一種快速鑒定甘薯莖腐病抗性的方法
【專利摘要】本發明涉及一種快速鑒定甘薯莖腐病抗性的方法，其包括以下操作步驟：將甘薯主莖或側枝修剪成帶有3～4片展葉的莖枝，室溫條件下預培養2～3天；待莖枝長出須根后，將莖枝平置，在莖枝中間位置且兩節之間，用移液器槍頭扎1個小洞且不穿透莖枝，然后將莖枝平置于鋪有浸透無菌水的濾紙的密閉塑料盒內，并將扎有小洞的一側朝上，吸取15～25μL1×108cfu/mL的莖腐病病原菌菌懸液，注入小洞內接種培養；培養20～24h后，觀察病害情況并對甘薯莖枝進行病害等級鑒定。本發明具有操作簡單快速、實用性強、可操作性強和鑒定結果重復性和可靠性較高優點，對于篩選甘薯抗莖腐病優質種質資源具有潛在的社會經濟意義。
【專利說明】一種快速鑒定甘薯莖腐病抗性的方法
【技術領域】[0001]本發明涉及對甘薯莖腐病的抗病性進行快速鑒定的方法，尤其是對甘薯抗莖腐病種質資源和育種材料的篩選方法，屬于植物保護【技術領域】。
【背景技術】
[0002]甘薯(Ipomoea batatas (L.)Lam)是世界糧食、能源和工業原料作物之一，我國是世界上最大的甘薯生產國家，其種植面積僅次于水稻、小麥和玉米而居第四位。近年隨著甘薯市場需求旺盛，農民種植和引進新品種的積極性增加，種苗或種薯在國家和地區間流動頻繁，加之無序種植，隨之而來在我國甘薯主產區出現了一些新病害或傳統病害重新爆發流行。
[0003]甘薯莖腐病首先在美國喬治亞州被發現，世界上其他國家均未見報道。2006年在我國廣東省東部地區甘薯產區首先發現此病害，為我國甘薯新病害。該病害傳播快，危害嚴重，已在廣東省的廣州、惠州、河源、湛江、增城、海豐、博羅、惠東等多個市縣爆發，病情逐年加重，可能已成為廣東省發病面積最大、危害最重的甘薯病害。發病嚴重的田塊，成眭的薯苗死亡，甚至全田的薯苗死亡，顆粒無收，嚴重影響甘薯的生產和薯農的利益。甘薯莖腐病的病原菌根據新的分類系統屬于D.dadantii，是我國三類檢疫性有害生物之一，該病菌以種薯或種苗傳帶為主要傳播方式。目前世界上尚無針對甘薯莖腐病的有效防治方法。
[0004]眾所周知，抗病品種的使用是最為經濟有效環保的防治方法，也是控制病害的最根本措施之一。在抗病品種的選育過程中，需要進行大量的抗病性鑒定試驗，而建立完善的病害抗性鑒定評價方法是進行此項研究的重要前提。因此，一種操作簡單、快速準確的接種鑒定方法是研究中不可或缺的。目前，植物病原細菌的接種方法較多，如剪葉法、浸(蘸)根法、針刺法、噴霧法、摩擦法、注射法、灌注土壤法等。這些方法因細菌病害和寄主不同，導致作用效果也不同。
[0005]甘薯莖腐病的研究首先在美國報道。Schaad (1977)等利用柯赫氏法則采用注射接種法對病原菌進行了驗證，確認了病原菌為菊歐文氏菌(Schaad N W，and Brenner D.A bacterial wilt and root rot of sweet potato caused by Erwinia chrysanthem1.Phytopathology, 1977，67:302-308)。Clark 等(1989)利用菊歐文氏菌懸液涂于薯塊切片表面進行接種，結果表明甘薯塊根接種病原菌6天或者更長時間后，品種間甘薯塊根抗性差異顯著；另外該接種方法與針剌接種甘薯莖枝的抗性反應無相關性(Clark，C A., Wilder-Ayersj J A., and Duarte, V.Resistance of Sweet potato to Bacterial Root and Stem Rot Caused by Erwinia chrysanthem1.Plant Disease, 1989，73:984-987)。