一株有效控制玉米紋枯病并促進玉米生長的綠針假單胞菌的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株有效控制玉米紋枯病并促進玉米生長的綠針假單胞菌，屬于微生物【技術領域】。該菌株為綠針假單胞菌（Pseudomonas?chloroaphis）PSJ1，分離自小麥根際，其保藏編號為CGMCC?NO.7932。該菌不僅對玉米植株有促生作用，還可抑制玉米紋枯病菌的生長，減輕紋枯病的發生。
【專利說明】一株有效控制玉米紋枯病并促進玉米生長的綠針假單胞菌
【技術領域】
[0001]本發明屬微生物領域，涉及一種綠針假單胞菌及應用，特別是涉及一種有效抑制立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)并能促進玉米生長的綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)。
【背景技術】 [0002]玉米(Zea mays)是我國主要糧食、飼料作物及重要的工業原料，在我國國民經濟和農業生產上占有重要地位，玉米生產直接關系著我國糧食戰略安全。近年來玉米紋枯病、小斑病和彎孢霉葉斑病等病害發生愈來愈普遍，危害日益加重，嚴重制約了玉米生產的發展。
[0003]在農業病蟲害的綜合防治中，化學防治占據重要地位，但是化學農藥的長期不合理大量使用不僅污染環境，破壞生態平衡，同時對人畜的健康帶來不利影響。隨著社會的進步和生活水平的提高，人們對環境質量和綠色無公害食品的要求越來越高。
[0004]土壤中存在著各種各樣的微生物，其中包括細菌、真菌、放線茵、原生動物和藻類等。其中有些微生物對植物病原菌有良好的抑制作用，在植物病害防治中有重要的應用價值。假單胞菌屬中的許多菌株，特別是熒光假單胞菌群分布廣、數量多，營養需求簡單、繁殖快、競爭定殖力強，可產生多種抗生素和活性物質，能誘導某些植物產生系統性而備受關注。
[0005]本發明從小麥根際分離到一株綠針假單胞菌(Pseudomonas choloeaphis),命名為PSJl。該菌株能有效抑制立枯絲核菌的生長，降低玉米紋枯病的發生，并能夠促進玉米植株生長。
【發明內容】
[0006]本發明目的是提供一株拮抗玉米紋枯病菌的綠針假單胞菌(Pseudomonaschloroaphis) PSJl菌株,其在玉米紋枯病等的生物防治、促進作物增產等方面有非常好的效果。
[0007]本發明是采用如下技術方案實現的:菌株PSJl分離自山東泰安麥田。通過室內平板對峙實驗和溫室防效測定，篩選出具有良好防病作用的拮抗菌株，命名為PSJ1。通過對該菌16SrRNA序列測定和系統進化分析將其鑒定為綠針假單胞菌(Pseudomonascholoeaphis)。
[0008]本發明涉及的菌株對多種玉米病原真菌具有拮抗作用。室內拮抗實驗顯示該菌株對玉米紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、玉米彎孢霉葉斑病菌(Curvularia lunata Boedijn)等均有較好的抑制效果。
[0009]播種時用濃度為108CFU/ml的PSJl菌懸液進行澆灌，待玉米長至2_3葉期，再用上述菌懸液對植株進行葉片噴施，14d后測量PSJl對玉米的促生效果。同對照相比，用PSJl處理可顯著促進玉米植株生長，植株地上、地下鮮重分別增加54%和43%。[0010]溫室防效實驗表明，用生防菌PSJl處理的玉米植株，在接種玉米紋枯病原菌后同對照相比，病斑擴展受到抑制，達到顯著水平(P〈0.05)，防病效果明顯。
[0011]保藏信息
[0012]保藏時間:2013年7月16日
[0013]保藏單位名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC
[0014]保藏編號:CGMCCN0.7932
[0015]保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號
[0016]分類命名:綠針假單胞菌(pseudomonaschloroaphis)
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1綠針假單胞菌PSJl對病原真菌的拮抗作用
[0018]A為玉米紋枯病菌，B為小麥赤霉病菌，C為玉米小斑病菌。左側為蘸有PSJl菌液的濾紙片，右側為清水。
[0019]圖2菌株PSJl 16S rDNA基因的擴增產物
[0020]圖3用NJ法根據16S rDNA序列構建的系統進化樹
[0021]圖4玉米葉鞘接種紋枯病菌后7天后植株發病情況
[0022]A為農大108，B為鄭單958
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件進行。
[0024]實施例1:根際促生菌的分離和初篩
[0025]根際促生菌的分離采用方中達(1979)的方法。取采集到的土樣10g，加入到盛有90mL無菌水的三角瓶中，將三角瓶置搖床上，180r/min振蕩20min，制成土壤懸液。將制備好的土壤懸液靜置5min，取上清液，采用10倍系列稀釋法，依次稀釋到10_2、10_3、10_4和10_5，每個濃度吸取200 L于NA平板上，涂布均勻，每個濃度重復三次。然后將涂好的NA平板于28 °C恒溫培養箱中培養24h。
[0026]待NA平板上出現細菌菌落時,將白地霉(Geotrichum candidum)孢子懸液(IO5個孢子/mL)均勻噴施于已經長出菌落的NA平板上。噴布要均勻，每皿大約200 ii L。噴施的量不要過多，以防止形成水流把長好的菌落沖散。
