芥末成分的環介導等溫擴增引物、試劑盒及其應用的制作方法

芥末成分的環介導等溫擴增引物、試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開芥末成分環介導等溫擴增（LAMP）引物、試劑盒及檢測方法，其堿基序列如SEQ?ID?NO.19～24；采用LAMP檢測技術，建立了適用于食品中芥末致敏原特異性檢測的方法，本發明所述方法操作簡單，不依賴昂貴儀器，檢測時間在1小時左右，方法靈敏度達到0.5%，檢測效率達到傳統PCR方法或熒光定量PCR方法，能夠應用于檢驗檢疫實際工作，尤其適用于大量樣品快速初篩和各種基層實驗室食品品質監控，適合作為行業推薦性標準應用推廣。
【專利說明】芥末成分的環介導等溫擴增引物、試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品檢驗技術方法領域，具體涉及一種芥末成分環介導等溫擴增(LAMP)引物、試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]食物過敏醫學上也稱變態反應，是指機體受抗原(包括半抗原)刺激后，產生相應的抗體或致敏淋巴細胞，當再次接觸同一種抗原后在體內引起體液或細胞免疫反應，由此導致組織損傷或機體生理機能障礙。它是一種復發率很高的疾病，引起變態反應的抗原被稱為變應原，又名致敏原。食品成分中存在的天然致敏原成分會引起6%至8%的兒童和2%的成人的過敏反應，嚴重的會危及生命。預包裝食品由于多是成分復雜的深加工產品，如果含有致敏原成分而又未能明確告之，就有可能引起過敏，危害消費者的健康安全。目前大約有160多種食品致敏原，芥末為常見的致敏原之一。2003年以來，歐盟、美國、香港等發達國家和地區相繼制定了預包裝食品致敏原標識要求的法規，并已于2005年起陸續發布和實施，對我國食品出口貿易造成了明顯影響。由于目前我國在食品致敏原成分檢測方法領域技術薄弱，隨著越來越多國家和地區對食品致敏原成分標識法規的全面實施，食品標簽的致敏原成分標識要求和符合性檢驗將會成為我國食品出口貿易的重要障礙。
[0003]芥(mustard)是十字花科(Cruciferae)數種草本植物的統稱,或指其辣味種子所制成的調味品。主要品種是:白芥(Sinapis alba，或黃芥)，原產于地中海地區；棕芥(Brassica juncea,或芥菜),原產于喜馬拉雅山區。
[0004]目前，致敏原成分檢測方法主要有酶聯免疫法、聚合酶鏈式反應法、色譜質譜法、表面等離子共振免疫法等。但是不同的方法的檢測限存在較大的區別，因此機構之間、國家之間應該采用一種檢測結果較為精確、重復性較好的標準方法。目前較多國家所認可的方法是酶聯免疫法。但是酶聯免疫法也受許多因素制約，如被測食品母體、檢測人員、試劑盒
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[0005]隨著分子生物學理論和技術的快速發展，以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為基礎的新型鑒定技術已日益得到廣泛應用。環介導等溫擴增法(LAMP, Loop-mediated IsothermalAmplification)是在PCR基礎上創建的一種較理想的手段，LAMP引物包括兩個外引物和兩個內引物，特異結合靶序列上的6個特異區域。內引物FIP包含Flc (與Fl區域互補)和F2序列，內引物BIP包含Blc (與BI區域互補)和B2序列，外引物為F3和/或B3序列，本發明在內外引物的基礎上引入環引物BLP，大大縮短了反應時間，具體LAMP的引物組成及對應區域信息見圖1。其特點是:①只需一恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性；②高特異性:采用六個區段，四條引物，擴增特異性高，可以根據是否擴增來判斷目標基因的存在與否；③快速、高效擴增:擴增在不到Ih即可完成，且產率高；④靈敏度高:擴增模板可達10拷貝或更少；⑤鑒定簡便:在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物-焦磷酸鎂沉淀，可用肉眼觀察判斷擴增與否；另外，它利用恒溫和低反應溫度(63°C )，減少細胞損傷，檢測人員實際操作非常簡便。總體而言，LAMP法是一種簡便、快速、高特異的基因擴增法，不需要特殊的試劑和儀器設備，采用該方法能建立起總成本低廉的檢測體系，在轉基因食品檢測、致敏原成份檢測等領域具有廣闊的應用前景。