在我國甘薯莖腐病屬于新病害，對此病害的研究較少，對甘薯莖腐病抗性方法的鑒定更是沒有。發明人嘗試用美國學者在甘薯莖腐病致病性鑒定所用的針剌法和薯塊切片接菌法以及已報道諸如剪葉法、噴霧法等幾種常用細菌病害接種方法，發現這些接種方法得到的致病甘薯的發病癥狀不穩定，接菌量很難保證一致，不適合用于甘薯莖腐病的大規模接種抗性鑒定。因此，建立一種操作簡單、發病迅速、效果穩定的接種鑒定方法對抗莖腐病甘薯種質資源和育種材料的篩選顯得尤為重要。
【發明內容】
[0006]針對甘薯莖腐病抗病育種的特點和現有甘薯莖腐病抗性接種鑒定技術的不足，本發明的目的在于提供一種快速、準確、可應用于大樣本量鑒定的甘薯莖腐病抗性鑒定方法。
[0007]為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下:
[0008]一種快速鑒定甘薯莖腐病抗性的方法，包括以下步驟:
[0009](I)莖枝的處理與預培養:取生長正常、整齊、無病蟲害的甘薯主莖或側枝，用無菌手術刀將甘薯主莖或側枝修剪成帶有3~4片展葉的莖枝，剪后用無菌水洗去剪口處流出的汁液；將已修剪清洗的莖枝放入滅菌廣口瓶中進行預培養，滅菌廣口瓶裝有占其體積 1/3的蒸餾水或無菌水，室溫條件下培養2~3天；
[0010](2)莖腐病病原菌菌懸液的制備:將甘薯莖腐病病原菌菌株H12接種于改良營養瓊脂培養基中，于28°C劃線培養40~48h后，用無菌水配成濃度為I X 108Cfu/mL的莖腐病病原菌菌懸液；
[0011](3)莖枝的接種培養:待莖枝長出須根后，將莖枝平置，在莖枝中間位置且兩節之間，用移液器的槍頭扎I個小洞且不穿透莖枝，然后將莖枝平置于鋪有浸透無菌水的濾紙的密閉塑料盒內，并且將扎有小洞的一側朝上，吸取15~25 步驟(2)制得的菌懸液，注入莖枝小洞內進行接種，以無菌水作為空白對照，接種后將塑料盒蓋好密封，置于30°C的光照培養箱內，培養20~24h;
[0012](4)病害癥狀觀察與等級鑒定:培養20~24h后，觀察病害情況，并對甘薯莖枝進行病害等級鑒定。
[0013]本發明的甘薯莖腐病病原菌菌株H12來源于廣東省甘薯莖腐病病樣(黃立飛，羅忠霞，房伯平，等.我國甘薯新病害莖腐病的研究初報.植物病理學報.2011，41 (I ):18-23.)。
[0014]優選的，步驟(1)中所述莖枝是從甘薯葉節下切斷，所述莖枝的長度為12~15cm。
[0015]優選的，所述步驟(2)中吸取20 步驟(2)制得的菌懸液，注入莖枝小洞內進行接種。
[0016]優選的，所述步驟(2)中莖枝接種后置于30°C的光照培養箱內，培養24h。
[0017]優選的，所述改良營養瓊脂培養基的組成包括蛋白胨5g/L，蔗糖10g/L，牛肉膏 3g/L，酵母浸膏lg/L和瓊脂15g/L，所述改良營養瓊脂培養基的pH值為7.0~7.2。
[0018]作為本發明的進一步技術方案，步驟(4)中將甘薯的發病程度分為I~5級，其中 1-無癥狀，健康；2_小洞出現黑色腐爛，但腐爛小于Icm ；3-腐爛大于等于Icm小于2cm，且腐爛沒有通過任何一個葉節；4_腐爛長度大于等于2cm小于3cm或者腐爛通過任何一個葉節；5_腐爛長度大于3cm或腐爛通過2個葉節；以甘薯的發病程度作為病害評價標準鑒定甘薯品種的抗病性，發病程度=5為高度感病品種,3 <發病程度< 5為感病品種；1 <發病程度< 3為抗病品種。
