一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重rt-pcr檢測試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，試劑盒中包括用于擴增美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒和歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因的兩對引物，并提供了檢測試劑盒的使用方法。本發明的有益效果為：本發明提供的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，較經典的病毒分離、單RT-PCR和血清型分型方法快捷，可以方便地一次性鑒定并區分出屬于歐洲型和美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒中的任意一種，以便于對疫病情況及區域、環境做出及時快捷的反應，以最短的時間做出正確的處理辦法，同時，本發明采取的提取全基因組RNA提取的Trizol法具有快速、簡單、成本低和所需試劑少的特點，特別適于小樣品的提取，具有廣泛的市場應用前景。
【專利說明】—種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及畜類病毒檢測試劑盒，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus, PRRSV)引起的，以妊娠母豬發生早產、流產、死胎、弱仔和木乃伊胎，仔豬和育肥豬發生呼吸道疾病，生產性能降低，飼料報酬率降低，死亡率升高等臨。
盡管目前國內外對PRRSV的病原學、血清分型、診斷做了大量的研究，但由于其幾乎遍及世界各地，對全世界豬及相關產品的威脅眾所周知，它的發病率和造成的經濟每年至少為上百億美元。尤其其與它繁殖與呼吸綜合征在臨床上很難區分，同時在臨床癥狀和病理變化因感染動物的種類、年齡、病程長短及感染毒株毒力等不同而有所差別，可能缺乏特征病癥，這給豬繁殖與呼吸綜合征的診斷和防治帶來極大困難。因此，單靠臨床診斷難以定性。快速簡單的實驗室診斷方法是確診豬繁殖與呼吸綜合征唯一有效地途徑。
[0003]為了確定豬繁殖與呼吸綜合征是否在某一地區存在，檢測動物血清抗體的方法并非完全可靠，還必須通過通過病原學檢測以確診病原的存在，一般檢測方法為生物學實驗、血清型診斷技術和分子生物學技術等診斷技術，但是這些方法有的敏感性不高、有的特異性不強、有的檢出率較低，檢測周期太長，并且這些技術普遍費用太高。隨著2006年第一例歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征在我國檢出，建立一種快速診斷歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的多重RT-PCR試劑盒，完成對PRRS的快速診斷以及對其進行嚴格監控具有重要意義。·
【發明內容】
[0004]本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種能夠快速、簡便、靈敏和經濟的區分動物所感染的歐洲型或美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒。
[0005]為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為:一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒,所述試劑盒中包括有混合酶Enzyme Mix、2XBuffer 2、無菌雙蒸水和兩對引物，兩對引物分別為用于擴增美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因的引物對一和用于擴增歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的目的基因的引物對二；
所述引物對一包括
上游引物:5' -CACCACGTCGAAAGTGCCGC-3' (SEQ ID NO:1)和 下游引物:5' -GACGCCGGACGACAAATGCG-3' (SEQ ID NO:2)；
所述引物對二包括上游引物:5' -GGGGCTGTTGCACATCCTAA-3' (SEQ ID NO:3 )和 下游引物:5' -ACAAAAGGGCAACAACAGCC-3' (SEQ ID NO:4)；
所述混合酶Enzyme Mix為2μ1, 2 X Buffer為25μ1,無菌雙蒸水為50μ1 ；
所述2XBufTer由Tris-鹽酸、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸銨、吐溫_20和三磷酸脫氧核苷酸dNTPS組成。
[0006]進一步的，以提取的檢測樣品的RNA為模板，上述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，在50μ1反應體系中加入檢測樣品的RNA各3 μ?，EnzymeMix 2 μ?, 2XBuffer 25μ1，10Mmol/L的所述引物對一和引物對二的使用量分別為0.8μ1，然后加無菌的雙蒸水至50μ1，其中所述的2XB uffer是由Tris_HCl、KCl、MgS04、(NH4)2S04、Tween-20 和 dNTPS 組成的。
[0007]本發明的第二個目的是提供了一種根據上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒在檢測歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒中的應用。
[0008]進一步的，上述的應用，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒的使用方法為:從待檢動物的血液或病死動物的組織中提取其全基因組RNA，以RNA為模板，以試劑盒中的特異性歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒的引物進行多重RT-PCR，對得到的產物進行電泳，根據電泳圖譜分析被檢動物是否感染有歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒。
[0009]進一步的，上述的應用，所述待檢動物的血液或病死動物的組織的處理方式為用生理鹽水稀釋或研磨成1:5的乳懸液，全基因組RNA提取的方法采用Trizol法。
[0010]進一步的，上述的應用，所述RT-PCR反應程序為50°C 30min,94°C 2min，循環程序為 94°C 30s, 58°C lmin,72°C 50s，共 35 個循環，最后 72°C延伸 lOmin。
