參與黃瓜葫蘆素c合成的基因簇及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明首次在黃瓜基因組中發現參與葫蘆素C合成的基因簇，共由8個基因組成，其中5個基因均位于6號染色體35kb的范圍內。利用酵母體系解析了葫蘆素C合成的第1至第4步反應，并在煙草體系中共表達了這8個基因，可實現葫蘆素C的合成。本發明進一步揭示了黃瓜苦味形成的分子機制，為無苦味黃瓜育種提供了理論依據和分子輔助育種目標；同時為葫蘆素的體外人工合成提供了寶貴經驗。
【專利說明】參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程及分子生物學領域，具體地說，涉及參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇及其應用。
【背景技術】
[0002]黃瓜的苦味是由一類稱為葫蘆素C的三萜化合物導致的。黃瓜果實中積累葫蘆素C會嚴重影響黃瓜的口感及品質。早期的經典遺傳學試驗發現黃瓜的苦味由Bi和Bt兩個基因控制。CN103013966中發現Bi基因編碼氧化角鯊烯環化酶，它催化生成葫蘆2烯醇，是葫蘆素C合成的第一步，也是合成中最關鍵的一步。葫蘆素C的合成除了第一步生成葫蘆2烯醇，還需要經過一系列的催化修飾，然而，葫蘆2烯醇在植物體內是如何被修飾，最終合成葫蘆素C，目前尚不清楚。
[0003]大部分葫蘆素科植物都具有葫蘆素，例如，葫蘆素C來源于黃瓜，葫蘆素E來源于甜瓜，葫蘆素B來源于西瓜。但是它們的合成路徑尚不清楚，相關合成基因也沒有被克隆獲得。因此，葫蘆素主要從植物中提取獲得，不能體外直接合成。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇及其應用。
[0005]為了實現本發明目的，本發明提供參與黃瓜葫蘆素C合成的蛋白，包括Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、CsalG044890和Csa6G088700，它們的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.1-8所示。
[0006]本發明還提供參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇，所述基因簇共由8個基因組成，Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、CsalG044890和Csa6G088700，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.12-19所示。
[0007]本發明還提供含有所述參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇的載體、工程菌、宿主細胞及轉化的植物。
[0008]本發明還提供所述參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇在調控黃瓜苦味合成中的應用。
[0009]本發明還提供所述參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇在調控葫蘆素體外合成中的應用。
[0010]本發明還提供所述參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇在無苦味黃瓜分子育種中的應用。
[0011]本發明還提供一種轉基因植物的構建方法，采用農桿菌介導的方法，將含有所述參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇的載體轉入植物體(例如煙草等)中，篩選獲得轉基因植物。
[0012]在之前的研究中， 對114份黃瓜核心種質材料進行重測序分析，同時對這114份材料進行苦味表型鑒定。采用全基因組關聯分析(GWAS)的方法和群體作圖，快速找到了控制葉片苦味的Bi候選基因。Bi編碼一個葫蘆2烯醇環化酶基因，是葫蘆素C合成的關鍵酶。葫蘆2烯醇還需要進一步被氧化和乙酰化才能生成葫蘆素C。為了解析葫蘆素C合成的其他步驟，對黃瓜轉錄組數據(RNA-Seq)進行分析，尋找與Bi基因共表達的P450基因和乙酰轉移酶基因，在黃瓜基因組中一共找到了 6個P450基因(Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550 和 CsalG044890)和 I 個乙酰轉移酶基因(Csa6G088700)。這7個基因與Bi (Csa6G088690)基因在黃瓜各個組織中的表達狀態非常相似，只在葉片中大量表達。此外，除了 3個P450基因(Csa3G903540、Csa3G903550和CsalG044890)，其他基因與Bi基因均位于6號染色體35kb的范圍內，形成一個類似基因簇的結構。目前，以基因簇的形式參與重要次生代謝產物合成在高等植物中被廣泛發現，因此推測本發明發現的這7個候選基因很可能與Bi基因一起形成葫蘆素C合成基因簇，在黃瓜葉片中合成苦味物質。
[0013]進一步利用酵母表達體系，在酵母中表達這些候選基因，用GC-MS或UPLC-Q-TOF儀來檢測酵母提取物，解析苦味合成中間產物。首先，用GC-MS在表達B1、輔酶CPR和Csa3G903540的酵母中發現了一個特異的產物。該產物的MS檢測結果與葫蘆2烯醇相比，檢測到大的離子碎片少了 2個氫原子，這意味著葫蘆2烯醇很有可能被Csa3G903540氧化。進一步將該產物從酵母中純化分離出來，利用核磁共振(UMR)解析其結構，發現葫蘆2烯醇的19號碳原子發生羥基化，進而證明Csa3G903540催化葫蘆2烯醇的氧化，是苦味合成的第二步。繼續利用酵母表達體系，表達更多的候選基因，用UPLC-Q-TOF分析產物的精確分子量，推測可能發生的氧化反應產物。通過該方法，僅在表達B1、CPR、Csa3G903540和Csa6G088160酵母提取物中發現分子量為459.3833 [M+H]的產物，與Csa3G903540催化生成的產物(C30H5002)的分子量相比，剛好多了一個氧原子的質量，而在表達其他候選P450基因的酵母中無任何特異產物出現，由此推測Csa6G088160參與葫蘆素C合成的第三步。采用同樣的方法，發現在表達B1、CPR、Csa3G903540、Csa6G088160和Csa3G903550的酵母提取物中發現分子量為497.3601 [M+Na]的產物，與Csa6G088160催化生成的產物(C30H5003)的分子量相比，剛好又多了一個氧原子，推測Csa3G903550參與葫蘆素C合成的第四步。
