重組艾塞那肽的生產工藝的制作方法
【專利摘要】本發明公開重組艾塞那肽的生產工藝，包括構建工程菌的步驟、發酵表達工程菌的步驟和純化目的蛋白的步驟；其中，本發明還包括對Exendin-4進行酰胺化處理的步驟。本發明利用了pET-31b(+)本身的可以大規模，高產量的生產多肽的優點，保留了它的功能強大的啟動子，克服了目前其他生產工藝中該蛋白產物容易形成包涵體的缺點，利用了腸激酶的切割特性在目的蛋白的N末端進行切割，切割后的蛋白質完全是具有天然序列的Exendin-4。經過工程菌的發酵表達和目的蛋白的純化后得到重組艾塞那肽。產量可以達到500mg/升以上，比目前最先進的工藝產量提高了20倍，且均為可溶性蛋白。
【專利說明】重組艾塞那肽的生產工藝【技術領域】
[0001]本發明涉及生物多肽的合成【技術領域】，尤其涉及一種改進的重組艾塞那肽的生產工藝。
【背景技術】
[0002]糖尿病是繼心腦血管疾病、腫瘤之后的另一個嚴重危害人類健康的慢性非傳染性疾病，近年來，隨著人們生活方式的改變，糖尿病患病率呈急劇上升趨勢。目前我國糖尿病患者已逾7000萬，并且糖尿病患者增長率是歐美國家的2倍。2型糖尿病(Type 2Diabetes, T2DM)是糖尿病的主體，占糖尿病患者的90%左右。T2DM是由遺傳和多種環境因素相互作用而引起胰島索分泌或作用缺陷。其患病率較高，尤以中老年人為多，并呈現年輕化趨勢。胰島口細胞數目減少或分泌功能障礙是導致T2DM發病的中心環節。治療一般遵循生活方式干預(如飲食控制、運動治療等)、口服降糖藥和聯合使用胰島素等方式。傳統治療T2DM的藥物的副作用都較大，長期使用會因胰島素分泌過度導致胰島口細胞功能衰竭。[0003]近年來胰高血糖素樣肽I(GLPl)和enendin — 4成為糖尿病治療研究的熱點。因為它們具有在血糖濃度較高的情況下促進胰島素分泌的特性，而在血糖正常的情況下不發揮作用，不僅可使初治的2型糖尿病患者血糖恢復正常，而且對磺脲類藥物治療失效者也有降血糖作用。
[0004]Exendin-4是一條39個氨基酸組成的直鏈多肽，最初由南美巨蜥的唾液分離提取獲得。它的氨基酸殘基與哺乳動物GLP-1序列有53%的同源性，并且生物學效應也幾乎完全一致其與GLP-1的最大不同之處在于N端第2位的甘氨酸(Gly)耐血液中二肽基肽酶(DPP-1V)jGLP-1的相同位置則為極易被DPP-1V切斷的丙氨酸(Ala)，故Exendin-4被吸收入血后的半衰期較長(tl/2 E =9.7h )。Exendin-4是一種強效GLP-1受體激動劑，能模擬GLP-1這種內源性多肽的糖調控作用，降低空腹和餐后血糖。艾塞那肽(Exenatide)的活性主要通過與人體胰臟GLP-1受體結合而介導，由環腺苷酸(cAMP)依賴和β細胞分化機制引發葡萄糖依賴的胰島素合成和分泌。因為Exendin-4的氨基酸結構及生物活性與GLP-1均具有相關性，故通常也被視為腸促胰島素的一種。由于Exendin-4的降糖作用時間較長，延緩胃排空和抑制攝食沖動對肥胖病人體重的有益作用又有別于傳統的降糖藥物，因此其作為2型糖尿病治療藥物開發的潛力巨大。
[0005]目前對Exendin-4進行的藥物研究主要為制備工藝，作用機制，內分泌代謝病臨床，分子藥理學和藥劑學研究。已上市的Exendin-4藥物(Exenatide)采用的是多肽合成法的制備工藝。
