人正常支氣管上皮細胞及其原代分離培養和傳代培養方法與用途
【專利摘要】本發明公開了人正常支氣管上皮細胞及其原代分離培養和傳代培養方法與用途。該細胞命名為人正常支氣管上皮細胞HNBEC/HL-001，保藏編號為CCTCCNO：C201311。其原代分離培養的方法為：去除肺癌患者手術切除的癌旁組織樣品中脂肪，經過消化后加入分散酶和DNaseI作用，通過過濾、離心收集細胞，再用HL培養基重懸細胞，接種培養。其傳代培養的方法為：細胞增殖至70～90%豐度時，用胰酶-EDTA消化，再用DMEM中和；離心收集細胞，用HL培養基重懸細胞，接種培養。本發明的細胞可用于人正常細胞的生理學研究，體外正常細胞的藥物毒性研究和檢測，支氣管和肺相關疾病包括支氣管肺癌的發病機理研究。
【專利說明】人正常支氣管上皮細胞及其原代分離培養和傳代培養方法與用途
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于細胞生物學領域，涉及一種人正常支氣管上皮細胞及其原代分離培養和傳代培養方法與用途。
【背景技術】
[0003]人體重要器官如肺、腎、肝、胰腺和皮膚都由器官特異性分化的上皮細胞為其組成成分。這些特異性分化的上皮細胞與不同器官的特異性功能直接相關，如肺的氣體交換功能、腎的過濾功能、肝的解毒及中和功能、胰腺細胞產生胰島素、皮膚具有保護機體免受外界環境的傷害。而 這些重要器官一旦發生病變或退化就會威脅人類的健康，因為這些重要器官是很難被替換的，不同器官的特異性細胞也不能相互取代其它器官的細胞。這些特異性分化的細胞都是很難再生的，更不要說在體外進行培養增殖了。這樣大大限制了人們對機體正常細胞功能的認識，很多來自于科技文獻甚至教科書的細胞生物學知識的描述是不準確甚至是錯誤的。真正的原因是多數正常細胞的生物學知識來源于體外培養的“癌細胞”研究結果。盡管各國科學家始終不斷的嘗試著培養和增殖人體重要器官的功能性的上皮細胞，但是，對于分離自人和哺乳動物的原代上皮細胞的體外培養仍然是很困難的。應用目前的無血清培養基，有的只能進行短期的原代培養(存活數天，如肺和胰腺等上皮細胞)，有的只能進行有限的傳代培養(1-3代，如氣管/支氣管及前列腺等上皮細胞)，有的甚至根本不能體外培養(如肝、結腸、前列腺等上皮細胞)，只有來自于人體皮膚的角化上皮細胞可以傳代培養10代左右。而且從每個動物或活體組織樣品中獲得的上皮細胞產量仍然很低，包括細胞的數量、直接分離或短期培養的細胞純度都是很低的，這些原代和傳代上皮細胞的增殖速度也極為有限。
[0004]為了在體外進行上皮細胞的培養，目前國外嘗試通過遺傳操作，如轉入病毒(SV40T或HPV16E6E7)或細胞癌基因，可以延長體外細胞存活的代數。然而遺傳操作的最大缺點是會改變這些細胞的遺傳背景和表型，以致讓這些正常上皮細胞丟失其正常生理功能，如P53和pRB信號通路常常被抑制。而且，這些經遺傳修飾的細胞是不可能重新再移植進機體的。但是由于目前缺乏有效的體外培養上皮細胞的技術，上述這些細胞在當今世界的醫學和生命科學研究中仍然備受青睞。在非癌癥研究領域，它們就代表著最初來源的“功能”性的組織或器官。在癌癥研究領域，它們還常常被用來作為“正常細胞”對照，而且它們的市場價格還非常昂貴。現階段，國內外還從未有過“正常細胞”可以應用于基礎和臨床醫學研究。
[0005]正常人支氣管上皮細胞主要功能:(I)支氣管表面的上皮細胞構成了基底柱狀結構，清除粘液纖毛。(2)由纖毛、無纖毛和能分泌黏液的細胞等混合細胞群組成物理屏障，可有效防止多種有毒物質。(3)產生和分泌大量化學介質和細胞因子形成高度復雜的宿主防御系統。人支氣管上皮細胞與主要病理生理疾病有關，如支氣管肺癌(多簡稱為肺癌)、慢性支氣管炎、支氣管擴張、支氣管狹窄。如果能獲得體外穩定傳代的人正常支氣管上皮細胞，將使人們可以更全面地研究細胞的正常功能，疾病發病機理，組織器官功能重建或再造，以及測定藥物對正常細胞的毒性，這些都將對基礎和臨床醫學研究與應用有重大意義。
【發明內容】
[0006]本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種人正常支氣管上皮細胞。該細胞分離培養自中國人的正常肺組織，該細胞未導入任何外源基因，為正常二倍體細胞，基因分型鑒定為國內外從未登記注冊過的一種人的正常細胞系。