[0014]除了解析葫蘆素C的合成路徑，本發明還將找到的7個候選基因加上之前發現Bi基因以及已報道的HMGR和FPS基因在煙草中同時表達。煙草葉片中本身是不存在葫蘆素C的，但在成功表達基因簇基因后，煙草葉片中檢測到了葫蘆素C的合成，證明了該基因簇的功能。此外，利用同樣的實驗體系，還發現缺少7個候選基因中任意一個基因，煙草葉片均不能生成葫蘆素C，因而從另一個方面驗證了在黃瓜基因組中找到的基因簇在黃瓜葉片中協同表達，共同參與苦味物質的合成。
[0015]本發明首次在黃瓜基因組中發現參與葫蘆素C合成的基因簇，共由8個基因組成，其中5個基因均位于6號染色體35kb的范圍內。利用酵母體系解析了葫蘆素C合成的第I至第4步反應，并在煙草體系中共表達了這8個基因，可實現葫蘆素C的合成。本發明進一步揭示了苦味形成的分子機制，為無苦味黃瓜育種提供了理論依據和分子輔助育種目標，可用于大規模篩選育種材料，大大加快高營養黃瓜的育種進程；同時還為葫蘆素的體外人工合成提供了寶貴經驗，本發明可替代傳統的從植物材料中提取苦味素(葫蘆素)的方法，實現體外合成苦味素。
【專利附圖】
【附圖說明】[0016]圖1為本發明通過分析RNA-Seq數據，從黃瓜基因組中發現與苦味素(葫蘆素C)合成相關的基因族。
[0017]圖2為本發明利用GC-MS檢測參與苦味素合成第二步反應的結果；其中，A為GC-MS檢測到的Csa5G903540的特異產物，B為該特異產物的MS檢測結果，虛線小框為葫蘆素2烯醇的MS檢測結果。
[0018]圖3為本發明利用UPLC-Q-TOF檢測參與苦味素合成第三步反應的結果。
[0019]圖4為本發明用UPLC-Q-TOF檢測參與苦味素合成第四步反應的結果。
[0020]圖5為本發明利用煙草瞬時表達系統共表達與苦味素合成相關的基因簇以及HMGR和FPS基因后，用UPLC-Q-TOF檢測煙草葉片提取物的結果。
【具體實施方式】
[0021]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0022]實施例1參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇的挖掘與獲得
[0023]I基因簇的挖掘
[0024]Bi基因在黃瓜葉片中大量表達，以此為線索，分析黃瓜轉錄組數據(RNA-Seq)尋找與Bi共表達的P450基因和乙酰轉移酶基因，在黃瓜基因組中一共找到了 6個P450基因(Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550 和 CsalG044890)和I個乙酰轉移酶基因(C`sa6G088700)。這7個基因與Bi (Csa6G088690)基因在黃瓜各個組織中的表達狀態非常相似，只在葉片中大量表達(圖1)。此外，除了 3個P450基因(Csa3G903540、Csa3G903550和CsalG044890)，其他基因與Bi基因均位于6號染色體35kb的范圍內，形成了一個類似基因簇的結構(圖1)。葫蘆素C在黃瓜各個組織的中分布與該基因簇的表達模式很相似(圖1)，都是葉片中最高，因此認為該基因簇參與苦味物質的合成。
[0025]2 黃瓜 Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550 和CsalG044890基因的獲得
[0026]首先制備黃瓜葉片cDNA文庫，然后利用正向引物和反向引物進行PCR擴增(引物序列見表1)。
[0027]表1引物序列(5' -3')
[0028]
【權利要求】
1.參與黃瓜葫蘆素C合成的蛋白，包括Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、CsalG044890 和 Csa6G088700，它們的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.1-8所示。
2.參與黃瓜葫蘆素C合成的基因簇，其特征在于，所述基因簇由以下8個基因組成，Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、CsalG044890和Csa6G088700，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.12-19所示。
3.含有權利要求2所述基因簇的載體。
4.含有權利要求2所述基因簇的工程菌。
5.權利要求2所述基因簇在調控黃瓜苦味合成中的應用。
6.權利要求2所述基因簇在調控葫蘆素體外合成中的應用。
7.權利要求2所述基因簇在調控葫蘆素C體外合成中的應用。
8.權利要求2所述基因簇在無苦味黃瓜分子育種中的應用。
9.一種轉基因植物的構建方法，其特征在于，采用農桿菌介導的方法，將權利要求3所述的載體轉入植物體中，篩選獲得轉基因植物。
10.根據權利要求 9所述的方法，其特征在于，所述植物為煙草。
【文檔編號】C12N15/29GK103483435SQ201310376574
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月26日 優先權日:2013年8月26日
【發明者】黃三文, 尚軼, 張忠華, 馬永碩, 張慧敏, 李穎 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所