。轉化產物涂平板培養，挑去白斑，采用引物為FSF1/FSR1進 行PCR鑒定。陽性克隆通過序列分析進一步鑒定結果的可靠性。選擇PCR和序列分析均為 陽性的克隆，接種到含有氨芐青霉素的LB培養基過夜培養，采用質粒小提試劑盒(購自天 根公司)制備質粒DNA。DNA經紫外分光光度計A260定量，經10倍梯度稀釋為200ng-200fg/ UL，保存于-20°C。
[0015] 熒光定量反應液由正義引物FSFl、反義引物FSRl、熒光染料SYBR Premix Ex Taq 內含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I 組成。
[0016] 本發明提供的茄病鐮刀菌熒光定量PCR檢測技術，針對茄病鐮刀菌基因組ITS區 特異的靶序列設計引物，通過優化反應體系（引物濃度、擴增程序等）的優化，采用定量檢測 系統(包括ABI Prism系統、PE Applied Bioasystems、Bio_Rad)，可用于各種來源的爺病鐮 刀菌的定量檢測。引物對的檢測限點為13個細胞每個反應。
[0017] 本發明與現有技術相比具有以下優點和效果： 1)特異性好、鑒定快速 引物包括茄病鐮刀菌的特異性序列，檢測特異性高。環境中，特別是蔬菜根際微生物種 類繁多，不容易進行分離培養后檢測，本發明克服了這一不足之處，并且檢測快速。
[0018] 2)準確定量、靈敏度高 與普通PCR檢測相比，本發明可以準確定量，目標DNA在200ng-200fg/ μ L濃度范 圍內，都有良好的線性關系；同時檢測具有重復性好的特點。
[0019] 3)實用性好、應用范圍廣 可以定量檢測植物植株、土壤、種子以及水中的茄病鐮刀菌，結合蔬菜茄病鐮刀菌的田 間發病閾值，可以為病害的早期預測預報提供有力參考。
[0020]

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1是引物對FSF1/FSR1特異性檢測PCR擴增結果。1的模板為茄病鐮刀菌基因組DNA， 2-10的模板分別為馬鈴薯粉痂菌DNA、禾谷多粘霉菌DNA、尖孢鐮刀菌基因組DNA、串珠鐮 刀菌基因組DNA、辣椒疫霉菌基因組DNA、瓜果腐霉菌基因組DNA、立枯絲核菌基因組DNA、西 瓜殼二孢基因組DNA、核盤菌基因組DNA、西瓜炭疽菌基因組DNA，N為陰性對照，M為250bp DNA Ladder (Takara 公司）； 圖2實施例3熒光定量PCR擴增的標準曲線 縱軸為Ct，橫軸為Log CO ;標準誤為0. 9985 ; 圖3實施例3熒光定量PCR陽性標準品的擴增曲線 縱軸為 Delta Rn ;橫軸為 Cycle Number ; 曲線1，2, 3,4, 5和6的模板為陽性標準品，反應體系中DNA含量分別為I. 36ng，136pg， 13. 6pg，I. 36pg，136fg，13. 6fg ; 圖4實施例2熒光定量PCR檢測威百畝處理后定制黃瓜前土壤中茄病鐮刀菌動態變 化 縱軸為茄病鐮刀菌孢子數量；橫軸為處理時間； 圖5實施例2熒光定量PCR檢測威百畝處理后定制黃瓜后土壤中茄病鐮刀菌動態變 化 縱軸為茄病鐮刀菌孢子數量；橫軸為處理時間。