[0007]本發明的另一目的在于提供上述人正常支氣管上皮細胞的原代分離培養方法。
[0008]本發明的再一目的在于提供上述人正常支氣管上皮細胞的傳代培養方法。
[0009]本發明的目的還在于提供上述人正常支氣管上皮細胞的用途。
[0010]本發明的目的通過下述技術方案實現:
一種人正常支氣管上皮細胞，分類命名為人正常支氣管上皮細胞HNBEC/HL-001，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:C201311。該細胞來源于中國人的正常肺上皮細胞，染色體為二倍體，STR (短串聯重復序列)基因型以16個“STR基因座/等位基因長度”來表示:AMEL/X/Y，D3S1358/17，TH01/7/8，D21Sll/31/32，D18S51/20，Penta E/11,D5S818/11/12, D13S317/8/11, D7S820/8/13, D16S539/11, CSF1P0/10/12, Penta D/7/13,vffA /17，D8S1179/15/16，TPOX/8/11, FGA/20/24。
[0011]所述的人正常支氣管上皮細胞的培養條件優選為用HL培養基于37°C、5% CO2培養；所述的HL培養基為:DMEM與無血清培養基SFM按體積比1: 3混合，同時添加5%(v/v)的 FBS (胎牛血清)，以及 0.4 μ g/mL 皮質醇(hydrocortisone), 5 Ug/mL 胰島素(insulin),8.4 ng/mL 霍亂毒素(cholera toxin), 10 ng/mL 表皮生長因子(epithelialgrowth factor (EGF) ),24 μ g/mL 腺嘌呤(adenine), 100 U/mL 青霉素(penicillin), 100μ g/mL 鏈霉素(streptomycin), 0.25 Pg/mL 兩性霉素 B (Fungizone), 30 μ M 法舒地爾(Fasudil)，上述培養基需經0.22 μ m孔徑濾膜過濾。
[0012]上述人正常支氣管上皮細胞的原代分離培養方法，包括如下步驟:
(I)在病人或病人監護人知情同意的情況下，收集肺癌患者手術切除的癌旁正常組織樣品。
[0013](2)用95-100% (v/v)的乙醇洗分離的組織樣品，再用PBS (0.01M,pH 7.4)洗，然后將組織樣品放入含預冷PBS的無菌培養皿中，在解剖顯微鏡下，用解剖鑷子和剪刀去除組織樣品中殘留的脂肪。
[0014](3)將組織樣品用消化液消化；優選的，所述的消化液為含膠原酶和分散酶的HL
培養基。
[0015](4)消化后的組織離心去上清，將細胞沉淀重懸于0.25% (質量體積比)胰酶-EDTA中消化。
[0016](5)加入含10% (v/v) FBS的DMEM培養基，離心去上清。
[0017](6)加入溫水浴的分散酶和DNase I，用槍頭反復吹打樣品。
[0018](7)再加入含10% (v/v) FBS的DMEM培養基，用40-70 μ m孔徑的過濾器過濾細胞懸液，收集過濾后的細胞懸液，離心去上清。[0019](8)重懸細胞沉淀于HL培養基中，接種于培養瓶培養，得到人正常支氣管上皮細胞。
[0020]步驟(2)中所述的預冷優選為在冰上預冷。
[0021]步驟(3)中所述的消化液的用量優選為10倍于組織樣品體積。
[0022]步驟(3)中所述的消化的條件優選為37°C消化I-3小時。
[0023]步驟(3)中所述的膠原酶和分散酶的濃度優選為均為0.2 mg/mL。
[0024]步驟(4)中所述的消化優選為冰上消化I小時或室溫消化10分鐘。
[0025]步驟(6)中所述的溫水浴優選為37°C的溫水浴。
[0026]步驟(4)、(5)、(7)中所述的離心優選為1000 rpm離心5分鐘。
[0027]步驟(8)中 所述的培養的條件優選為37°C、5% C02。
[0028]上述人正常支氣管上皮細胞的傳代培養方法，包括如下步驟:
(I)當人正常支氣管上皮細胞增殖至70-90%豐度時，用IXPBS (0.01M,pH 7.4)洗滌細胞，再用0.05% (質量體積比)胰酶-EDTA消化單層細胞。
[0029](2)加入DMEM中和消化反應；離心去上清，用HL培養基重懸細胞沉淀，接種于培
養瓶培養。
[0030]步驟(I)中所述的消化的時間優選為2-5分鐘。
[0031]步驟(2)中所述的離心優選為1000 rpm離心5分鐘。
[0032]步驟(2)中所述的培養的條件優選為37°C、5% C02。
[0033]上述人正常支氣管上皮細胞可用于人正常細胞的生理學研究，體外正常細胞的藥物毒性研究和檢測，支氣管和肺相關疾病包括支氣管肺癌的發病機理研究。
[0034]本發明相對于現有技術具有如下優點和效果:
(I)本發明提供的人正常支氣管上皮細胞，原代分離培養自人的正常肺組織，該細胞未導入任何外源基因，經核型分析鑒定為人的正常二倍體細胞。
[0035](2)本發明提供的人正常支氣管上皮細胞，原代分離培養自中國人的正常肺組織，經STR基因分型鑒定，是國內外從未登記注冊過的一種人的正常細胞系。
[0036](3)本發明提供的人正常支氣管上皮細胞，可用于人正常細胞的生理學研究，體外正常細胞的藥物毒性研究和檢測，支氣管和肺相關疾病包括支氣管肺癌的發病機理研究。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]圖1是人正常支氣管上皮細胞的細胞形態圖。
[0038]圖2是人正常支氣管上皮細胞的生長曲線圖。
[0039]圖3是人正常支氣管上皮細胞的染色體核型分析圖。
[0040]圖4是人正常支氣管上皮細胞的STR基因分型圖。
[0041]圖5是人正常支氣管上皮細胞的藥敏檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0042]下面結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0043]實施例1原代人正常支氣管上皮細胞的原代分離培養(I)在病人或病人監護人知情同意的情況下，收集肺癌患者手術切除的癌旁正常組織樣品。[0044](2)消化液的配制:含膠原酶和分散酶均0.2 mg/mL的HL培養基；其中，HL培養基為:DMEM (GIBC0 # 11965-092)與無血清培養基 SFM (GIBC0 # 10744-019)按體積比I: 3混合，同時添加5% (v/v)的胎牛血清，以及0.4 μ g/mL皮質醇(hydrocortisone),5 μ g/mL 胰島素(insulin), 8.4 ng/mL 霍亂毒素(cholera toxin), 10 ng/mL 表皮生長因子(epithelial growth factor (EGF) ),24 μ g/mL 腺嘌呤(adenine), 100 U/mL 青霉素(penicillin), 100 μ g/mL 鏈霉素(streptomycin), 0.25 Kg/mL 兩性霉素 B (Fungizone),30 μ M法舒地爾(Fasudil )，上述培養基需經0.22 μ m孔徑濾膜過濾)。
[0045](3)用用95-100% (v/v)的乙醇洗分離的組織樣品I次，再用PBS (0.01M, pH
7.4)洗2次，然后將組織放入含冰上預冷PBS的無菌培養皿中，在解剖顯微鏡下，用解剖鑷子和剪刀去除組織中殘留的脂肪。
[0046](4)將組織樣品I-2 cm3放入(2)的10 mL消化液的14 mL或50 mL離心管中，37°C消化I-3小時。
[0047](5)將消化后的組織低速離心(1000 rpm) 5分鐘，去除上清。
[0048](6)將細胞沉淀重懸于2-5 mL的0.25% (質量體積比)胰酶-EDTA中，置于冰上I小時或室溫10分鐘。
[0049](7)然后加入10 mL含10% (v/v)FBS的DMEM培養基，低速1000 rmp離心5分鐘；
盡量將上清去除干凈。
[0050](8)加入 2 mL 溫水浴(37°C )的 5 mg/mL 分散酶和 200 μ L 的 I mg/mL DNase I,用無菌的Piooo —次性塑料槍頭反復吹打樣品I分鐘。
