一種胞外α-酮戊二酸產量提高的解脂亞洛酵母基因工程菌的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種胞外α-酮戊二酸產量提高的解脂亞洛酵母基因工程菌，屬于代謝工程領域。本發明從Yarrowia?lipolytica?CLIB122全基因組范圍內的6611條蛋白質編碼序列中篩選得到4條編碼轉運蛋白的基因，通過在解脂亞洛酵母（Y.lipolytica）WSH-Z06中分別過量表達這4個基因，獲得了細胞外α-酮戊二酸含量提高的重組菌。本發明通過過量表達這類基因增強了細胞將α-酮戊二酸轉運至細胞外能力，降低下游分離純化成本。
【專利說明】—種胞外α-酮戊二酸產量提高的解脂亞洛酵母基因工程菌
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種胞外α-酮戊二酸產量提高的解脂亞洛酵母基因工程菌，屬于代謝工程領域。
【背景技術】
[0002]α-酮戊二酸作為三羧酸循環(TCA)途徑中重要中間產物之一，在微生物細胞的代謝中起著重要的作用，不僅是三羧酸循環中的關鍵節點，在生物體內參與氨基酸、蛋白質、維生素的合成以及能量代謝；而且是微生物調控碳氮代謝平衡的重要節點，在研究與微生物氮代謝相關的調控機制方面具有重要作用。在工業上，α-酮戊二酸是重要的精細化工和醫藥工業的中間體，廣泛用于合成多種氨基酸、維生素和其它小分子物質，在醫藥、有機合成、營養強化劑等領域都有著重要的應用前景。
[0003] 由于α-酮戊二酸在微生物胞內代謝中的特殊地位，篩選得到的α-酮戊二酸生產菌株，在高產α-酮戊二酸的同時，在發酵終期仍然會積累大量丙酮酸等代謝副產物。α -酮戊二酸、丙酮酸等短鏈酮酸是弱電解質，在不同的pH條件下會以分子和陰離子兩種狀態存在。在發酵過程中，α-酮戊二酸多以解離的陰離子狀態存在。由于胞質中積累過量的羧酸陰離子會引起胞質的酸化而導致細胞代謝的中斷，陰離子形式存在的α -酮戊二酸只有借助羧酸轉運蛋白從胞質中被轉運至胞外。而在細胞缺乏碳源時，羧酸轉運蛋白又會將胞外的特定蛋白轉運到胞內作為碳源使用。類似的，其他中心代謝途徑相關的羧酸也存在類似的分泌和吸收過程。因此，細胞膜上特定羧酸轉運蛋白的動力學性質及其調控過程，對發酵液和胞內相應羧酸的積累具有決定性作用。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種胞外α -酮戊二酸產量提高的基因工程菌，是在解脂亞洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06中過量表達編碼酮酸轉運蛋白的基因。
[0005]所述基因的核苷酸序列如以下(I)或(2 )或(3 )或(4 )所示:
[0006](I)NCBI登錄號為YAL10B19470g的核苷酸序列，
[0007](2) NCBI登錄號為YAL10C21406g的核苷酸序列，
[0008](3) NCBI登錄號為YAL10D20108g的核苷酸序列，
[0009](4) NCBI登錄號為YAL10E32901g的核苷酸序列。
[0010]所述基因優選NCBI登錄號為YAL10B19470g的核苷酸序列，過量表達該基因的Y.lipolytica WSH-Z06的胞外α -酮戊二酸產量提高、丙酮酸含量下降。
[0011]所述解脂亞洛酵母Y.lipolytica WSH-Z06從中國典型培養物保藏中心獲得，菌種編號為 CCTCC NO:M20714o
[0012]所述基因工程菌的構建方法是:(1)構建表達目的基因所用的含有潮霉素磷酸轉移酶為篩選標記的整合型表達載體PO (hph) ；(2)構建重組整合型表達質粒:根據NCBI公開的序列，全化學合成目的酮酸轉運蛋白基因的開放閱讀框序列，并通過限制內切酶BamHI和Eco RI (或者Not I和Eco RI)同時切割獲得的開放閱讀框部分和整合型表達載體pO (hph),連接獲得重組表達質粒；(3)將所得重組整合型表達質粒轉化Y.lipolyticaWSH-Z06:利用電穿孔轉化方法將被限制性內切酶Avr II線性化的重組質粒轉化野生型Y.lipolyticaWSH_Z06,驗證篩選陽性轉化子。