【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實例，進一步闡述發明。應當理解，下列實例僅用于說明本發明而不 用于限制本發明要求保護范圍。應用實例中DNA提取采用的是試劑盒，實際應用中也可以 采用改良CTAB等方法。
[0022] 實施例1 :爺病鐮刀菌的特異性引物檢測 茄病鐮刀菌及其他病原菌真菌和細菌菌菌株見表1。病原真菌菌株用PDA(每1000 ml 培養基馬鈴薯200 g，葡萄糖20g，瓊脂20 g)或Η)液體培養基(每1000 ml培養基馬鈴薯 200 g，葡萄糖20g)培養；土傳病原細菌菌株用NA培養基(每1000 ml培養基牛肉膏5g，蛋 白胨l〇g，氯化鈉5g，瓊脂20g)或NA液體培養基海1000 ml培養基牛肉膏5g，蛋白胨10g， 氯化鈉5g)培養。所有菌株先在固體培養基上活化，然后轉入液體培養基培養，1周后收集 菌絲或菌體提取DNA。DNA的提取采用改良的CTAB提取法（Sambr 〇〇k，1989)。
[0023] 對已經發表在GenBank上的不同國家和地區茄病鐮刀菌rDNA-ITS基因的序列 進行比較，利用Primer render 5.0軟件在茄病鐮刀菌基因的rDNA-ITS區設計一對特 異性引物 FSFl :5' -GCTAACAATCATCTACAGAC-3 ' ；FSR1 :5' -GACGGATGAGAGAGC-3'，擴增片 段長度為487bp，引物由上海生工科技有限公司合成。使用時引物用雙蒸滅菌水稀釋至 10 μ mol · L、
[0024] 以茄病鐮刀菌及其它病原菌真菌及細菌的基因組DNA為模板，利用引物FSFl/ FSRl進行普通PCR擴增，以檢測該引物的特異性。普通PCR反應體系如下：總反應體積 25 μ L，10 XPCR buffer2. 5 μ L，dNTP (10 μ mol/L) 0· 5 μ L，引物（10 μ mol/L)各 0· 5 μ L，模 板DNA3. 0 μ L，TapDNA聚合酶1 μ L，最后以ddH20補足至25 μ L。PCR反應程序為：94°C預 變性 3min ;94°C變性 30s，52°C退火 lmin，72°C延伸 I. 5min，共 40 個循環；72°C延伸 7 min。 PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測（圖1)。
[0025] 表1弓丨物特異性檢測菌株

【權利要求】
1. 一種茄病鐮刀菌的熒光定量PCR檢測技術，其特征在于包括以下步驟： 1) 取田間自然發病土壤、發病植株、茄果類蔬菜種子，進行總DNA的提取純化，得到DNA 樣本； 2) 特異性引物設計，對已經發表在GenBank上的不同國家和地區茄病鐮刀菌rDNA-ITS 基因的序列進行比較，利用Primer render 5.0軟件在茄病鐮刀菌基因的rDNA-ITS區設 計一對特異性引物，根據Genbank中公布的爺病鐮刀菌rDNA-ITS區序列設計特異性引物 對 EF1/EF2 : 引物對：正向引物 5' -GCTAACAATCATCTACAGAC-3' 反向引物 5 ' -GACGGATGAGAGAGC-3 ' 3) 實時熒光定量PCR反應體系為：熒光定量PCR反應體系總體積為25W，其中SYBR Premix Ex Taq(內含 TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I ) 12. 5W，濃度為10Mm〇l/L的正義引物EF1和反義引物EF2各0. 5W，標準品10倍梯度稀釋 液或待檢測樣品DNA溶液2W，ddH20補齊至25W ; 4. PCR反應程序為：PCR采用兩步法，95°C預變性3min，接著進行35個循環，每個循環 包括95°C變性30s、60 °C退火30s、72 °C延伸1.5min;PCR完成后，按0. 1°C s-1升溫速 率從72°C升至95°C進行融解曲線的分析驗證； 5) 插入ITS區的pMD-18T載體轉化大腸桿菌DH5 a增殖后提取的質粒基因組DNA，DNA 經紫外分光光度計A260定量并10倍梯度稀釋，稀釋成7個濃度梯度，按照上述PCR反應體 系和程序進行擴增；反應結束后，根據各個濃度梯度的循環閾值（Ct)采用計算機自動繪制 熒光定量PCR標準曲線； 6) 取步驟1)中得到的DNA樣本作為模板，按上述熒光定量PCR反應體系和反應程序 在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照的擴增，其中陰性對 照采用ddH20,陽性對照采用茄病鐮刀菌菌株基因組DNA ;反應結束后，將DNA樣本的循環閾 值（Ct)與標準曲線對照，得到DNA樣本中的ITS區基因片段拷貝數，進而得到原來樣本中 茄病鐮刀菌的濃度。
2. 權利要求書1所述的檢測茄病鐮刀菌的熒光定量PCR檢測技術可以轉化成商品化 的試劑盒，試劑盒包括：正義引物EF1、反義引物EF2、熒光染料SYBR Premix Ex Taq內含 TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I、以及由插入 ITS 區的pMD-18T 載體轉化大腸桿菌DH5 a增殖后提取的質粒DNA，DNA經紫外分光光度計A260定量并10倍 梯度稀釋。
3. 該技術可以應用于對農田環境中，包括對土壤中越冬菌量和發病植株瓜類、菜豆、豌 豆、胡椒、山椒5類蔬菜上茄病鐮刀菌進行實時監測，以及檢測瓜類、菜豆、豌豆、胡椒、山椒 等5類蔬菜種子帶菌和田間灌溉水中的茄病鐮刀菌。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372068SQ201310348495
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月12日 優先權日:2013年8月12日
【發明者】石延霞, 李寶聚, 趙一杰, 謝學文, 柴阿麗 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所