[0006]本項目擬在前期研究的基礎上，將LAMP檢測技術應用于食品中過敏原成分芥末的檢測，針對芥末反轉錄酶RT基因，應用六條特異引物在恒溫的條件下、簡易的設備中，僅用一小時左右有效的完成篩查任務，結果判斷簡單，既能節省時間，又可大大降低檢測成本，適用于基層實驗室，可作為傳統PCR方法的有益補充。

【發明內容】

[0007]本發明的技術方案為:通過考察并鎖定芥末成分靶基因，然后設計合成4套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ ID N0.1~24 ;，優化體系，最后確定一套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ ID N0.19~24 ;進而確定了 LAMP方法的技術參數，最后驗證引物特異性、靈敏度、穩定性。
[0008]本發明的具體技術方案如下:本發明涉及一種檢測芥末成分的環介導等溫擴增引物，其堿基序列為SEQ ID N0.19~24，如下:
[0009]F3:cggcctttac taggaggt (SEQ ID N0.19)
[0010]B3:ttcgagaatc gagcaacg (SEQ ID N0.20)
[0011]FIP(Flc+F2):tcgacttagg catccttacg gattgagccg agggtcataa (SEQ IDN0.21)
[0012]BIP(Blc+B2):agataatatt ggccgagcac ccgtaataga actcacgatc cagg (SEQID N0.22)
[0013]FLP:ccagtattcg gactctcgg (SEQ ID N0.23)
[0014]BLP:aatacccttg ctacgtcaat gt (SEQ ID N0.24)
[0015]本發明的另一方面涉及一種芥末成分的環介導等溫擴增法檢測試劑盒，其中，檢測試劑盒包括檢測引物:SE Q ID N0.19~24。
[0016]優選的情況下:對于上述芥末成分的環介導等溫擴增法檢測試劑盒中，每25ul反應體系中包括:
[0017]SEQ ID NO:21 ~22 各 1.6yM，SEQ ID NO:19 ~20 各 0.2 y M，SEQ ID NO:23 ~24 各 0.8 ii M，20mM pH8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgS04, IOmM(NH4)2SO4,0.l%Tween20,IM 甜菜堿，1.6mM dNTP，8U Bst 大片斷 DNA 聚合酶，0.5 y I SYT0-9。
[0018]上述試劑盒在使用過程中，除了按上述反應體系加入上述試劑之外，還需要加入模板DNA和蒸餾水(補足25 ii L反應體系)，再進行LAMP擴增反應。
[0019]本發明的另一方面在于，公開一種利用上述芥末成分的環介導等溫擴增法檢測試劑盒，來檢測芥末成分的方法，其方法步驟包括:
[0020]①提取待測樣品的基因組DNA ;
[0021]②以步驟①提取的DNA作為模板，利用環介導等溫擴增法檢測:
[0022]每25 ii L 的 LAMP 反應體系包括:SEQ ID NO:21 ~22 各 1.6 y M，SEQ ID NO:19 ~20 各 0.2iiM，SEQ ID NO:23 ~24 各 0.8 y M，20mM pH8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgS04,10mM(NH4)2S04,0.l%Tween20，IM 甜菜堿，1.6mM dNTP，8U Bst 大片斷 DNA 聚合酶，0.5 y ISYTO-9, 2 ill DNA模板、蒸餾水:余量；