[0013]以所述基因工程菌發酵生產α -酮戊二酸的方法，將所得重組基因工程菌接種至種子培養基中，28°C、200rpmin，培養16-18小時；按10%的接種量從種子培養基中接種到3-L發酵罐中，培養溫度為28°C、通氣量為1.5vvm，攪拌轉數為400rpm，培養144-168小時。[0014]與未過量表達酮酸轉運蛋白基因的對照菌相比:過量表達YAL10B19470g、YAL10C21406g、YAL10D20108g、YAL10E32901g基因的重組菌株的細胞外α -酮戊二酸含量從 16.6g.L-1 分別上升至 26.7,18.6,24.0 和 19.0g.L-1
[0015]本發明的有益之處:本發明通過篩選，首次獲得了 4條能夠提高Y.lipolytica細胞外α-酮戊二酸含量的酮酸轉運蛋白基因，通過過量表達這類基因能增強細胞將α-酮戊二酸轉運至細胞外能力，降低下游分離純化成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1酮酸誘導培養及酮酸轉運蛋白表達水平變化;Α:以丙酮酸或α -酮戊二酸為單一碳源處理野生細胞其細胞內丙酮酸(〇)和α -酮戊二酸(Λ )含量變化；Β:丙酮酸或α-酮戊二酸為單一碳源處理過程中轉運蛋白表達水平變化。
[0017]圖2酮酸轉運蛋白同源性分析
[0018]圖3重組Y.lipolytica驗證；A:轉運蛋白過量表達轉化子驗證圖，通道1:Y.lipolytica Tl,通道 2:Υ.lipolytica T2,通道 3:Υ.lipolytica T3,通道 4:Y.lipolytica T4,通道 5:Y.lipolytica T5,通道 6:Υ.lipolytica T6,通道 7:陰性對照；B:重組菌株中轉運蛋白表達水平變化。
[0019]圖4重組菌株細胞外酮酸含量
【具體實施方式】
[0020]材料與方法
[0021]YPD培養基(g.L-1):蛋白胨10，酵母浸膏5，葡萄糖10，固體培養基另加20g.L-1瓊脂。轉化子篩選時加入潮霉素B至終濃度為400mg.L'
[0022]YPK 培養基(g.L-1): α -酮戊二酸 100，Yeast Nitrogen Basel.7，(NH4) 2S045,用2mol.T1NaOH 調節 pH 至 5.0。
[0023]YPP 培養基(g.L-1):丙酮酸 50，Yeast Nitrogen Basel.7，(NH4)2S045,用2mol.T1NaOH 調節 pH 至 5.0。
[0024]種子培養基(g.I/1):葡萄糖 20，蛋白胨 10，MgSO4.7Η200.5，KH2PO4L O。用稀鹽酸調pH至5.5，115°C維持15min滅菌。固體斜面另添加20g.L-1瓊脂粉。
[0025]發酵培養基(g.I/1):甘油 100，(NH4)2S043，KH2P043，MgSO4.7Η201.2，NaCl0.5，K2HPO40.1，鹽酸硫胺素 2Χ10_7,ρΗ=4.5。115°C，滅菌 15min。接種前加入 121°C滅菌 30min的CaCO3至含量為20g.L-1。[0026]解脂亞洛酵母Y.lipolytica WSH-Z06從中國典型培養物保藏中心CCTCC獲得，菌種編號為 CCTCC NO:M20714o
[0027]酮酸含量測定:將發酵液在12000g離心5min后，取上清液，用超純水稀釋50倍，HPLC檢測。細胞內酮酸含量測定:離心收集細胞，用0.9%生理鹽水洗滌，用IOmL0.1mol.L-1KH2PO4-K2HPO4, Immol.L_1EDTA,0.01mmol.L-1DTT ρΗ7.5 緩沖液懸浮細胞，加入石英砂研磨5min, 13000 Xg離心IOmin,去除沉淀,取5ml上清液過0.22 μ m濾膜,用于HPLC分析。
[0028]HPLC 條件:Aminex HPX-87H ion exchange column ;流動相:5mmol.L-1 硫酸溶(550 μ L濃硫酸定容到2L)，用0.22 μ m孔徑的微濾膜抽濾并脫氣；柱溫:35°C ;進樣量:10 μ L ;流速:0.6mL.mirT1。紫外檢測器檢測:波長210nm。
