一種用于植物土壤鎘污染修復的基因及其編碼蛋白與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于植物土壤鎘污染修復的基因及其編碼蛋白與應用，其特征在于：該蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?No：2所示；核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示，本發明通過誘導或轉入植物中上述耐鎘蛋白編碼基因的表達以增強植物對鎘的耐受性，因此可以利用轉基因技術克隆重組有上述基因的植株種植在鎘污染的環境中以修復土壤環境。
【專利說明】一種用于植物土壤鎘污染修復的基因及其編碼蛋白與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程領域，具體地說一種用于植物土壤鎘污染修復的基因及其編碼蛋白與應用，特別涉及利用該基因增加植物對鎘毒害耐受及積累的方法。
【背景技術】
[0002]擬南芥作為一種模式植物，廣泛用于植物遺傳學、發育生物學和分子生物學等研究領域。擬南芥的大多數基因在其它植物中都能找到，有關擬南芥的任何發現都能應用于其它植物研究。因此，對擬南芥抗重金屬毒害分子生物學機制的研究對特定區域提高作物的產量和增加食品安全性具有重要的理論與經濟意義。擬南芥基因組已完全測序，根據擬南芥測序數據庫(WWW.arabidopsis.0rg)尋找和發現新的具有自主知識產權的功能基因是國際植物學研究領域的熱點之一，也是不同國家之間科技競爭的焦點。擬南芥共有約1.3億個堿基對，2.9萬個基因，其中大部分基因的功能還不清楚。
[0003]面對日益嚴重的重金屬污染尤其是土壤污染問題，尋找耐受重金屬的植物修復基因并闡明其功能具有重要的理論及實踐意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種新的植物編碼基因具有耐鎘及增加植物鎘吸收的新功能，該基因的過量表達可明顯增強轉基因植物對鎘的耐受性。本發明所提供的植物耐鎘及增加植物鎘吸收相關蛋白的編碼基因，命名為XCD2(AT5G04340)，來源于哥倫比亞野生型的擬南芥，其蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質:
[0005](I)序列表中的 SEQ ID No:2 ；
[0006](2)將序列表中SEQ ID No:2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐鎘相關的蛋白質。
[0007]序列表中的SEQ ID No:2由238個氨基酸殘基組成。
[0008]所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0009]所述植物耐鎘蛋白的編碼基因(X⑶2)也屬于本發明的保護范圍。
[0010]X⑶2基因，選自下述核甘酸序列之一；
[0011](I)序列表中 SEQ ID No:1 的 DNA 序列；
[0012](2)編碼序列表中SEQ ID No:2蛋白質序列的多核苷酸；
[0013](3)在嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No:1限定的DNA序列雜交的核甘酸序列；
[0014](4)與序列表中SEQ ID No:1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
[0015]序列表中的SEQ ID No:1由976個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5’端第70位至786位堿基，編碼序列SEQ ID NO:2的蛋白質。
[0016]含有本發明XCD2的表達載體、細胞系和宿主菌均屬于本發明的保護范圍。擴增XCD2中任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。
[0017]本發明的第二個目的是提供一種利用該基因提高植物耐鎘及將土壤中的鎘富集到植物中的方法達到修復土壤鎘污染的目的。
[0018]本發明所提供的提高植物耐鎘及增加植物中鎘含量的方法，該方法是將所述序列表SEQ ID No:1所示的植物耐鎘蛋白編碼基因轉入植物中。
[0019] 本發明提供一種土壤鎘污染修復方法，其特點在于，將序列表SEQ ID No:1所示的植物耐鎘蛋白編碼基因轉入植物中獲得轉基因植物，然后將所述轉基因植物種植于鎘污染土壤中，通過植物對鎘污染土壤中鎘元素的吸收進行土壤鎘污染修復。
[0020]誘導植物中的上述植物耐鎘相關蛋白編碼基因X⑶2的表達可通過植物轉基因技術的過量表達實現。本發明激活基因表達的方法并不限于此種方法，只要能激活XCD2基因表達均可。
[0021]利用任何一種可引導外源基因的在植物中表達帶有強啟動子的載體，將本發明所提供的XCD2轉入植物中，植物表現為耐鎘。
[0022]本發明利用正向遺傳學手段從化學誘導型激活標簽子系統構建的XVE突變體庫中篩選并通過表型鑒定得到功能獲得型耐鎘突變體xcd2 - D，通過Tai1-PCR技術獲得其基因序列，經上海生工測序并在NCBI數據庫中Blast比對，最后進行基因定位，獲得一個新的耐鎘基因X⑶2。通過轉基因技術，構建X⑶2基因的過量表達載體，導入根癌農桿菌GV3101菌株中，用花絮浸潰法進行擬南芥植株的遺傳轉化，并用抗生素篩選出3株轉化株，該轉基因植株在鎘脅迫下表現出明顯的耐鎘性狀。
[0023]本發明的XCD2基因或其反義核酸在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素，卡那霉素等)。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物或雙子葉植物，如水稻、小麥、油菜、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜宿等。攜帶有本發明XCD2基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導，農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物經組織培育成植株。