[0019]相比現有技術，本發明的有益效果在于:
[0020](I)實用性、可操作性強:本發明可以直接用于甘薯莖腐病抗病育種中抗性鑒定試驗和甘薯抗莖腐病種質資源的篩選；[0021](2)操作簡單快速:病原菌接種濃度均一，接種量一致，測定較為簡單，適合進行大樣本量的試驗；接種后甘薯顯癥時間短和鑒定時間短，接種病原細菌在20~24h后可見到顯著的病害癥狀，在3~5天內就可以完成整個接種鑒定過程，大大減輕了病害抗性鑒定的工作強度；
[0022](3)鑒定結果具有較好的重復性和可靠性。通過實施例證實，不同鑒定批次不同重復間的鑒定結果穩定，誤差較小。
[0023]綜上所述，本發明作為甘薯莖腐病抗性鑒定的新方法，在環境可控的條件下，通過甘薯莖枝將扎洞接種定量的病原菌，能夠快速有效地篩選甘薯抗病種質資源和育種材料， 提高甘薯莖腐病育種的效率；可以用于甘薯種質資源抗莖腐病的鑒定、甘薯抗莖腐病育種和分離病菌的致病性檢測等試驗，對于豐富甘薯病原細菌的接種方法具有積極意義；同時， 對于篩選甘薯抗莖腐病優質種質資源具有潛在的社會經濟意義。
【具體實施方式】
[0024]實驗材料:“國家廣州甘薯資源圃”保存的98份甘薯種質資源。
[0025]實驗方法:對“國家廣州甘薯資源圃”保存的98份甘薯種質資源(具體見表1)進行了甘薯莖腐病抗性鑒定，根據甘薯的發病程度，將這些甘薯種質資源分為高度感病品種、 感病品種、抗病品種。
[0026]實驗步驟:(I)莖枝的處理與預培養:從甘薯葉節下取生長正常、整齊、無病蟲害的甘薯主莖或側枝，用無菌手術刀將甘薯主莖或側枝修剪成帶有3~4片展葉的莖枝，莖枝的長度為12~15cm，剪后用清水洗去剪口處流出的汁液；將已修剪清洗的莖枝放入滅菌廣口瓶中進行預培養，滅菌廣口瓶裝有占其體積1/3的蒸餾水或無菌水，室溫條件下培養2~ 3天；
[0027](2)莖腐病病原菌菌懸液的制備:將甘薯莖腐病病原菌菌株H12接種于改良營養瓊脂培養基中，改良營養瓊脂培養基的組成包括蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L和瓊脂15g/L，pH 值為7.0~7.2，于28°C劃線培養48h后，用無菌水配成濃度為I X 108cfu/mL的莖腐病病原菌菌懸液；
[0028](3)莖枝的接種培養:待莖枝長出須根后，將莖枝平置，在莖枝中間位置且兩節之間，用移液器槍頭扎I個小洞且不能穿透莖枝，然后將莖枝平置于鋪有浸透`無菌水的濾紙的密閉塑料盒內，并且將扎有小洞的一側朝上，吸取20 y L步驟(2)制得的菌懸液，注入莖枝小洞內進行接種，以無菌水作為空白對照，接種后將塑料盒蓋好密封，置于30°C的光照培養箱內，培養24h ；
[0029](4)病害癥狀觀察與等級鑒定:培養24h后，觀察病害情況，并對甘薯莖枝進行病害等級鑒定。將甘薯的發病程度分為I~5級，其中I一無癥狀，健康；2—小洞出現黑色腐爛，但腐爛小于Icm ;3—腐爛大于等于Icm小于2cm，且腐爛沒有通過任何一個葉節；4一腐爛長度大于等于2cm小于3cm或者腐爛通過任何一個葉節；5—腐爛長度大于3cm或腐爛通過2個葉節；以甘薯的發病程度作為病害評價標準鑒定甘薯品種的抗病性，發病程度=5為高度感病品種，3 <發病程度< 5為感病品種；1 <發病程度< 3為抗病品種。