[0027]選取周圍出現明顯抑菌圈的菌落，用移菌環挑取菌體，在NA平板上劃線，將平板放入28°C培養箱中培養12h。待長出單菌落后再次挑取菌落劃線，重復三次，得到純的細菌。用牙簽挑取篩選得到的菌落放入盛有5mL液體LB培養基的試管中，28 V振蕩培養14-16h。取ImL菌液，加入到2mL的離心管中，然后再加入15%甘油混勻，于_80°C冰箱中保存。
[0028]實施例2:根際促生菌抑菌譜的測定
[0029]采用對峙培養法(Si jam等，2005)。在直徑為90mm的PDA平板中央接直徑為9mm的玉米紋枯病菌Rhizoctonia solan1、小麥赤霉病菌Gibberella zeae和玉米小斑病菌Bipolaris maydis的菌餅,然后用封口膜封好平板,放入28°C培養箱中培養2天。將直徑為6mm的滅菌濾紙片蘸取準備好的細菌菌液(108cfu/mL)，移到距離病原菌邊緣15mm處，對稱放置，對照只接病原菌菌餅，封口，最后放入28°C培養箱中培養。每個處理重復3次。3d后測量接細菌處病原菌菌落直徑和對照病原菌菌落直徑，計算抑制率。
[0030]結果表明，PSJl對供試病原菌有非常好的抑制效果(圖1)。PSJl對Rhizoctoniasolani > Gibbere I la zeae、Bipolaris maydis 的抑制率分別為 71.1 % >82.4%和 85.5%。
[0031]實施例3:菌株16S rRNA序列的獲得
[0032]以綠針假單胞菌(Pseudomonas choloaphis)基因組為模板，通過PCR擴增其16SrDNA。所用上游和下游引物分別為 16S-F:5' -AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3'，16S-R:5' -AGGGYTACCTTGTTACGACTT-3' ACR 反應程序為 94°C 3min ；94°C 30s, 54°C 45s, 72°C 2min, 30 個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存。反應結束后，將PCR產物置于1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。參照美國AXYGEN公司PCR純化回收試劑盒回收PCR產物，在16°C水浴中與pMD18_T連接過夜。連接反應體系為:10XT4DNA Ligase buffer I u L, pMD18-T (50ng/ u L)0.3 u L,目的 DNA7.7 ii L，T4DNA Ligase (350U/u L) I u L0
[0033]利用熱激法將連接產物轉化感受態細胞。具體方法為:將IOOy L大腸桿菌感受態細胞置于冰上融化，加入IOii L連接產物，輕輕攪動以混勻，將混合物于冰上放置20min，然后42°C水浴熱 激90S，迅速冰上放置5min，然后加800 u L LB液體培養基(不含抗生素)，混勻，37°C, 220r/min振蕩45min。6000rpm離心5min,取出上清至剩余200 u L,重懸菌體,將菌體均勻涂在含有氨芐青霉素的抗生素平板上，然后將平板正向放置30min，37°C倒置培養16-20h，至長出單菌落。
[0034]喊裂解法提取質粒DNA(韓志勇等,2000)。將提取的質粒直于1.0%瓊脂糖凝I父進行電泳，以空PUC18質粒作為對照。如果電泳泳動率與PUC19相同，說明無外源片段插入；如果比PUC19的電泳泳動速率慢，說明在PMD18-T中已經插入外源片段。選擇泳動速率慢的質粒進行 PCR 鑒定。所用 PCR 程序:94°C 3min ；94°C 30s, 54°C 45s, 72°C 2min, 30 個循環；72°C延伸lOmin。反應結束后，將PCR產物置于1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。鑒定好的含有重組質粒的菌株，以菌液形式送上海博尚公司測序。每個菌液樣品2個克隆。將測序結果用BLAST軟件與GenBank中的相關屬種的16S rDNA序列進行比對，利用Mega軟件構建進化樹。
[0035]電泳檢測表明，從PSJl基因組中擴增到了大約1.3kb的片段(圖2)。經過測定，PSJl菌株16SrDNA含有1287bp，具體序列如SEQ.N0.1所示。
[0036]在根據16SrDNA序列構建的系統樹中，PSJl與針假單胞菌聚類到一起，說明PSJl屬于綠針假單胞菌(圖3)。
[0037]實施例4 =PSJl菌株對玉米的室內促生試驗
[0038]選取大小一致的鄭單958玉米種子進行表面消毒，將消毒完全的玉米種子用無菌水浸泡催芽10h，每隔2-3小時換一次水。催芽后的種子進行溫室盆栽實驗，在裝有滅菌土的花盆(190mmX 160mm)中每盆點播4粒，每個處理6盆，三次重復。
[0039]用無菌水調整PSJl菌濃度為108CFU/ml，每盆澆灌40ml ;待玉米長至2_3葉期，葉面均勻噴施菌濃度為108CFU/ml的PSJl菌懸液，對照組噴施等量清水。處理14d后測量株高(土面以上至植株最高處)、根數、根長，以及地上和地下部分的鮮重。結果見表1。[0040]表1PSJl對玉米生長性狀的影響
[0041]
【權利要求】
1.一株綠針假單胞菌，其特征在于命名為綠針假單胞菌PSJ1，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱=CGMCC ;保藏號=CGMCC N0.7932 ;其16SrRNA核苷酸序列如SEQ.N0.1所示。
2.如權利要求1所述的一株綠針假單胞菌PSJl在防治玉米紋枯病中的應用，所述的病原菌是 Rhizoctonia solani。
【文檔編號】C12N1/20GK103614312SQ201310432792
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】李向東, 王曉強, 畢濤 申請人:山東農業大學