[0006]化學合成成本高(對原料氨基酸及儀器設備要求極高)、產量少，而利用基因工程生產Exendin — 4，不僅可以實現工業化的大規模生產、有效地降低生產成本，而且對環境影響小，產品品質更安全。但用基因工程方法直接表達生產Exendin-4這樣的39肽，表達水平低，且容易降解，可采用與載體蛋白(如硫氧還蛋白等)連結融合表達的方法。但這種方法也存在融合蛋白分子中的目的多肽分子所占比例很小，產量很低，且融合蛋白裂解后多肽種類很多，分離純化困難的問題。行之有效的增加基因的表達產物的方法是構建基因串聯體，根據目標基因的特點和表達產物的特性，運用適當的分子生物學操作技術將目的基因按一定的方式串聯在一起，置于表達載體啟動子控制之下進行表達，再將表達的串聯體產物用特定的物質(酶或化學試劑)裂解，以獲得目標肽單體。比如pET-31b ( + )是一個常用的生產多肽的質粒，但是它用來生產多肽，當初設計是為了避免多肽容易被大腸桿菌體內的蛋白水解酶水解，所以讓目的多肽和KSI融合蛋白一起表達，形成了包涵體，這對生產Exendin-4來說是個很大的缺點，如果讓Exendin-4先生成包涵體再復性會造成純化成本的大大提高和活性的難以恢復，這已是重組艾塞那肽的產業化生產的瓶頸。
[0007]因此，現有技術還有待于改進和發展。
【發明內容】
[0008]鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供重組艾塞那肽的生產工藝，旨在解決現有重組艾塞那肽的生產工藝成本高、產量低的問題。
[0009]本發明的技術方案如下:
一種重組艾塞那肽的生產工藝，包括構建工程菌的步驟、發酵表達工程菌的步驟和純化目的蛋白的步驟；
其中，構建工程菌的步驟包括:
(1)重組Exendin— 4多肽基因序列的人工合成:根據大腸桿菌密碼子偏愛性，設計編碼Exendin — 4的核苷酸序列，改造為如SEQ ID N0.1所示的目的基因；
(2)MAG2010質粒:取pET31b(+)質粒，切割掉SEQID N0.2所示KSI融合基因片段，更換為SEQ ID N0.3所示的基因，刪除限制性內切酶AlwnI酶切位點和蛋氨酸和后繼序列，取代以腸激酶酶切位點和目的蛋白的基因，切割掉組氨酸標記序列，在GBl蛋白的前面添加組氨酸標記，在目的蛋白的羧基末端添加雙終止子；
(3)工程菌的構建:按照啟動子-6X組氨酸-GBl-tag-腸激酶的裂解位點-exedin-4-雙終止密碼子的順序得到的基因片段，利用CloneEZ試劑盒連接到已經切割好的MAG2010質粒中，得到重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4,將重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaC12 法轉化受菌體 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培養基中進行培養，收集菌體，篩選陽性克隆，作為重組Exendin-4融合表達的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays ；
要使生物合成Exendin-4能進行擴大規模的生產應用，關鍵之一是對發酵過程優化，最大可能的利用菌株Exendin-4高產能力，以最經濟的方式進行生產。
[0010]一般來說，生產可溶性蛋白時不能采用高密度發酵的方法，因為這樣容易形成包涵體，目前國內外利用的培養基大多為2XYT培養基或者LB培養基來進行培養，利用的大多是實驗室內研究型的搖瓶法培養。
[0011]發酵表達的步驟包括:
(1)挑單菌落到裝有30mL目標培養基中，3rc，200rpm活化過夜；
(2)將30mL菌液接到200mL 2XYT培養基中，32°C，200rpm培養約2.6 hr ；
(3)以10%的接 種量，接到5L MMBL培養基中，32°C，240rpm培養約3 hr ；
(4)接到60L發酵培養基中；(5)控制生長期pH為6.8 ;用攪拌速度及通氣量使DO ^ 10% ;待培養基中葡萄糖的濃度降至0.2g/L時開始補料；當0D550達到10左右時加入13mL IM IPTG誘導，終濃度為
0.2mM,把pH緩慢調至7.00,繼續培養10小時后結束；