[0029]Y.lipolytica轉化方法:將在YI3D培養基上新鮮長出的Y.lipolytica WSH-Z06單菌落轉接至液體YI3D培養基中，28°C，200rpm，過夜培養。按10%接種量轉接至新鮮的液體YI3D培養基中28°C，200rpm培養至OD6tltl=L 2左右，離心收集細胞，于30°C用8mL100mmol *L^1LiAc, 10mmol.L^1DTT, 0.6mol.T 廠1 sorb i to 110mmo I.L^1Tris-HCL, pH=7.5 緩沖液處理 8 X IO8細胞。離心收集細胞，用5mL預冷的Imol.L-1的sorbitol洗漆細胞三次，并用Imol.L—1的sorbitol懸浮細胞至101°細胞.mL'加入Iyg預先線性化的整合型載體至細胞懸浮液中，置于冰上溫孕5分鐘，將該混合物轉移至預冷的0.2cm電轉杯中，電擊，電擊條件為.2.5KV，25 μ F，200 Ω，立即加入ImL預冷的Imol.L^sorbitol,室溫靜置I小時，將0.2mL電擊產物涂布于含有400mg.L-1的潮霉素B的選擇平板中，28°C培養48-72小時。
[0030]實施例1酮酸轉運蛋白編碼基因的篩選及功能保守區域分析。
[0031]該篩選方法為:(I)從Uniprot 數據庫中獲得 Yarrowia lipolytica CLIB122全基因組范圍內的6611條蛋白質編碼序列；(2)利用TMHMM軟件對這些蛋白質序列進打跨膜蛋白質拓撲學分析和初步篩選，選擇預計跨膜螺旋氨基酸殘基數大于18和預計跨膜螺旋數大于I的蛋白質編碼序列為所有轉運蛋白庫，共計1104條蛋白質序列；(3)利用SignalP軟件從該1104條轉運蛋白庫中剔除117條被該軟件預測為信號肽的蛋白質；(4)利用blast軟件以來源于Saccharomyces cerevisiae單酮酸轉運蛋白(SACE0K00242g)和Kluyveromyces Iactis 二酮酸轉運蛋白(KLLA0F10043g)為參考序列從所有轉運蛋白庫中挑選得到同源性大于30%的蛋白序列，其中NCBI基因登陸號為YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10C21406g、YAL10D20108g、YAL10D24607g 和 YAL10E32901g 基因編碼的轉運蛋白與S.cerevisiae單酮酸轉運蛋白的相似度分別為:37%、40%、41%、42%、43%和39%。這些基因與K.1actis 二酮酸轉運蛋白編碼基因相似度分別為:46%、53%、49%、52%、51%和.51% ; (5)利用熒光定量PCR的方法在含有丙酮酸或α -酮戊二酸為唯一碳源的培養基(YPP或YPK)培養過程中對篩選得到的六條轉運蛋白轉運功能驗證。
[0032]篩選結果表明:以丙酮酸或α-酮戊二酸為單一碳源處理指數生長期的野生型細胞后，細胞內丙酮酸和α-酮戊二酸含量在處理Ih時達到最大含量，其中，在丙酮酸處理過程中，與在YPD培養中處理的對照菌株相比YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10C21406g、YAL10D20108g、YAL10D24607g和YAL10E32901g基因的表達量分別上調2.8倍、上調9.7倍、下調4.4倍、下調5.8倍、下調6.4倍和下調15.9倍；在α -酮戊二酸處理過程中，與對照菌株相比 YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10C21406g、YAL10D20108g、YAL10D24607g 和YAL10E32901g基因的表達量分別上調9.4倍、上調4.3倍、下調3.9倍、下調3.7倍、下調
2.5倍和下調1.6倍(圖1)。
[0033]通過ClustalX2軟件將所述酮酸轉運蛋白編碼基因篩選方法獲得的YAL10B19470g、 YAL10C15488g、 YAL10C21406g、 YAL10D20108g、 YAL10D24607g 和YAL10E32901g編碼蛋白與來源于其他10株真菌的21條酮酸轉運蛋白比對分析發現，所述27條轉運蛋白都包含酮酸轉運蛋白特有的NXX [S/T] HX [S/T] QDXXXT氨基酸殘基(圖2)，這一特征氨基酸殘基序列位于 YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10C21406g、YAL10D20108g、YAL10D24607g和YAL10E32901g編碼蛋白質的第7跨膜區域中。
[0034]實施例2重組Y.lipolytica菌株的構建及鑒定。
[0035]過量表達酮酸轉運蛋白基因的方法為:根據質粒PUB4-CRE中的潮霉素磷酸轉移酶的基因序列設計引物擴增該hph基因，利用限制性內切酶Stu I與Hind III同時處理擴增得到的hph基因和pO質粒，并連接兩酶切產物得到含有潮霉素轉移酶為篩選標記的整合性表達載體PO (hph)。