[0023]反應條件為:保溫階段為63°C 30s, I個循環；循環階段為63°C 15s，63°C 45s，45個循環。
[0024]③檢測結果以擴增曲線進行判斷。
[0025]本發明的另一方面在于，公開一種利用上述的環介導等溫擴增引物在檢測芥末成分方面的應用。
[0026]本發明的創新特征是:
[0027]本發明將LAMP檢測技術應用于對芥末內源特異基因檢測，針對芥末內源特異基因，應用特異引物在恒溫的條件下、簡易的設備中，僅用一小時左右有效的完成篩查任務，結果判斷簡單，既能節省時間，又可大大降低檢測成本，適用于基層實驗室，可作為傳統PCR方法的有益補充。
[0028](I)本研究針對芥末內源特異基因(RT gene for reverse transcriptase)設計了四套引物，從中篩選出一套出峰時間早，信號強的引物RT-4，將反應條件控制在63°C，45min進行檢測,成功建立了芥末成分的LAMP檢測方法；
[0029](2)進行了引物RT-4的靈敏度實驗，結果顯示該引物檢測限可達0.5% ；
[0030](3)進行了引物RT-4的引物特異性，結果顯示該引物特異性良好，對南美對蝦、瀨尿蝦、沙蝦、草蝦有檢出，均無非特異擴增；
[0031](4)進行了引物RT-4的穩定性實驗，結果顯示引物5%，1%及0.5%的穩定性均良好。
·[0032](5)進行了引物RT-4的實際樣品實驗，結果顯示引物對南美對蝦、蜢子蝦醬、熟蝦醬能檢出，但對芥末粉、芥末青豆、芥末沙拉汁、青芥辣、辣根可檢出，對芝麻沙拉汁、芝麻醬、香酥麻糖、牛肉芹菜水餃、豬肉芹菜水餃、不能檢出。性能參數等同于傳統PCR方法或熒光定量PCR方法，能夠應用于檢驗檢疫實際工作，尤其適用于大量樣品快速初篩和各種基層實驗室食品品質監控，適合作為行業標準應用推廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1:LAMP的引物組成及對應區域信息；
[0034]圖2 =RT-1弓丨物的LAMP反應結果
[0035]圖3:RT_2弓丨物的LAMP反應結果；
[0036]圖4:RT_3弓丨物的LAMP反應結果；
[0037]圖5:RT-4弓丨物的LAMP反應結果；
[0038]圖6: LAMP弓丨物RT-4的靈敏度；
[0039]圖7:RT-4引物特異性鑒定圖；
[0040]圖8:5%精密度實驗圖；
[0041]圖9:1%精密度實驗圖；
[0042]圖10:0.5%精密度實驗圖；
[0043]圖11:0%精密度實驗圖；
[0044]圖12:實際樣品檢測圖；【具體實施方式】
[0045]下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0046](I)LAMP 反應試劑:
[0047]Bst DNA 大片段聚合酶(Bst DNA polymerase large fragment), New EnglandBiolabs 公司；
[0048]甜菜堿(Betaine)、MgCl2,Sigma 公司；
[0049]dNTPs,寶生物工程(大連)有限公司；[0050](2) SYT0-9 突光染料，Invitrogen 公司；
[0051](3)LAMP引物(正向外引物F3、正向內引物FIP、反向內引物BIP、反向外引物B3、反向環引物BLP)，生工生物工程(上海)有限公司。
[0052](3)突光定量 PCR 儀，7500, Applied Biosystems ；
[0053](4)本發明所述的對照樣品以及LAMP反應體系中所使用的各種溶劑均由常規途徑制備或者商業途徑獲得。
[0054]實施例1
[0055](I)LAMP引物設計步驟如下:
[0056]①查閱芥末相關文獻，了解不同品系芥末中的特異基因，選取RT基因(AJ415649.1—Brassica nigra partial RT gene for reverse transcriptase fromgypsy-like retroelement13G42-26)為芥末特異基因；
[0057]②在NCBI網站中查找所挑選的基因序列；
[0058]③利用DNAMAN軟件對查到的各序列進行比對，比對結果表明RT基因具有一定的保守性；
[0059]①設計4套特異引物，即芥末LAMP引物RT-1，芥末LAMP弓丨物RT-2，芥末LAMP弓丨物RT-3，芥末LAMP引物RT-4，堿基序列如下:
[0060]芥末LAMP弓丨物RT-1
[0061]F3gcatgaattg ctcctagtct (SEQ ID N0.1)
[0062]B3cgtacctctt tccctcca (SEQ ID N0.2)
[0063]FIP(Flc+F2)gtggtggtgt tggagtctcg aatgatcaat gaggctccg (SEQ ID N0.3)
[0064]BIP(Blc+B2)cgtgagactc caacaacacc atcttcttcc tccacaggg (SEQ ID N0.4)
[0065]FLP gtgttggagt cgcatactca (SEQ ID N0.5)
[0066]BLP actgccacca gttgatctg (SEQ ID N0.6)
[0067]芥末LAMP 弓 I 物 RT-2
[0068]F3gtgagactcc aacaacacc (SEQ ID N0.7)
[0069]B3ccatatgcct agacaacaaa ac (SEQ ID N0.8)
[0070]FIP(Flc+F2)gcgtacctct ttccctccaa atctgccacc agttgatctg (SEQ IDN0.9)
[0071]BIP(Blc+B2)acgcagcctg agatcattac agtctatctc tagatggatg ctcc (SEQ IDN0.10)
[0072]FLP tcttcttcct ccacagggt (SEQ ID N0.11)[0073]BLP ttggtgtact tgggtgagc (SEQ ID N0.12)
[0074]芥末LAMP弓丨物RT-3
[0075]F3ttgagccgag ggtcataa (SEQ ID N0.13)
[0076]B3agttcagtat gacttcttcg tc (SEQ ID N0.14)
[0077]FIP(Flc+F2)agcaccctcg agaggatggt cccgagagtc cgaatac (SEQ ID N0.15)
[0078]BIP(Blc+B2)cccggtgtcg accaatacca acctcacaac gatctcct (SEQ ID N0.16)
[0079]FLP cgacttaggc atccttacgg SEQ ID N0.17)
[0080]BLP cgtcaatgtc ctggatcgt (SEQ ID N0.18)
[0081 ]芥末 LAMP 弓 I 物 RT-4
[0082]F3cggcctttac taggaggt (SEQ ID N0.19)
[0083]B3ttcgagaatc gagcaacg (SEQ ID N0.20)
[0084]FIP(Flc+F2)tcgacttagg catccttacg gattgagccg agggtcataa (SEQ IDN0.21)
[0085]BIP(Blc+B2)agataatatt ggccgagcac ccgtaataga actcacgatc cagg (SEQ IDN0.22)
[0086]FLP ccagtattcg gactctcgg (SEQ ID N0.23)
[0087]BLP aatacccttg ctacgtcaat gt (SEQ ID N0.24)
[0088](2 ) LAMP反應體系的建立
