一種基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法，該方法以昆蟲鱗翅為基底，所述昆蟲鱗翅傾斜放置于細胞懸浮液中，細胞在重力作用下垂直落在所述昆蟲鱗翅表面，且細胞數目自上而下逐漸增多；所述昆蟲鱗翅表面的細胞根據昆蟲鱗翅表面的微納結構定向排列。本發明以昆蟲鱗翅作為基底，易于獲得，安全無毒，可實現細胞密度和排列同時可控的細胞培養，同時規避了人工合成材料帶來的一系列工藝復雜及安全問題；利用重力作用形成的密度梯度分布，規避了機械作用力對細胞的損傷，保留了細胞活力，形成的具有定向排列規律和密度梯度分布的細胞排列對于組織再生包括連接組織再生與修復都具有潛在的應用前景和現實意義。
【專利說明】—種基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物材料及組織工程【技術領域】，具體涉及一種基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法。
【背景技術】
[0002]隨著組織工程中器官與組織修復、移植、生物傳感器等研究的發展，細胞定向排列生長以及細胞密度的梯度分布越來越重要。目前隨著微納技術的成熟，細胞培養的基底材料可以在體外實現可控的細胞粘附、定向排列等行為。與此同時，利用機械力、物理化學方法以及噴墨打印機技術等也可以在體外實現細胞密度的梯度分布。
[0003]然而，目前許多基底材料的合成工藝復雜，甚至涉及到一些有毒物質，并且無論是物理化學方法還是打印技術都會對細胞活力造成損害。另外，在目前細胞培養的研究中，幾乎沒有一種方法能夠實現細胞密度和排列同時可控的細胞培養方法。因此，無法滿足醫用種植體、組織工程尤其是骨連接組織工程等領域的需要。
[0004]綜上所述，亟需一種能夠實現細胞密度和排列同時可控的細胞培養方法，以實現細胞定向有序排列并具一定的密度梯度分布。
【發明內容】
[0005]本發明主要解決的技術問題是提供一種以昆蟲鱗翅為基底的細胞培養方法，可實現細胞密度和排列同時可控的細胞培養方法，對于組織再生包括連接組織再生與修復都具有潛在的應用前景和現實意義。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是:提供一種基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的.方法，該方法以昆蟲鱗翅為基底，所述昆蟲鱗翅傾斜放置于細胞懸浮液中，細胞在重力作用下垂直落在所述昆蟲鱗翅表面，且細胞數目自上而下逐漸增多；所述昆蟲鱗翅表面的細胞根據昆蟲鱗翅表面的微納結構定向排列。
[0007]在本發明一個較佳實施例中，所述方法具體步驟如下:
(1)獲取和固定昆蟲鱗翅:截取長方形昆蟲鱗翅薄片，用聚苯乙烯溶液將所述鱗翅薄片背面朝上固定在相同大小的玻璃片上，并做親水處理；
(2)配制細胞懸浮液:選取目標細胞，用培養皿將目標細胞稀釋成一定濃度的懸浮液，將所得細胞懸浮液放入玻璃容器中；
(3)細胞沉降:將步驟(I)中制備的昆蟲鱗翅以一定的傾斜角插入步驟(2)中準備好的細胞懸浮液中，并使昆蟲鱗翅沒入細胞懸浮液中，靜置數小時；
(4)獲得具有定向排列規律和密度梯度分布的細胞排列:將步驟(3)中的昆蟲鱗翅取出，用磷酸緩沖液沖洗掉黏附不牢固的細胞，得到所需的具有定向排列規律和密度梯度分布的細胞排列。
[0008]在本發明一個較佳實施例中，所述步驟(I)中，昆蟲鱗翅薄片選自大藍閃蝶、歡樂女神閃蝶、小藍閃蝶、大陸閃蝶、西方藍閃蝶、白斑眼蝶、玉斑鳳蝶中的至少一種。[0009]在本發明一個較佳實施例中，所述步驟(2)中，目標細胞為具有纖維狀形狀的細胞。
[0010]在本發明一個較佳實施例中，所述目標細胞為成纖維細胞、骨髓干細胞和神經細胞中的至少一種。
[0011]在本發明一個較佳實施例中，所述步驟(2)中，細胞懸浮液的濃度為2X IO5個/mL。
[0012]在本發明一個較佳實施例中，所述步驟(3)中，昆蟲鱗翅的插入數量為I片或者多片不同表面結構的昆蟲鱗翅的組合。