[0030]實驗結果與分析:本實施例對98份甘薯種質資源做了甘薯莖腐病的室內接種鑒定，具體抗性鑒定結果見表1，其中63份甘薯種質資源鑒定為高感，19份甘薯種質資源鑒定為中感，16份甘薯資源為抗病。為了保證研究結果的準確性，有必要對篩選到的抗性資源進一步田間鑒定觀察，通過田間鑒定結果發現，本發明的方法鑒定的結果與田間鑒定結果接近，兩者的誤差很小。
[0031]表1資源的具體抗病型鑒定結果
[0032]
【權利要求】
1.一種快速鑒定甘薯莖腐病抗性的方法，其特征在于包括以下步驟:(1)莖枝的處理與預培養:取生長正常、整齊、無病蟲害的甘薯主莖或側枝，用無菌手術刀將甘薯主莖或側枝修剪成帶有3~4片展葉的莖枝，剪后用無菌水洗去剪口處流出的汁液；將已修剪清洗的莖枝放入滅菌廣口瓶中進行預培養，滅菌廣口瓶裝有占其體積1/3的蒸餾水或無菌水，室溫條件下培養2~3天；(2)莖腐病病原菌菌懸液的制備:將甘薯莖腐病病原菌菌株H12接種于改良營養瓊脂培養基中，于28 1:劃線培養40~48 h后，用無菌水配成濃度為IXlO8 cfu/mL的莖腐病病原菌菌懸液；(3)莖枝的接種培養:待莖枝長出須根后，將莖枝平置，在莖枝中間位置且兩節之間，用移液器的槍頭扎I個小洞且不穿透莖枝，然后將莖枝平置于鋪有浸透無菌水的濾紙的密閉塑料盒內，并且將扎有小洞的一側朝上，吸取15~25 y L步驟(2)制得的菌懸液，注入莖枝小洞內進行接種，以無菌水作為空白對照，接種后將塑料盒蓋好密封，置于30 °C的光照培養箱內，培養20~24 h ；(4)病害癥狀觀察與等級鑒定:培養20~24h后，觀察病害情況，并對甘薯莖枝進行病害等級鑒定。
2.根據權利要求1所述的快速鑒定甘薯莖腐病抗性的方法，其特征在于:步驟(1)中所述莖枝是從甘薯葉節下切斷，所述莖枝的長度為12~15 cm。
3.根據權利要求1所述的快速鑒定甘薯莖腐病抗性的方法，其特征在于:所述步驟(2) 中吸取20 y L步驟(2)制得的菌懸液，注入莖枝小洞內進行接種。
4.根據權利要求1所述的快速鑒定甘薯莖腐病抗性的方法，其特征在于:所述步驟(2) 中莖枝接種后置于30 °C的光照培養箱內，培養24 ho
5.根據權利要求1所述的快速鑒定甘薯莖腐病抗性的方法，其特征在于:所述改良營養瓊脂培養基的組成包括蛋白胨5 g/L，蔗糖10 g/L，牛肉膏3 g/L，酵母浸膏lg/L和瓊脂 15 g/L，所述改良營養瓊脂培養基的pH值為7.0~7.2。
6.根據權利要求1所述的快速鑒定甘薯莖腐病抗性的方法，其特征在于:步驟(4)中將甘薯的發病程度分為I~5級，其中I一無癥狀，健康；2—小洞出現黑色腐爛，但腐爛小于I cm ;3—腐爛大于等于I cm小于2 cm，且腐爛沒有通過任何一個葉節；4一腐爛長度大于等于2 cm小于3 cm或者腐爛通過任何一個葉節；5—腐爛長度大于3 cm或腐爛通過2個葉節；以甘薯的發病程度作為病害評價標準鑒定甘薯品種的抗病性，發病程度=5為高度感病品種，3 <發病程度< 5為感病品種；1 <發病程度< 3為抗病品種。
【文檔編號】C12R1/645GK103555813SQ201310446213
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月26日 優先權日:2013年9月26日
【發明者】黃立飛, 房伯平, 陳景益, 張雄堅, 李育軍, 王章英, 羅忠霞, 黃實輝, 陳新亮 申請人:廣東省農業科學院作物研究所