純化目的蛋白的步驟采用離子交換層析-柱層析-三明治型的親和層析進行分離和純化；該工程菌經過發酵、純化得到的重組艾塞那肽的產量達到500毫克/升的產率；
其中，對Exendin-4進行酰胺化處理。
[0012]所述的重組艾塞那肽的生產工藝，其中，所述酰胺化處理包括:
將磁珠固定化的1.0mM的羧肽酶Y，或者1.0m的羧肽酶A溶于N-苯丙氨酸甲酯中，加入25毫升的氨水和0.4M的重組艾塞那肽，5mM的EDTA，反應體系總體積共計500毫升，在75°C下反應20個小時，8000rpm離心5分鐘，氨化后的重組艾塞那肽，用HPLC進行純化，用10%-100%甲醇或者乙腈溶液進行洗脫，收集樣品，所得樣品利用減壓蒸發除去有機溶劑，重溶于醋酸鹽緩沖液中，然后真空干燥得到白色粉末狀艾塞那肽，并于_20°C保存。
[0013]所述的重組艾塞那肽的生產工藝，其中，所述三明治型的親和層析包括親和層析一、酶裂解和親和層析二，具體步驟如下:
(1)親和層析一:采用GE公司的IgG-sepharose-fast flow column,首先用3個柱體積的50 mM Tris, pH 7.5,150 mM NaCI的緩沖液平衡柱子，然后用將用相同緩沖液透析過的蛋白質上柱，用I倍體積上述緩沖液洗然后用5mM乙酸鈉，pH5.0的緩沖液洗去未結合的雜質，接著用500mM乙酸鈉，pH5.0的緩沖液將目的蛋白洗脫下來，收集、濃縮，用足量的20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl，ρΗ7.6 透析 12 小時；
(2)腸激酶處理:1μ I的重組牛腸激酶輕鏈亞基在20°C，20mM Tris-HCl, IOOmM NaCl,pH7.6的條件下8h可以完全切割融合蛋白；
(3)親和層析二:將上述處理過的重組Exendin-4結合在鎳柱上,先用起始緩沖液沖洗脫磷酸鹽緩沖液，保留洗脫組分，濃縮，冷凍干燥，得到重組的艾塞那肽。
[0014]由于艾塞那肽是一個分子量比較小的多肽，并不適合用大分子蛋白的體系進行表達，所以我們采用專門用來改造后的生產多肽表達體系:pET-31b(+)質粒和E.Coli (DE3)PlyS進行生產，采用這個體系有以下優點:pET-31b(+)是一個生產多肽的質粒，目的多肽和KSI融合蛋白一起表達，形成了包涵體，可以避免生產的多肽被大腸桿菌體內的蛋白水解酶水解，但是這對生產Exendin-4來說是個很大的缺點，如果讓Exendin-4首先生成包涵體的形式然后再復性會造成純化成本的大大提高和活性的難以恢復，所以我們對pET-31b(+ )進行了改造，將pET-31b ( + )中的KSI融合蛋白序列完全刪除，同時刪除蛋氨酸裂解位點(ALWN切割位點)和C末端(多肽羧基端的)組氨酸標記(His6-tag)以及終止子，在刪除的位置，取代以蛋氨酸+ His6-tag+GBl突變序列+腸激酶裂解序列，我們將改造的pET-31b(+ )形成的新質粒重新命名為Mag2010,有了這個質粒,我們首先取得Exendin-4的原始序列，然后按照大腸桿菌對于遺傳密碼子的偏好進行了改造，采用適合大腸桿菌表達的遺傳序列，人工合成改造的Exendin-4的全序列，然后克隆島PUC57質粒中進行大規模擴增，將擴增后的Exendin-4序列切割并純化，然后克隆到改造好的Mag2010質粒中，并在C末端添加雙重終止子，這么做的好處是利用了 pET-31b(+)本身的可以大規模，高產量的生產多肽的優點，保留了它的功能強大的啟動子，克服了該質粒容易形成包涵體的缺點，利用了腸激酶的切割特性在目的蛋白的N末端進行切割，切割后的蛋白質完全是具有天然序列的Exendin-4。利用大腸桿菌E.Coli BL21 (DE3) PlyS表達體系的原因在于Exendin-4沒有需要糖基化修飾等翻譯后修飾，DNA轉錄時也不需要轉錄后修飾，所以特別適合用大腸桿菌體系進行生產，再加上我們克服了形成包涵體的問題，而E.Coli BL21(DE3)PlyS的優點在于可以大量表達外源蛋白，而且耐外源蛋白等毒素的干擾。