[0089]①精提DNA的實驗方法參考《分子克隆實驗指南第三版》(薩姆布魯克D.W拉塞爾著.科學出版社2002 [美]J.黃培堂等譯)。
[0090]精提DNA的濃度及純度的測定:
[0091]取5 μ L DNA溶液加ddH20梯度稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值。DNA的濃度按照以下公式計算獲得:
[0092]C=AXNX50/1000 式中:
[0093]C-DNA 濃度(μ g/ μ L)
[0094]A——260nm處的吸光值
[0095]N——核酸稀釋倍數
[0096]IOD260nm = 50 μ g/mL 雙鏈 DNA，當 0D26(l/0D28。比值在 L 7 ~L 9 之間時，適宜于 LAMP檢測。
[0097]②按照步驟①的方法制備芥末DNA (IOOng/ μ L)，并將其作為陽性模板，ddH20作為陰性對照，分別用各套引物(RT-l、RT-2、RT-3、RT-4)的內外引物進行LAMP反應，反應體系如下:
[0098]25 μ L的LAMP反應體系，其成分包括:FIP和BIP各1.6 μ M，F3和/或83各0.2 μ M，FLP 和 / 或 BLP 各 0.8μΜ，20πιΜ Tris-HCl (pH8.8), IOmM KCl,6mM MgS04, IOmM(NH4)2SO4,0.l%Tween20, IM 甜菜堿，1.6mM dNTP, 8U Bst 大片斷 DNA 聚合酶，0.5 μ 1SYT0-9, 2 μ I DNA模板。
[0099]具體操作時先在冰上準備LAMP反應混合液，擴增反應體系如下:12.5 μ L反應液RM，8 μ L超純水DW，I μ L引物PM，I μ L Bst酶，0.5 μ I SYT0-9以及2 μ L模板。將除模板外其他試劑配備成混合液混勻后，每管分裝23 μ L，再分別加入2 μ L模板DNA或陰陽性對照模板，參照熒光PCR儀使用說明書，設置反應程序為:保溫階段為63°C 30s，I個循環；循環階段為63°C 15s，63°C 45s，60個循環，于63°C 45s處收集熒光信號，根據出峰時間及陰陽性符合率初步篩選引物，結果如圖2~5所示:
[0100]設計的4套引物中，圖2中的RT-1引物約36miη出峰，圖3中的RT-2引物無擴增，圖4中的RT-3引物約13min出峰，圖5中的RT-4引物約Ilmin出峰，選擇出峰稍早的RT-4引物，初步將反應時間定在45min進行特異性和靈敏度等實驗。
[0101]實施例2RT-4引物靈敏度實驗
[0102]按照實施例1所述方法分別精提樣品芥末和芹菜(購自農貿市場)的DNA:
[0103]將芥末DNA用芹菜DNA分別稀釋到質量比為10%, 5%, 1%，0.5%, 0.1%，0.05%, 0.01%幾個梯度，每個稀釋度分別取2 μ I進行LAMP實驗，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以RT-4作為LAMP引物，進行LAMP擴增，參照熒光PCR儀使用說明書，設置反應程序為:保溫階段為63°C 30s，I個循環；循環階段為63°C 15s，63°C 45s，45個循環，于63°C 45s處收集熒光信號，以確定LAMP反應的靈敏度。
[0104]以確定LAMP反應的靈敏度，同時根據最低靈敏度出峰時間及假陽性最早出峰時間，確定反應時間。反應結果如下圖6所示:
[0105]從圖6中可以看出，將芥末DNA稀釋至不同濃度梯度，RT-4作為LAMP引物進行LAMP擴增，出峰時間和濃度梯度呈明顯梯度變化，檢測靈敏度可達0.5%，最低檢出限出峰時間約在19min，可以將反應時間確定在45min。
[0106]由于附圖中原彩色的曲線擴增圖，轉變為黑白色之后，無法明確指示各樣品的擴增情況，因此以文字描述其圖片內容，具體信息如下:
[0107]①模板為ddH20的陰性對照為平直的線，沒有擴增，說明本發明沒有假陰性結果；