[0013]在本發明一個較佳實施例中，所述昆蟲鱗翅的插入傾斜角度為5?85°。
[0014]在本發明一個較佳實施例中，所述昆蟲鱗翅的插入方向為以表面紋路橫向插入或縱向插入中的至少一種。
[0015]本發明的有益效果是:本發明公開了一種基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法，該方法應用昆蟲鱗翅這種天然生物材料作為基底，具有易于獲得，安全無毒的特點，可實現細胞密度和排列同時可控的細胞培養，同時規避了人工合成材料帶來的一系列工藝復雜及安全問題；利用重力作用形成的密度梯度分布，規避了機械作用力對細胞的損傷，保留了細胞活力，形成的具有定向排列規律和密度梯度分布的細胞排列對于組織再生包括連接組織再生與修復都具有潛在的應用前景和現實意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1是本發明一種基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法的流程示意圖；
附圖中各部件的標記如 下:1.昆蟲鱗翅和細胞的準備，2.將昆蟲鱗翅傾斜放置于一定密度的細胞懸浮液中，3.沉降后細胞液中的昆蟲翅基底和細胞排列。【具體實施方式】
下面結合附圖對本發明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發明的優點和特征能更易于被本領域技術人員理解，從而對本發明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。
[0017]請參閱圖1，本發明實施例包括:
昆蟲鱗翅是一種天然生物材料，安全無毒，易于獲得，且其表面具有微納結構，能夠調節與其相接觸的細胞功能，促進細胞的定向排列。
[0018]與此同時，利用重力自然沉降作用，細胞垂直落在鱗翅表面，形成細胞數目自上而下逐漸增多的密度梯度分布，細胞活力得到保證，實現細胞密度和排列同時可控的細胞培
養方法。
[0019]實施例1
基于閃蝶翅基底的細胞密度和排列可控培養
1、獲取和固定閃蝶鱗翅:
截取長方形閃蝶鱗翅薄片，用聚苯乙烯溶液將翅膀薄片背面朝上固定在相同大小的玻璃片上。
[0020]2、配制細胞懸液:
選取NIH/3T3小鼠的成纖維細胞，用培養基將成纖細胞稀釋成濃度為2 X 105/mL的細胞懸浮液，將所得的細胞懸浮液放入一定大小的玻璃容器中。[0021]3、細胞沉降:
將步驟I獲得的閃蝶鱗翅以與水平方向15°的傾斜角插入步驟2中準備好的細胞懸液中，于37°C下靜置數小時。
[0022]4、獲得具有定向排列規律和密度梯度分布的細胞排列:
將步驟3中的閃蝶鱗翅取出，用磷酸緩沖液沖洗掉黏附不牢固的細胞，得到所需的具有定向排列規律和密度梯度分布的細胞排列。
[0023]實施例2
兩種細胞在同一片閃蝶鱗翅上的細胞密度和排列可控的培養
1、獲取和固定閃蝶鱗翅:
截取長方形閃蝶鱗翅薄片，用聚苯乙烯溶液將翅膀薄片背面朝上固定在相同大小的玻璃片上。
[0024]2、配制細胞懸液:
選取NIH/3T3小鼠的成纖維細胞和MFC小鼠骨髓干細胞，用培養基分別稀釋成濃度為2X IOVmL的細胞懸浮液，將所得的細胞懸浮液分別放入一定大小的玻璃容器中。
[0025]3、細胞沉降:
將步驟I獲得的閃蝶鱗翅以與水平方向15°的傾斜角插入步驟2中準備好的小鼠成纖維細胞懸液中，37°C下靜置.數小時后取出，用磷酸換沖液沖洗數遍后；將閃蝶鱗翅頭尾倒置后繼續以與水平方向30°的傾斜角插入步驟2中準備好的小鼠骨髓干細胞懸液中，37°C下靜置數小時。
[0026]4、獲得具有定向排列規律和密度梯度分布的細胞排列:
將步驟3中的閃蝶翅基底取出，用磷酸緩沖液沖洗3遍去除黏附不牢固的細胞，得到兩種細胞密度和排列可控培養的閃蝶翅基底。
[0027]閃蝶翅基底生物相容性測試:
1、閃蝶翅基底的細胞毒性測試:
采用MTT細胞毒性測試法，對閃蝶鱗翅基底上和普通培養皿上培養的細胞進行細胞毒性測試來觀察閃蝶鱗翅的生物毒性。測試結果顯示，生長于閃蝶鱗翅基底上與普通培養皿上的細胞活力無統計性差異。
[0028]2、閃蝶鱗翅基底的細胞活力測試:
用Calcein-AM和碘化丙啶(PI)溶液分別對閃蝶基底上的細胞進行熒光染色。Calcein-AM可以對活細胞染色，PI溶液可以對死細胞染色，在熒光顯微鏡下分別顯示為綠色和紅色。通過對細胞進行染色后，用熒光顯微鏡同時觀察閃蝶鱗翅基底上活細胞和死細胞的數目。結果顯示，閃蝶鱗翅基底上幾乎全為綠色熒光的活細胞，閃蝶鱗翅基底上的細胞活力旺盛。
[0029]以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的【技術領域】，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
【權利要求】
1.一種基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法，其特征在于，該方法以昆蟲鱗翅為基底，所述昆蟲鱗翅傾斜放置于細胞懸浮液中，細胞在重力作用下垂直落在所述昆蟲鱗翅表面，且細胞數目自上而下逐漸增多；所述昆蟲鱗翅表面的細胞根據昆蟲鱗翅表面的微納結構定向排列。
2.根據權利要求1所述的基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法，其特征在于，所述方法具體步驟如下: (1)獲取和固定昆蟲鱗翅:截取長方形昆蟲鱗翅薄片，用聚苯乙烯溶液將所述鱗翅薄片背面朝上固定在相同大小的玻璃片上，并做親水處理； (2)配制細胞懸浮液:選取目標細胞，用培養皿將目標細胞稀釋成一定濃度的懸浮液，將所得細胞懸浮液放入玻璃容器中； (3)細胞沉降:將步驟(I)中制備的昆蟲鱗翅以一定的傾斜角插入步驟(2)中準備好的細胞懸浮液中，并使昆蟲鱗翅沒入細胞懸浮液中，靜置數小時； (4)獲得具有定向排列規律和密度梯度分布的細胞排列:將步驟(3)中的昆蟲鱗翅取出，用磷酸緩沖液沖洗掉黏附不牢固的細胞，得到所需的具有定向排列規律和密度梯度分布的細胞排列。
3.根據權利要求2所述的基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，昆蟲鱗翅薄片選自大藍閃蝶、歡樂女神閃蝶、小藍閃蝶、大陸閃蝶、西方藍閃蝶、白斑眼蝶、玉斑鳳蝶中的至少一種。
4.根據權利要求2所述的基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，目標細胞為具有纖維狀形狀的細胞。
5.根據權利要求4所述的基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法，其特征在于，所述目標細胞為成纖維細胞、骨髓干細胞和神經細胞中的至少一種。
6.根據權利要求2所述的基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，細胞懸浮液的濃度為2X IO5個/mL。
7.根據權利要求2所述的基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，昆蟲鱗翅的插入數量為I片或者多片不同表面結構的昆蟲鱗翅的組八口 ο
8.根據權利要求7所述的基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法，其特征在于，所述昆蟲鱗翅的插入傾斜角度為5?85°。
9.根據權利要求8所述的基于昆蟲翅基底的細胞密度和排列可控培養的方法，其特征在于，所述昆蟲鱗翅的插入方向為以表面紋路橫向插入或縱向插入中的至少一種。
【文檔編號】C12N5/079GK103436491SQ201310400248
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月5日 優先權日:2013年9月5日
【發明者】趙遠錦, 陸潔, 劉慈慧, 鄭付印, 顧忠澤 申請人:東南大學