[0015]本發明通過連接GBl標記融合蛋白將艾塞那肽有90%的形成包涵體的可能性變成了 90%的形成可溶性蛋白。實驗證明，絕大部分重組產生的艾塞那肽都處于可溶蛋白中。
[0016]在國內外進行的艾塞那肽表達的體系中，很多人采用了 His6_Thioredoxin A(TrxA)融合蛋白和Exendin-4進行融合表達，融合蛋白分子量為14.7+4.2=18.9kd,exendin在融合蛋白中的比率為4.2/18.9=22.2%.我們采用了自身分子量較小的GBl和Exendin-4進行融合表達,融合蛋白分子量為14.7+4.2=18.9kd, exendin在融合蛋白中的比率為4.2/11.9=35.3%。也就是說，Exendin-4在融合蛋白中的比重大大增加了，在類似的體系下，假如表達的融合蛋白總量相等，那么exendin-4在我們的體系中產量是其他體系的1.59倍。
[0017]本發明采用GBl和His-tag雙標記的體系使得在純化過程中既可以采用鎳柱親和層析，又可以采用GBl親和層析，相對于其他的純化方法，可以有更多的純化選擇方式。
[0018]在現有的文獻報道中，產量很低，最多的也就是28毫克/升的產量，利用本發明的發酵體系，我們可以達到500毫克/升的產率，這個產量為目前發酵工藝的20倍左右，所以規模化生產后可以大大降低成本。對于艾塞那肽類的藥物成本價格降低和藥物的普及有著難以估量的意義，就像重組人胰島素開發成功后對于胰島素的普及那樣有著重要的社會價值和經濟價值。
[0019]本發明的生產工藝相對于目前的工藝有著顯著的特點:產量可以達到500mg/升以上，比目前最先進的工藝產量提高了 20倍，且均為可溶性蛋白，在生產過程中，我們采用了本公司獨特具有自主知識產權的的發酵工藝，產量大大提高，我們采用的雙重親和純化工藝，配合傳統的純化方法，純化效率有了極大的提高，前期粗提取的純化，減輕了后繼純化的壓力，降低了純化的成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為發酵過程中細菌生長曲線圖。
[0021]圖2為發酵過程參數監測結果圖。
[0022]圖3為質粒的穩定性分析結果圖。
[0023]圖4為質粒的細胞內含量圖。
[0024]圖5為活性細胞的檢測結果圖。
[0025]圖6為聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
【具體實施方式】[0026]本發明提供重組艾塞那肽的生產工藝，為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0027]本發明所提供的重組艾塞那肽的生產工藝，其主要包括構建工程菌的步驟、發酵表達工程菌的步驟和純化目的蛋白的步驟；下面對各步驟進行詳細說明。
[0028]一、工程菌的構建
(1)重組Exendin — 4多肽基因序列的人工合成:根據大腸桿菌密碼子偏愛性，設計編碼Exendin — 4的核苷酸序列，改造為如SEQ ID N0.1所示的目的基因；合成后的基因克隆進質粒HJC57中，轉化進大腸桿菌DH5 a中進行擴增,然后用EZ Bioresearch公司的質粒提取試劑盒進行純化，切割后的目的基因出純化備用。
[0029](2)MAG2010 質粒:MAG2010 質粒:取 pET31b(+)質粒，切割掉 SEQ ID N0.2 所示KSI融合基因片段，更換為SEQ ID N0.3所示的基因，刪除限制性內切酶AlwnI酶切位點和蛋氨酸和后繼序列，取代以腸激酶酶切位點和目的蛋白的基因，切割掉組氨酸標記序列，在GBl蛋白的前面添加組氨酸標記，在目的蛋白的羧基末端添加雙終止子；構建的質粒順序為:蛋氨酸編碼序列+6XHis_tag編碼序列+ GB-1編碼序列+腸激酶酶切位點編碼序列+和目的蛋白的基因+甘氨酸編碼+雙終止子。