[0108]②芥末DNA用芹菜DNA分別稀釋到質量比為0.1% (0.1ng/μ L), 0.05% (0.05ng/μ L)，的時候，為平直的線，沒有擴增峰出現，引物RT-4無法檢測。
[0109]③芥末DNA用芹菜DNA分別稀釋到質量比為5%(5ng/ μ L), 2%(2ng/ μ L), 1%( lng/μ L),0.5% (0.5ng/yL)幾個梯度時候，分別擴增出實線的峰，出峰時間和濃度梯度呈明顯梯度變化；證明引物RT-4能夠檢測模板為濃度為0.5%以上的(含DNA濃度為0.5ng/ μ L)，約19min出峰。
[0110]因此，確定LAMP引物RT-4的模板檢測靈敏度為0.5% (0.5ng/l.! L)。
[0111]實施例3 LAMP引物特異性實驗
[0112]按照實施例1所述方法分別精提下述樣品(購自農貿市場)的DNA:
[0113]芥末、西芹、芹菜、花生、黃大豆、黑蕓豆、黑芝麻、白芝麻、小麥、大米、熊貓豆、綠豆、黃蕓豆、玉米、紅蕓豆、白蕓豆、蕎麥仁、奶花蕓豆、亞麻籽、紅小豆、大白蕓豆、豌豆、紫花蕓豆、黑米、白豌豆、薏米仁、高粱、燕麥、擬南芥、小白菜、花椰菜、上海青、胡蘿卜、白蘿卜、韭菜、大白菜、油菜、奶白菜。
[0114]分別以精提的上述各樣品DNA (提取后，樣品DNA的濃度均為lOOng/μ L)作為LAMP反應的模板，用RT-4作·為LAMP引物，進行LAMP反應，其反應體系同實施例2，參照熒光PCR儀使用說明書，設置反應程序為:保溫階段為63°C 30s，I個循環；循環階段為63°C15s，63°C 458，45個循環，于631: 45s處收集熒光信號，驗證LAMP反應的特異性，利用熒光定量PCR儀觀察反應結果。[0115]圖7中由于附圖中原彩色的曲線擴增圖，轉變為黑白色之后，無法明確指示各樣品的擴增情況，因此以文字描述其圖片內容，具體信息如下:
[0116]①模板為ddH20的陰性對照為平直的線，沒有擴增，說明本發明沒有假陰性結果；
[0117]②芥末DNA檢測的時候，擴增出實線的峰，證明引物RT-4能夠檢測模板為芥末的樣品。
[0118]③西芹、芹菜、花生、黃大豆、黑蕓豆、黑芝麻、白芝麻、小麥、大米、熊貓豆、綠豆、黃蕓豆、玉米、紅蕓豆、白蕓豆、蕎麥仁、奶花蕓豆、亞麻籽、紅小豆、大白蕓豆、豌豆、紫花蕓豆、黑米、白豌豆、薏米仁、高粱、燕麥、擬南芥、小白菜、花椰菜、上海青、胡蘿卜、白蘿卜、韭菜、大白菜、油菜、奶白菜DNA樣品擴增曲線為平直的線，沒有擴增峰出現，引物RT-4無法檢測。
[0119]因此，確定LAMP引物RT-4只對芥末特異性檢出，特異性良好。用其繼續進行下述的精密度實驗。
[0120]實施例4精密度穩定性實驗
[0121](一)5%精密度實驗
[0122]將芥末DNA用芹菜DNA稀釋到5% (5ng/ μ L)作為模板，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以芥末DNA (IOOng/ μ L)作為陽性對照，以RT-4作為LAMP引物進行LAMP擴增，參照熒光PCR儀使用說明書，設置反應程序為:保溫階段為63°C 30s，I個循環；循環階段為63°C 15s，63°C 45s，45個循環，于63°C 45s處收集熒光信號，20個平行樣品觀察5%精密度LAMP反應的穩定性。20份平行樣品檢測結果如圖8:
[0123]圖8中由于附圖中原彩色的曲線擴增圖，轉變為黑白色之后，無法明確指示各樣品的擴增情況，因此以文字描述其圖片內容，具體信息如下:
[0124]①模板為ddH20的陰性對照為平直的線，沒有擴增，說明本發明沒有假陰性結果；
[0125]②將芥末DNA用芹菜DNA稀釋到5ng/ μ L作為模板，進行檢測的時候，20份樣品均擴增出實線的峰，證明引物RT-4能夠檢測模板為5ng/y L的芥末樣品。
[0126]上述結果顯示出5% (5ng/yL)精密度的穩定性良好。
[0127](二)1%精密度實驗