[0024]本發明X⑶2 (At5g04340)基因編碼一個乙炔型鋅指蛋白轉錄因子，誘導表達X⑶2基因后xcd2 - D突變體植株特異性對鎘耐受。在BSO處理下xcd2 — D突變體耐鎘性狀消失，說明該基因介導植株耐鎘是依賴于GSH途徑的。檢測xcd2突變體中其他耐鎘關鍵基因表達水平發現，GSHl基因表達量明顯增加，說明X⑶2基因可能激活GSHl基因表達參與植株抗鎘過程。在野生型植株中過量表達該基因，植株表現出對鎘耐受。敲除該基因，植株對鎘脅迫敏感。檢測xcd2 — D突變體植株鎘含量顯示，突變體大量積累鎘。因此，利用轉基因技術克隆并過量表達XCD2基因的植株不但可提高農作物類耐鎘生長，而且是土壤鎘污染修復的良好材料。
[0025]本發明的植物耐鎘相關蛋白及其編碼基可為農作物耐鎘育種及土壤鎘污染修復材料提供基因與技術的支持(保障)。
【專利附圖】
【附圖說明】[0026]圖1A-圖1C是突變體xcdl和野生型(WT，下同)植株對鎘耐受性比較(其中圖1A 1/2MS, l/2MS+10yM β -estradiol, 1/2MS+75 μ M CdCl2, 1/2MS+10 μ M-estradiol+75μ MCdCl2四種培養條件下表型；圖1B根長比較；圖1C鮮重比較)。
[0027]圖2Α-圖2D是X⑶2基因克隆(其中圖2Α是三輪PCR產物鑒定；圖2Β是T 一 DNA插入位點；圖2C是T 一 DNA插入位點附近基因表達RT-PCR檢測；圖2D是T 一 DNA插入位點附近基因表達qRT-PCR檢測)。
[0028]圖3A-圖3D是敲除X⑶2基因的突變體的鑒定(其中圖3A是分子水平鑒定；圖3B是對鎘的表型分析；圖3C是根長比較；圖3D是鮮重比較)
[0029]圖4A-圖4D是X⑶2基因的35S過量表達(其中圖4A是分子水平鑒定；圖4B是表型分析；圖4C是根長比較；圖4D是鮮重比較)。
[0030]圖5A-圖5B是X⑶2基因的表達導致植株體內的鎘含量變化(其中，圖5A是XCd2_D突變體與WT比較；圖5B是過量表達、敲除突變體與WT比較)
[0031]圖6A-圖 6D 是 xcd2 和 WT 在 1/2MS 和 10 μ M β -estradiol+75 μ M CdCl2 條件下相關基因的表達水平(圖中，圖6Α是AtH)R8基因；圖6B是AtATM3基因；圖6C是AtPCRl基因；圖6D是GSHl基因)。
[0032]下面結合實施例對本發明的技術方案作進一步的說明。
【具體實施方式】
[0033]下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規方法。
[0034]實施例1、X⑶2及其 編碼基因的獲得
[0035]利用化學誘導激活XVE(LexA-VP16-ER)突變體系統，從含有100 μ MCdCl2的1/2MS培養基中篩選到的擬南芥幼苗為材料，用經典的CTAB法提取的突變體基因組DNA為模板，進行如下 Tail-PCR 反應(Yao-Guang Liu et al.，1995):
[0036]Tail-PCR反應程序(共包括三輪反應，表1):
[0037]Primary PCR (20 μ I 反應體系)
[0038]
DNAdO-1OO ng/μ I)I μ I
10XPCR buffer2 μ I
2.5 mM dNTPs1.6 μ I
2 μ M LexA2 or LexA32 μ I
50 μ M AD primerI,2 μ I
Taq Polymerase (5 U/μ I)0.2 μ I
ddH20toμ I
[0039]Secondary PCR (20 μ I 反應體系)
[0040]DNA(1:50 dilution 1st product)I μ I
10XPCR buffer2 μ I
dNTPs (2.5 raM each)L 6 μ I
LexA3 or LexA4 (2 μ M)2 μ I
AD primer (50 μ Μ)0.8 μ I
Taq Polymerase (5 U/μ I)0.15 μ I
ddH20 to 20 μ I
[0041]Tertiary PCR (20 μ I 反應體系)
[0042]
DNA(1:50 dilution 2nd product)I μ I
[0043]
10XPCR buffer2 μ I
dNTPs (2.5 mM each)1.6 μ I
LexA4 or LexA5 (2 mM)2 μ I
AD primer (50 μ Μ)0.8 μ I
Taq Polymerase (5 U/ μ I)0.15 μ I
ddH20to 20 μ I
[0044]表1Tail-PCR的反應程序
[0045]
【權利要求】
1.一種植物耐鎘蛋白，其特征在于，所述蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質: (1)SEQID No: 2所示的序列; (2)將序列表中SEQID No:2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐鎘相關的蛋白質。
2.一種編碼權利要求1所述植物耐鎘蛋白的基因，其特征在于，所述基因選自下述核甘酸序列之一； (1)序列表中SEQID No:I的DNA序列； (2)編碼序列表中SEQID No:2蛋白質序列的多核苷酸； (3)在嚴謹條件下可與序列表中SEQID No:1限定的DNA序列雜交的核甘酸序列； (4)與序列表中SEQID No:1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列； 所述序列SEQ ID No:1的開放閱讀框架(ORF)為自5’端第70位至786位堿基，編碼序列SEQ ID NO:2的蛋白質。
3.根據權利要求1所述的一種植物耐鎘蛋白，其特征在于，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
4.含有權利要求2所述 基因的表達載體、細胞系和宿主菌。
5.一種提高植物耐鎘及增加植物中鎘含量的方法，其特征在于，所述方法是將所述序列表SEQ ID No:1所示的植物耐鎘蛋白編碼基因轉入植物中。
6.—種土壤鎘污染修復方法,其特征在于,將序列表SEQ ID No:1所不的植物耐鎘蛋白編碼基因轉入植物中獲得轉基因植物，然后將所述轉基因植物種植于鎘污染土壤中，通過植物對鎘污染土壤中鎘元素的吸收進行土壤鎘污染修復。
【文檔編號】C12N1/21GK103483438SQ201310446574
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月26日 優先權日:2013年9月26日
【發明者】曹樹青, 陽立波, 柏曉婭, 顧菊, 魚斌 申請人:合肥工業大學