[0030](3)工程菌的構建:按照啟動子-6X組氨酸-GBl-tag-腸激酶的裂解位點-exedin-4-雙終止密碼子的順序得到的基因片段，利用CloneEZ試劑盒連接到已經切割好的MAG2010質粒中，得到重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4,將重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaC12 法轉化受菌體 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培養基中進行培養，收集菌體，篩選陽性克隆，作為重組Exendin-4融合表達的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays。
[0031]亞克隆所用的質粒購自美國Novagen公司，大腸桿菌DH5 a和BL21 (DE3)PlyS分別購自北京索萊寶生物科技有限公司公司和紅葉生物科技有限公司，所用的限制性內切酶購自大連寶生物(Takara)，腸激酶購自美國西格瑪公司(Sigma),質粒提取試劑盒采用本公司銷售的美國EZ Bioresearch小量質粒提取試劑盒。
[0032]本發明所采用的pET31b(+)質粒，其本身為一個生產帶有包涵體的低分子肽的質粒，即其用來生產不溶性的包涵體的質粒，而是用來生產可溶性蛋白的質粒，所以需對該質粒進行改造，徹底去除原來容易生成包涵體的可溶性蛋白標簽KSI，并且切除了該質粒最具特征的AWNI內切酶位點，替代以His-tag+GBl蛋白標簽，從而使一個完全生產不可溶的包涵體的質粒變成了一個專門用來生產可溶性融合蛋白的新的質粒。本發明通過連接GBl標記融合蛋白將艾塞那肽有90%的形成包涵體的可能性變成了 90%的形成可溶性蛋白。實驗證明，絕大部分重組產生的艾塞那肽都處于可溶蛋白中。
[0033]二、工程菌的發酵表達
1、種子活化:
(I)種子活化:取凍存的工程菌劃線在含lOOul/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養16小時。挑選生長良好的單菌落，接種于20ml LB培養液中(含AmplOOul/ml )，37°C培養過夜。
[0034](2)種子液制備:取活化種子，按5%接種量接種于200ml 2XYT培養液中(含Amp100ul/ml)，37°C培養 6 小時。
[0035](3) 5L發酵罐發酵:將種子液按5%接種量接種于裝有MMBL培養基的發酵罐中，370C，控制pH在7.0左右，通過通氣及轉速控制溶氧在30%。0D600為20左右時，加入IPTG至終濃度為0.2mM，誘導10小時后下罐。離心，收集菌體。[0036]2、培養基配方
(1)LB液體培養基(一級搖瓶)
【權利要求】
1.一種重組艾塞那肽的生產工藝，包括構建工程菌的步驟、發酵表達工程菌的步驟和純化目的蛋白的步驟； 其中，構建工程菌的步驟包括: (1)重組Exendin— 4多肽基因序列的人工合成:根據大腸桿菌密碼子偏愛性，設計編碼Exendin — 4的核苷酸序列，改造為如SEQ ID N0.1所示的目的基因； (2)MAG2010質粒:取pET31b(+)質粒，切割掉SEQID N0.2所示KSI融合基因片段，更換為SEQ ID