[0128]將芥末DNA用芹菜DNA稀釋到1% (Ing/ μ L)作為模板，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以芥末DNA (IOOng/ μ L)作為陽性對照，以RT-4作為LAMP引物進行LAMP擴增，參照熒光PCR儀使用說明書，設置反應程序為:保溫階段為63°C 30s，I個循環；循環階段為63°C 15s，63°C 45s，45個循環，于63°C 45s處收集熒光信號，20個平行樣品觀察1%精密度LAMP反應的穩定性。檢測結果如圖9:
[0129]圖9中由于附圖中原彩色的曲線擴增圖，轉變為黑白色之后，無法明確指示各樣品的擴增情況，因此以文字描述其圖片內容，具體信息如下:
[0130]①模板為ddH20的陰性對照為平直的線，沒有擴增，說明本發明沒有假陰性結果；[0131 ] ②將芥末DNA用芹菜DNA稀釋到Ing/ μ L作為模板，進行檢測的時候，20份樣品均擴增出實線的峰，證明引物RT-4能夠檢測模板為Ing/μ L的芥末樣品。
[0132]上述結果顯示出l%(lng/y L)精密度的穩定性良好。
[0133](三)0.5%精密度實驗
[0134]將芥末DNA用芹菜DNA稀釋到0.5% (0.5ng/ μ L)作為模板，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以芥末DNA (IOOng/ μ L)作為陽性對照，以RT-4作為LAMP引物進行LAMP擴增，參照熒光PCR儀使用說明書，設置反應程序為:保溫階段為63°C 30s，I個循環；循環階段為63°C 15s，63°C 45s，45個循環，于63°C 45s處收集熒光信號，20個平行樣品觀察
0.5%精密度LAMP反應的穩定性。
[0135]圖10中由于附圖中原彩色的曲線擴增圖，轉變為黑白色之后，無法明確指示各樣品的擴增情況，因此以文字描述其圖片內容，具體信息如下:
[0136]①模板為ddH20的陰性對照為平直的線，沒有擴增，說明本發明沒有假陰性結果；
[0137]②將芥末DNA用芹菜DNA稀釋到0.5%(0.5ng/ μ L)作為模板，進行檢測的時候，20份樣品均擴增出實線的峰，證明引物RT-4能夠檢測模板為0.5ng/yL的芥末樣品。
[0138]上述結果顯示出0.5% (0.5ng/ μ L)精密度的穩定性良好。
[0139](四)陰性精密度實驗
[0140]以ddH20代替D NA模板作為0%精密度和陰性對照模板，以芥末DNA (IOOng/ μ L)作為陽性對照，以RT-4作為LAMP引物進行LAMP擴增，參照熒光PCR儀使用說明書，設置反應程序為:保溫階段為63°C 30s，I個循環；循環階段為63°C 15s，63°C 45s，45個循環，于63°C 45s處收集熒光信號，20個平行樣品觀察0%精密度LAMP反應的穩定性。檢測結果如圖11:
[0141]圖11中由于附圖中原彩色的曲線擴增圖，轉變為黑白色之后，無法明確指示各樣品的擴增情況，因此以文字描述其圖片內容，具體信息如下:
[0142]①20份模板為ddH20的陰性樣品均為平直的線，沒有擴增，說明本發明沒有假陰性結果;
[0143]②將提取的芥末DNA (lOOng/μ L)作為陽性對照，進行檢測的時候，擴增出實線的峰，證明引物RT-4能夠檢測陽性的芥末樣品，引物有效。
[0144]上述結果顯示出0%精密度的穩定性良好。
[0145]實施例5實際樣品實驗
[0146]以熟蝦醬、蜢子蝦醬、芝麻沙拉汁、芥末沙拉汁、芝麻醬、香酥麻糖、芥末青豆、青芥辣、辣根、芥末粉、牛肉芹菜水餃、豬肉芹菜水餃的DNA作為模板，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以芥末DNA (IOOng/ μ L)作為陽性對照，以RT-4作為LAMP引物進行LAMP擴增，反應體系按照實施例2的方法進行，參照熒光PCR儀使用說明書，設置反應程序為:保溫階段為63°C 30s，I個循環；循環階段為63°C 15s，63°C 45s，45個循環，于63°C 45s處收集熒光信號，觀察實際樣品檢測情況。