[0051](9)加入10 mL含10% (v/v)FBS的DMEM，用40-70 μ m孔徑的過濾器過濾細胞懸液，收集過濾后的細胞懸液，低速1000 rmp離心5分鐘，去除上清。
[0052](10)重懸細胞沉淀于HL培養基中，接種于T25或T75的培養瓶培養，培養條件是37。。、5% CO2。
[0053]按照上述方法分離培養成功的原代人正常支氣管上皮細胞，顯微鏡下觀察細胞的形態如圖1 (排列緊密、細胞界限清晰、立體感強、多角型的上皮細胞)。該細胞分類命名為“人正常支氣管上皮細胞HNBEC/HL-001”，已于2013年4月10日保藏于中國典型培養物保藏中心(地址:中國.武漢.武漢大學)，保藏編號為CCTCC NO:C201311。
[0054]實施例2人正常支氣管上皮細胞的傳代培養
(I)當在T25或T75的培養瓶中培養的人正常支氣管上皮細胞增殖至70-90%豐度時，用IXPBS (0.01M, pH 7.4)洗滌細胞兩次，再用0.05% (質量體積比)胰酶-EDTA消化單層細胞2-5分鐘。
[0055](2)加入10 mL完全DMEM中和消化反應1-2分種。
[0056](3)1000 rmp離心5分鐘，去上清，重懸細胞沉淀于10 mL HL培養基中接種培養。
[0057](4)必要時可將IX IO6上皮細胞重懸于I-2 mL的細胞凍存液(90%胎牛血清和10% DMSO, v/v)中，儲存于液氮中備用。
[0058]按照上述方法傳代培養人正常支氣管上皮細胞，培養建系的細胞生長曲線如圖2，連續傳代培養55天，本發明的人正常支氣管上皮細胞仍能保持增殖狀態正常生長。[0059]實施例3人正常支氣管上皮細胞的核型分析鑒定
(I)當人正常支氣管上皮細胞(I X IO6)處于指數生長期時，加秋水仙素，終濃度為0.2μ g/mL，繼續培養3.5小時。
[0060](2)反復吹打細胞使其脫落，2000 rpm離心5分鐘收獲細胞。
[0061](3)棄上清液，加入37°C預溫的0.075 mo I/L KCl溶液8 mL，輕輕吹打細胞團混勻，置37 °C低滲處理25分鐘。
[0062](4)加入I mL新配制的固定劑(甲醇:冰乙酸=3:1, v/v),小心吹打、混勻，2000 rpm離心5分鐘。
[0063](5)棄上清液，加入8 mL固定劑，吹打制成細胞懸液后，室溫下固定20分鐘。
[0064](6) 2000 rpm離心5分鐘,棄上清液，重復固定一次。
[0065](7)棄上清液，加入數滴固定劑制成細胞懸液，取2-3滴于冰水浸泡過的載玻片上。
[0066](8)將載玻片置70°C烤箱中干烤2小時，自然冷卻。
[0067](9)2.5% (質量體積比)胰酶溶液(ρΗ6.8-7.2) 5 mL處理25-45秒鐘。
[0068](10) 37°C預溫的生理鹽水漂洗，Giemsa染色5-10分鐘,做G顯帶分析。
[0069](11)顯微鏡下觀察細胞核型并攝影，進行核型分析；至少觀察分析20個以上有絲分裂中期細胞。代表性的細胞核型分析結果見圖3，人正常支氣管上皮細胞為正常二倍體，46條染色體未見異常排列。`
[0070]實施例4人正常支氣管上皮細胞的基因分型分析鑒定
(I)貼壁生長的人正常支氣管上皮細胞(I X 106)，用I XPBS洗滌細胞兩次，0.05%胰酶-EDTA消化單層細胞2-5分鐘，10 mL完全DMEM中和消化反應。
[0071](2)10000 rpm離心I分鐘，倒盡上清，加200 μ L緩沖液GA (細胞/組織基因組DNA提取試劑盒DP304，天根公司)，振蕩至徹底懸浮。
[0072](3)加入 20 μ L Proteinase K 溶液，混勻。
[0073](4)加入200 μ L緩沖液GB (細胞/組織基因組DNA提取試劑盒DP304，天根公司)，充分顛倒混勻，70°C放置10 min，簡短離心。
[0074](5)加人200 μ L無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，簡短離心。