[0036]全化學合成基因:YAL10B19470g，YAL10C15488g,YAL10C21406g, YAL10D20108g,YAL10D24607g和YAL10E32901g的開放閱讀框，并通過限制內切酶Bam HI和Eco RI同時切割以及獲得的 YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10D20108g、YAL10D24607g 和YAL10E32901g編碼基因的開放閱讀框和帶有潮霉素抗性基因的整合型表達載體pO (hph)，通過連接上述開放閱讀框和載體，獲得pO (hph) -470、pO (hph) -488、pO (hph) -108、p0(hph)-607和p0(hph)-901表達載體，并利用限制內切酶Not I和Eco RI同時切割獲得的YAL10C21406g編碼基因的開放閱讀框和帶有潮霉素抗性基因的整合性表達載體pO (hph)，通過連接上述開放閱讀框和載體，獲得pO (hph) -406。
[0037]利用電穿孔轉化方法將被限制性內切酶Avr 11線性化的pO (hph) -470，pO (hph) -488, pO (hph) -406, pO (hph) -108, pO (hph) -607 和 pO (hph) -901 整合型的表達載體轉化野生型Y.lipolyticaffSH-Z06,在含有400mg.l-1潮霉素B的篩選平板上分別得到帶有6個整合型表達載體的轉化子，以驗證引物對VBF/V470、VBF/V488、VBF/V406、VBF/V607、VBF/V108和VBF/V901和轉化子基因組為模板進行驗證，并將驗證正確的過量表達 YAL10D20108g、YAL10C21406g、YAL10B19470g、YAL10C15488g、YAL10D24607g 和YAL10E32901g 的轉化子分別命名為 Y.lipolytica Tl、Y.lipolytica T2、Y.lipolyticaΤ3、Y.lipolytica Τ4、Y.lipolytica Τ5 和 Y.lipolytica T6。將對照菌株 Y.lipolyticaWSH-Z06與這六個重組菌株分別接種至YPD培養基中，在指數中期收集細胞，在mRNA水平上驗證這個6條基因表達水平分別是對照菌株的3.4倍、9.3倍、23.3倍、8.5倍、11.8和10.5倍(圖3)。
[0038]實施例3重組Y.lipolytica菌株酮酸轉運能力的鑒定。
[0039]將得到的6 個重組的 Y.lipolytica 菌株 Y.lipolytica Tl、Y.lipolytica T2、Y.lipolytica T3、Y.lipolytica Τ4、Υ.lipolytica T5 和 Y.lipolytica T6 接種至接種到種子培養基中，500mL搖瓶裝液50mL，溫度為28°C，轉速200rpmin，培養時間為16-18小時。按10%的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，28°C、200rpm條件下培養144-168小時，6個重組的Y.lipolytica菌株和對照菌相比:所述的Y.lipolytica TUY.lipolytica T2、Y.lipolytica T3和Y.lipolytica T6轉化子細胞外α -酮戍二酸含量從16.6g.L-1分別上升至 24.0,18.6,26.7 和 19.0g.L' 然而過量表達 YAL10C15488g 和 YAL10D24607g 基因后，所述的Y.lipolytica T4和Y.lipolytica T5細胞外α -酮戊二酸含量沒有發生明顯改變(圖4)。
[0040]Y.lipolytica Tl、Y.lipolytica T2、Y.lipolytica T4、Y.lipolytica T5 和Y.lipolytica T6細胞外丙酮酸含量從7.8g.L-1分別提高至13.5,11.0,10.2,11.0和
11.8g.L^1O所述的Y.lipolytica T3細胞外丙酮酸含量從7.8g.L—1下降至5.3g.L—1 (圖4)。