[0147]圖12中由于附圖中原彩色的曲線擴增圖，轉變為黑白色之后，無法明確指示各樣品的擴增情況，因此以文字描述其圖片內容，具體信息如下:
[0148]①模板為ddH20的陰性樣品均為平直的線，沒有擴增，說明本發明沒有假陰性結果;
[0149]②將提取的芥末DNA (lOOng/μ L)作為陽性對照，進行檢測的時候，擴增出實線的峰，證明引物有效。
[0150]③將提取的IOOng/μ L樣品DNA (1:芥末粉，2:芥末青豆，3:芥末沙拉汁，4:青芥辣，5:辣根)作為模板，進行檢測的時候，擴增出實線的峰，引物RT-4對芥末粉、芥末青豆、芥末沙拉汁、青芥辣、辣根實際樣品有檢出，與實際結果相符。
[0151]④將提取的IOOng/μ L非芥末DNA (芝麻沙拉汁、芝麻醬、香酥麻糖、牛肉芹菜水餃、豬肉芹菜水餃、熟蝦醬、蜢子蝦醬)作為模板，進行檢測的時候，擴增出平滑的直線，無擴增曲線，證明引物RT-4對芝麻沙拉汁、芝麻醬、香酥麻糖、牛肉芹菜水餃、豬肉芹菜水餃、熟蝦醬、蜢子蝦醬實際樣品無檢出，與實際結果相符。
[0152]通過反復試驗，以上實驗數據顯示，本項目研制的芥末成分LAMP檢測方法(反應體系和反應條件如實施例2)，適用于芥末致敏原的檢測，定性檢測低限為0.5%，檢測的穩定性達到100%，靈敏度達到0.5%，特異性達到100%，均符合推廣應用的實際要求。能夠應用于實際工作，尤其 適用于大量樣品快速初篩和品質監控，適合作為行業推薦性標準應用推廣。
【權利要求】
1.一種檢測芥末成分的環介導等溫擴增引物，其特征在于，堿基序列為SEQ IDN0.19 ~24。
2.一種芥末成分的環介導等溫擴增法檢測試劑盒，其特征在于，包括檢測引物:SEQ IDN0.19 ~24。
3.根據權利要求2所述的芥末成分的環介導等溫擴增法檢測試劑盒，其特征在于，在檢測試劑盒中:
每 25 ii L 的 LAMP 反應體系包括:SEQ ID NO:21 ~22 各 1.6 y M，SEQ ID NO:19 ~20各 0.2iiM，SEQ ID NO:23 ~24 各 0.8iiM，20mM pH8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgS04,10mM(NH4)2S04,0.l%Tween20，IM 甜菜堿，1.6mM dNTP，8U Bst 大片斷 DNA 聚合酶，0.5 y ISYT0-9,2u I DNA 模板。
4.利用權利要求2所述試劑盒檢測芥末成分的方法，其特征在于，檢測步驟包括: ①提取待測樣品的基因組DNA； ②以步驟①提取的DNA作為模板，利用環介導等溫擴增法檢測:
每 25 ii L 的 LAMP 反應體系包括:SEQ ID NO:21 ~22 各 1.6 y M，SEQ ID NO:19 ~20各 0.2iiM，SEQ ID NO:23 ~24 各 0.8 y M，20mM pH8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgS04,10mM(NH4)2S04,0.l%Tween20，IM 甜菜堿，1.6mM dNTP，8U Bst 大片斷 DNA 聚合酶，0.5 y ISYT0-9, 2 ill DNA模板、蒸餾水:余量； 反應條件為:保溫階段為63°C 30s, I個循環；循環階段為63°C 15s，63°C 45s, 45個循環。
5.如權利要求1所述的環介導等溫擴增引物在檢測芥末成分方面的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103571944SQ201310437149
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年9月23日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】曹際娟, 徐君怡, 孫銘英, 曹冬梅 申請人:曹際娟, 徐君怡, 孫銘英, 曹冬梅