[0075](6)將所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱中(細胞/組織基因組DNA提取試劑盒DP304,天根公司)，12000 rpm離心30秒，去廢液。
[0076](7)向吸附柱中加入500 μ L緩沖液⑶(細胞/組織基因組DNA提取試劑盒DP304，天根公司)，12000 rpm離心30秒,去廢液。
[0077](8)向吸附柱中加入600 μ L漂洗液PW(細胞/組織基因組DNA提取試劑盒DP304，天根公司)，12000 rpm離心30秒,去廢液。
[0078](9)將吸附柱轉入另一離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-200 μ L洗脫緩沖液TE (細胞/組織基因組DNA提取試劑盒DP304，天根公司)，室溫放置2-5 min, 12000rpm (-13400 Xg)離心2分鐘，將提取的DNA溶液收集到離心管中。
[0079](10)利用 PowerPlex? 16 HS 系統(DC2101，promega 公司)進行 16 個基因座(15個STR位點和I個性別位點)的DNA復合擴增。
[0080](11)使用ABI PRISM? 3100型遺傳分析儀(1.1版本數據收集軟件)進行擴增片段的檢測。
[0081](12)使用Genotyper?和PowerTyperTM 16 Macro軟件分析樣本數據，進行自動基因分型，STR分型結果圖4，檢測16個STR基因位點，以“STR基因座/等位基因長度”來表示:AMEL/X/Y, D3S1358/17, THO1/7/8, D21S11/31/32, D18S51/20, Penta E/11,D5S818/11/12, D13S317/8/11, D7S820/8/13, D16S539/11, CSF1P0/10/12, Penta D/7/13,vffA/17, D8S1179/15/16，TPOX/8/11, FGA/20/24。
[0082]本發明的人正常支氣管上皮細胞經STR基因分型鑒定，是國內外從未登記注冊過的一種人的正常細胞系。
[0083]實施例5人正常支氣管上皮細胞的藥敏檢測
(I)將人正常支氣管上皮細胞用0.05%胰酶消化，制備成單細胞懸液，接種于96孔板，每孔接種細胞懸液100 μ L，每孔約為5000個細胞，于37°C、5% CO2培養箱培養。
[0084](2)第二天加藥(5-Fu (5-氟尿嘧啶)、阿霉素、順鉬)處理，每孔加入10 yL不同濃度藥物，藥物濃度梯度(μ M)為0.25,0.5,2.5,5.0、25、50，每種藥物的每個梯度設置三個復孔，同時設置細胞對照組(接種細胞不加藥處理)及只加HL培養基的空白對照組，每組設置三個復孔。
[0085](3)藥物處理(37°C、5% CO2培養箱培養)24小時后，吸去孔內溶液，每孔加入10UL CKK-8檢測試劑(碧云天，上海)，即10 μ L CCK-8 + 90 μ L HL培養基。
[0086](4)在37°C、5% CO2細胞培養箱內繼續孵育0.5-2個小時，孵育時間跟細胞量的多少相關，具體時間根據預實驗確定(可根據液體顏色變化來初步確定)，吸光度范圍控制在1.0-1.5之間最好。
[0087](5 )用酶標儀測定在450nm處的吸光度。
[0088]人正常支氣管上皮細胞對三種抗癌藥物5-Fu、阿霉素、順鉬的敏感性(毒性)檢測結果如圖5，5-Fu在低濃度和高濃度對細胞存活率影響不明顯，順鉬在5 μ M以下的濃度對細胞存活率影響不大，阿霉素在2.5 μ M濃度時細胞存活率已接近O值。表明人正常支氣管上皮細胞對不同藥物毒性檢測的敏感性和區分度。
[0089]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種人正常支氣管上皮細胞，其特征在于:分類命名為人正常支氣管上皮細胞HNBEC/HL-001，保藏編號為 CCTCC NO:C201311。