[0011]本發明的有益效果為:本發明提供的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，較經典的病毒分離、單RT-PCR和血清型分型方法快捷，可以方便地一次性鑒定并區分出屬于歐洲型和美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒中的任意一種，以便于對疫病情況及區域、環境做出及時快捷的反應，以最短的時間做出正確的處理辦法，這對及時撲滅或阻斷傳染病的傳播具有積極的意義，同時，本發明采取的提取全基因組RNA提取的Trizol法具有快速、簡單、成本低和所需試劑少的特點，特別適于小樣品的提取，本發明具有廣泛的市場應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為利用本發明提供的試劑盒檢測標準樣品的檢測結果電泳圖。
[0013]其中，從左至右依次為:M，DNA分子量標準DL-2000 (marker條帶的大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp);泳道I為歐洲型和美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測結果；泳道2為美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-PCR檢測結果；泳道3為歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-PCR檢測結果；泳道4為陰性對照。
[0014]圖2本發明提供的試劑盒的敏感性試驗結果電泳圖。
[0015]其中，從左至右依次為:M, DNA分子量標準DL-2000 (marker條帶的大小依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp)；泳道 1-5 分別為 4.0XlO5 拷貝的 RNA、4.0X IO4 拷貝的 RNA、4.0 X IO3 拷貝的 RNA、4.0 X IO2 拷貝的 RNA 和 4.0 X IO1 拷貝的 RNA。[0016]圖3為本發明提供的試劑盒的特異性試驗結果電泳圖。
[0017]其中，從左至右依次為:M，DNA分子量標準DL-2000 (marker條帶的大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp);泳道I為建立的歐洲型和美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測結果；泳道2為建立的歐洲型和美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測結果檢測豬圓環病毒-2型病毒的結果；泳道3為建立的歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測豬細小病毒結果；泳道4歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測豬偽狂犬病毒結果；泳道5為歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測結果O型口蹄疫病毒的結果，泳道6為陰性對照。
【具體實施方式】
[0018]實施例1:
歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒的使用方法:
1、歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的核酸提取:
采集待檢動物的血液或病死動物的組織，制成1:5的乳懸液，用Trozol法提取其全基因組RNA，以RNA為模板，以試劑盒中的特異性歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物進行多重RT-PCR，對得到的產物進行電泳，根據電泳圖譜分析被檢動物是否感染有歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒。
[0019]2、多重 RT-PCR 反應:
本試劑盒參照Genbank登錄的歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的0RF-6編碼區基因的序列，設計并合成·兩對引物。本試劑盒涉及多重RT-PCR擴增的引物序列及片段的大小如表1所示:
【權利要求】
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括有混合酶Enzyme Mix,2XBuffer 2、無菌雙蒸水和兩對引物，兩對引物分別為用于擴增美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因的引物對一和用于擴增歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的目的基因的引物對二； 所述引物對一包括 上游引物:5' -CACCACGTCGAAAGTGCCGC-3'和 下游引物:5' -GACGCCGGACGACAAATGCG-3'； 所述引物對二包括 上游引物:5' -GGGGCTGTTGCACATCCTAA-3'和 下游引物:5' -ACAAAAGGGCAACAACAGCC-3'；
所述混合酶Enzyme Mix為2Pl,2XBuffer為25μ1,無菌雙蒸水為50μ1 ； 所述2XBufTer由Tris-鹽酸、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸銨、吐溫_20和三磷酸脫氧核苷酸dNTPS組成。
2.根據權利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述引物對一和引物對二的使用量分別為0.8μ1，即引物對一中上下游引物各為0.8μ1，引物對二中上下游引物各為0.8μ1。
3.一種根據權利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒在檢測歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒的使用方法為:從待檢動物的血液或病死動物的組織中提取其全基因組RNA，以RNA為模板，以試劑盒中的特異性歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒的引物進行多重RT-PCR，對得到的產物進行電泳，根據電泳圖譜分析被檢動物是否感染有歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜合征病毒。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627816SQ201310375408
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年8月26日 優先權日:2013年8月26日
【發明者】劉永生, 丁耀忠, 張 杰, 周建華, 陳豪泰, 馬麗娜 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所