[0041]所述的Y.lipolytica T1>Y.lipolytica T2、Y.lipolytica Τ3、Υ.lipolytica T4、Y.lipolytica Τ5和Y.lipolytica T6細胞外α -酮戊二酸與丙酮酸比例從對照菌株的2.I變化至 1.8,1.7,5.0,1.6,1.5 和 1.6。
[0042]通過本發明中所述的方法篩選的到六條轉運蛋白基因其編碼的氨基酸序列中都包含決定酮酸轉運蛋白功能保守的氨基酸序列，細胞在轉運丙酮酸和α-酮戊二酸過程中，這六條轉運編碼基因具有相同的表達水平變化趨勢，暗示丙酮酸和α -酮戊二酸對這六條基因的具有相同的誘導調節功能或者這類蛋白具有相同的轉運功能，通過過量表達轉運蛋白編碼基因后，得到 Y.1ipoIyticaT3、Y.1ipoIyticaT4 和 Y.1ipoIyticaT6細胞外的丙酮酸和α-酮戊二酸含量同時提高，表明YAL10D20108g、YAL10C21406g和YAL10E32901g是多功能轉運蛋白能同時轉運這兩種酮酸；獲得的轉化子Y.lipolyticaT2和Y.lipolyticaT5其細胞外α -酮戊二酸含量變化不明顯，而丙酮酸含量顯著提高，表明YAL10C15488g和YAL10D24607g其編碼的轉運蛋白偏向于轉運丙酮酸，而Y.1ipolyticaTl其細胞外α-酮戊二酸含量提高明顯，丙酮酸含量下降，因此，YAL10B19470g基因是提高α-酮戊二酸生產過程中優選基因。
[0043]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1.一種胞外α-酮戊二酸產量提高的基因工程菌，其特征在于，是在解脂亞洛酵母(Yarrowia lipolytica) WSH-Z06中過量表達編碼酮酸轉運蛋白的基因。
2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述編碼酮酸轉運蛋白的基因的核苷酸序列如以下(I)或(2)或(3)或(4)所示: (1)NCBI登錄號為YAL10B19470g的核苷酸序列， (2)NCBI登錄號為YAL10C21406g的核苷酸序列， (3)NCBI登錄號為YAL10D20108g的核苷酸序列， (4)NCBI登錄號為YAL10E32901g的核苷酸序列。
3.構建權利要求2所述基因工程菌的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)構建表達目的基因所用的含有潮霉素磷酸轉移酶為篩選標記的整合型表達載體pO(hph)； (2)構建重組表達質粒:根據NCBI公開的序列，全化學合成目的酮酸轉運蛋白基因的開放閱讀框部分，并通過限制內切酶同時切割獲得的基因和整合型表達載體PO (hph)，連接酶切產物獲得重組表達質粒； (3)將所得重組質粒轉化Y.lipolytica WSH-Z06:利用電穿孔轉化方法將被線性化的重組質粒轉化野生型Y.lipolyticaWSH-Z06,進行驗證篩選陽性轉化子。
4.利用權利要求2所述基因工程菌發酵生產α-酮戊二酸的方法，其特征在于，將所得重組基因工程菌接種至種子培`養基中，28°C、200rpmin，培養16-18小時；按10%的接種量從種子培養基中接種到3L發酵罐中，溫度為28°C、通氣量為1.5vvm，攪拌轉數為400rpm，培養144-168 小時。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述種子培養基成分為:葡萄糖20g/L，蛋白胨 10g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，KH2PO41g/L, il pH 為 5.5。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基成分為:甘油100g/L，(NH4) 2S043g/L，KH2P043g/L，MgSO4.7Η201.2g/L，NaCl0.5g/L，K2HPO40.1 g/L,鹽酸硫胺素2X l(T7g/L，調 pH 為 5.0 后再加入 20g/L CaCO30
【文檔編號】C12N15/31GK103484391SQ201310481832
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月15日 優先權日:2013年10月15日
【發明者】陳堅, 郭洪偉, 周景文, 堵國成 申請人:江南大學