2.根據權利要求1所述的人正常支氣管上皮細胞，其特征在于:染色體為二倍體，短串聯重復序列基因型以16個短串聯重復序列基因座/等位基因長度來表示:AMEL/X/Y, D3S1358/17, TH01/7/8, D21S11/31/32， D18S51/20, Penta E/ll, D5S818/11/12，D13S317/8/11, D7S820/8/13, D16S539/11, CSF1P0/10/12, Penta D/7/13, WA /17，D8S1179/15/16，TPOX/8/11, FGA/20/24。
3.根據權利要求1所述的人正常支氣管上皮細胞，其特征在于:用HL培養基于37°C、5% CO2培養；所述的HL培養基為:DMEM與無血清培養基SFM按體積比1: 3混合，同時添加 5%的胎牛血清，以及0.4 yg/mL皮質醇，5 μ g/mL胰島素,8.4 ng/mL霍亂毒素，10 ng/mL表皮生長因子，24 μ g/mL腺嘌呤，100 U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素，0.25 Pg/mL兩性霉素B，30 μ M法舒地爾。
4.權利要求1-3任一項所述的人正常支氣管上皮細胞的原代分離培養方法，其特征在于包括如下步驟: (O收集肺癌患者手術切除的癌旁正常組織樣品； (2)用95-100%的乙醇洗分離的組織樣品，再用PBS洗，然后將組織樣品放入含預冷PBS的無菌培養皿中，在解剖顯微鏡下，用解剖鑷子和剪刀去除組織樣品中殘留的脂肪； (3)將組織樣品用消化液消化；所述的消化液為含膠原酶和分散酶的HL培養基； (4)消化后的組織離心去上清，將細胞沉淀重懸于0.25%胰酶-EDTA中消化； (5)加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，離心去上清； (6)加入溫水浴的分散酶和DNaseI，用槍頭反復吹打樣品； (7)再加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，用40-70μπι孔徑的過濾器過濾細胞懸液,收集過濾后的細胞懸液,離心去上清； (8)重懸細胞沉淀于HL培養基中，接種于培養瓶培養，得到人正常支氣管上皮細胞。
5.根據權利要求4所述的人正常支氣管上皮細胞的原代分離培養方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的預冷為在冰上預冷； 步驟(3)中所述的消化液的用量為10倍于組織樣品體積，所述的的消化的條件為37°C消化I-3小時； 步驟(3)中所述的膠原酶和分散酶的濃度均為0.2 mg/mL。
6.根據權利要求4所述的人正常支氣管上皮細胞的原代分離培養方法，其特征在于: 步驟(4)中所述的消化為冰上消化I小時或室溫消化10分鐘； 步驟(6)中所述的溫水浴為37°C的溫水浴； 步驟(8)中所述的培養的條件為37°C、5% C02。
7.根據權利要求4所述的人正常支氣管上皮細胞的原代分離培養方法，其特征在于: 步驟(4)、(5)、(7)中所述的離心為1000 rpm離心5分鐘。
8.權利要求1-3任一項所述的人正常支氣管上皮細胞的傳代培養方法，其特征在于包括如下步驟: (I)當人正常支氣管上皮細胞增殖至70-90%豐度時，用PBS洗滌細胞，再用0.05%胰酶-EDTA消化單層細胞；(2)加入DMEM中和消化反應；離心去上清，用HL培養基重懸細胞沉淀，接種于培養瓶培養。
9.根據權利要求8所述的人正常支氣管上皮細胞的傳代培養方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的消化的時間為2-5分鐘； 步驟(2)中所述的離心為1000 rpm離心5分鐘，所述的培養的條件為37°C、5% C02。
10.權利要求1-3任一項所述的人正常支氣管上皮細胞在人正常細胞的生理學研究、體外正常細胞的藥物毒性研究和檢測、支氣管和肺相關疾病包括支氣管肺癌的發病機理研究中的應用。`
【文檔編號】C12Q1/02GK103451148SQ201310431352
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】李暉, 劉紅亞, 馮文強, 王孝力, 陳凱 申請人:武漢大學