N0.3所示的基因，刪除限制性內切酶AlwnI酶切位點和蛋氨酸和后繼序列，取代以腸激酶酶切位點和目的蛋白的基因，切割掉組氨酸標記序列，在GBl蛋白的前面添加組氨酸標記，在目的蛋白的羧基末端添加雙終止子； (3)工程菌的構建:按照啟動子-6X組氨酸-GBl-tag-腸激酶的裂解位點-exedin-4-雙終止密碼子的順序得到的基因片段，利用CloneEZ試劑盒連接到已經切割好的MAG2010質粒中，得到重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4,將重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaCl2 法轉化受菌體 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培養基中進行培養，收集菌體，篩選陽性克隆，作為重組Exendin-4融合表達的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays ； 發酵表達的步驟包括: (1)挑單菌落到裝有30mL目標培養基中，3rC，200rpm活化過夜； (2)將30mL菌液接到200mL 2XYT培養基中，32°C，200rpm培養約2.6 hr ； (3)以10%的接種量，接到5L MMBL培養基中，32°C，240rpm培養約3 hr ； (4)接到60L發酵培養基中； (5)控制生長期pH為6.8 ;用攪拌速度及通氣量使DO ^ 10% ;待培養基中葡萄糖的濃度降至0.2g/L時開始補料；當0D550達到10左右時加入13 mL IM IPTG誘導，終濃度為0.2mM,把pH緩慢調至7.00,繼續培養10小時后結束； 純化目的蛋白的步驟采用離子交換層析-柱層析-三明治型的親和層析進行分離和純化；該工程菌經過發酵、純化得到的重組艾塞那肽的產量達到500毫克/升的產率； 其特征在于，對Exendin-4進行酰胺化處理。
2.根據權利要求1所述的重組艾塞那肽的生產工藝，其特征在于，所述酰胺化處理包括: 將磁珠固定化的1.0mM的羧肽酶Y，或者1.0m的羧肽酶A溶于N-苯丙氨酸甲酯中，加入25毫升的氨水和0.4M的重組艾塞那肽，5mM的EDTA，反應體系總體積共計500毫升，在75°C下反應20個小時，8000rpm離心5分鐘，氨化后的重組艾塞那肽，用HPLC進行純化，用10%-100%甲醇或者乙腈溶液進行洗脫，收集樣品，所得樣品利用減壓蒸發除去有機溶劑，重溶于醋酸鹽緩沖液中，然后真空干燥得到白色粉末狀艾塞那肽，并于_20°C保存。
3.根據權利要求1所述的重組艾塞那肽的生產工藝，其特征在于，所述三明治型的親和層析包括親和層析一、酶裂解和親和層析二，具體步驟如下: (I)親和層析一:采用GE公司的IgG- sepharose-fast flow column,首先用3個柱體積的50 mM Tris, pH 7.5,150 mM NaCI的緩沖液平衡柱子，然后用將用相同緩沖液透析過的蛋白質上柱，用I倍體積上述緩沖液洗然后用5mM乙酸鈉，pH5.0的緩沖液洗去未結合的雜質，接著用500mM乙酸鈉，pH5.0的緩沖液將目的蛋白洗脫下來，收集、濃縮，用足量的20mM Tris-HCl，100mM NaCl，ρΗ7.6 透析 12 小時； (2)腸激酶處理:1μ l的重組牛腸激酶輕鏈亞基在20°C，20mM Tris-HCl，100mM NaCl,pH7.6的條件下8h可以完全切割融合蛋白； (3)親和層析二:將上述處理過的重組Exendin-4結合在鎳柱上,先用起始緩沖液沖洗脫磷酸鹽緩沖液，保留洗脫組分，濃縮，冷凍干燥，得到重組的艾塞那肽。
【文檔編號】C12P21/02GK103911388SQ201310483648
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年10月16日 優先權日:2013年10月16日
【發明者】李相魯, 張嚴冬, 孟建軍 申請人:東莞麥亙生物科技有限公司