一種下調微小rna-126表達的方法
【專利摘要】本發明公開了一種下調微小RNA-126表達的方法，它明利用分子生物學技術，在含CMV啟動子的真核載體基礎上，構建含miR-126-sponge的真核表達載體，實現下調miR-126的表達；并通過將該載體體外轉染真核細胞后，利用熒光定量PCR儀檢測miR-126成熟體的表達，同時通過體外實驗觀察下調miR-126表達后的生物學效應。這樣的方法不僅可以方便、快速、長效地下調miR-126的表達，同時還可快捷地觀察miR-126下調表達后的生物學效應。不僅適于細胞的轉染，也可用于整體水平轉基因動物的制作。
【專利說明】—種下調微小RNA-126表達的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生命科學領域，尤其是一種下調微小RNA-126表達的方法。
【背景技術】
[0002]微小RNA-126 (microRNA-126，miR-126)具有重要的生物學作用。目前，改變miR-126的表達，從而研究其生物學功能的技術主要有慢病毒載體表達的miR-126海綿體(Sponge)、反義核酸(Antisense oligonucleotides, AS0)、抑制劑(Inhibitor)和Antagomir等。然而,這些方法存在作用時間短、穩定性差、構建復雜、儀器條件要求高且技術操作復雜的不足，難以達到方便、簡單而有效地下調miR-126表達的效果。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是:提供一種下調微小RNA-126表達的方法，它方法設計簡單，操作容易，能簡單而有效地下調miR-126表達的效果，以克服現有技術的不足。
本發明是這樣實現的:下調微小RNA-126表達的方法，在含CMV啟動子的真核載體上構建革El向miR-126的真核表達載體pEGFP-C2-miR-126_sponge,以下調miR-126在真核細胞中的表達；并將該載體體外轉染真核細胞后，利用熒光定量PCR儀檢測miR-126成熟體的表達，同時通過體外實驗觀察下調miR-126表達后的生物學效應。
所述的pEGFP-C2-miR-126_sponge的構建，具體是,利用軟件完成miR-126-sponge的序列設計；再用Hind III/KpnI雙酶切骨架載體pEGFP_C2、目的片段miR-126-sponge，回收片段純化，在16°C的條件下過夜連接；連接后轉化，挑取6個菌落，接種到含lOμg/ml卡那霉素的LB培養基中，12小時后提取菌液和質粒小抽法抽提質粒，并通過引物實現目的片段的PCR擴增，擴增目的片的引物序列為:上游，5 ’ -ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3 ’ ；下游，5’ -GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC-3’ ；重組質粒經Hind III和KpnI雙酶切后，成功構建重組質粒 pEGFP-C2-miR-126_sponge。
由于采用了上述技術方案，與現有技術相比，本發明利用分子生物學技術，在含CMV啟動子的真核載體基礎上，構建含miR-126-sponge的真核表達載體,實現下調miR-126的表達；并通過將該載體體外轉染真核細胞后，利用熒光定量PCR儀檢測miR-126成熟體的表達，同時通過體外實驗觀察下調miR-126表達后的生物學效應。這樣的方法不僅可以方便、快速、長效地下調miR-126的表達，同時還可快捷地觀察miR-126下調表達后的生物學效應。不僅適于細胞的轉染，也可用于整體水平轉基因動物的制作。
【專利附圖】
【附圖說明】:
圖1為本發明的實施例的miR-126-sponge序列的設計原理圖；
圖2為本發明的實施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表達載體構建示意圖；圖中:MCS,多克隆位點(Multiple clone sites) ;SV40，猴空泡病毒 40 (Simianvirus 40) ;EGFP,增強型綠色突光蛋白(Enhanced green fluorescent protein) ；Kanr,卡那霉素抗性(Kanamycin resistance) ;HSV,單純皰疫病毒(Herpes simplex virus )；Puc Ori,復制起始位點(origin of replicat1n) ; Pcmv,人巨細胞病毒啟動子(Humancytomegalovirus promoter)；
圖3為本發明的實施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表達載體構建過程中的克隆菌液PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳；
圖3中，1-6代表小量抽提的重組質粒，M代表電泳marker ；
圖4為本發明的實施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表達載體構建過程中的重組質粒PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳；
圖4中，1-6代表小量抽提的重組質粒，M代表電泳marker。
圖5為本發明的實施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表達載體構建過程中的重組質粒雙酶切；
圖5中，I為未酶切重組質粒，2為HindIII和KpnI雙酶切重組質粒，M代表電泳marker ；
圖6為本發明的實施例的pEGFP-C2-mi R-126-sponge真核表達載體構建過程中的重組質粒測序結果；
圖7為本發明的實施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表達載體轉染真核細胞后，miR-126表達水平檢測；
圖8為本發明的實施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表達載體轉染真核細胞后，miR-126生物學效應的光鏡檢測；
圖9為本發明的實施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表達載體轉染真核細胞后，miR-126生物學效應的MTT實驗檢測。
【具體實施方式】:
本發明的實施例:下調微小RNA-126表達的方法，
1)首先在miRBase數據庫中檢索出hsaniR-126的序列,miR-126正義序列:5’_CATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3’ ；miR-126 反義序列:5’ -CGCATTATTACTCACGGTACGAGTTTGA AGTGTCACAGCGCGTACCAAAAGTAATAATG-3’，將 miR-126反義序列中 CTCA 轉換成 GGT ；GTTT 突變成 CGCG，截取 5，-CGCATTATTAGGTCGGTACGACGCG-3，，把6個這樣的相同片段串聯起來，最終miR-126-sponge序列為5’-CGCATTATTAGGTCGGTACGACGCGCGCA TTATTAGGTCGGTACGACGCGCGCATTATTAGGTCGGTACGACGCGCGCATTATTAGGTCGGTACGACGCGCGCATTATTAGGTCGGTACGACGCGCGCATTATTAGGTCGGTACGA-3’，最后在 5’端加上 Hind III 酶切位點，3’端加上KpnI酶切位點，miR-126-sponge序列設計完成,如圖1所示；
2)用HindIII /KpnI雙酶切骨架載體pEGFP_C2、目的片段miR-126-sponge，回收片段純化，16 0C過夜連接，連接后轉化，挑取6個菌落，接種到含10 μ g/ml卡那霉素的LB培養基中；12小時后提取菌液和質粒小抽法抽提質粒，利用PCR實驗，通過引物成功擴增目的片段(圖3、4)，引物序列:上游，5’ -ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’ ；下游，5’ -GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC-3’ ；
3)重組質粒經HindIII和KpnI雙酶切后，電泳鑒定，并測序(圖4、5)，測序結果如序列表1所示，成功構建重組質粒pEGFP-C2-miR-126-sponge，命名為p-miR-126-sp (對應的PEGFP-C2命名為p-Cont)，如圖2所示；
4)將質粒p-miR-126-sponge大量抽提后，鑒定純度和濃度，結果顯示，0D260/280=!.56，濃度為 128 mg/L, _80°C保存；5)常規培養人肝癌細胞株H印G2細胞，按3X 105/ml的細胞密度接種于6孔板中，將10Ug 質粒 p-miR-126-sponge 和對照質粒 p-Cont (pEGFP_C2)體外分別利用 Lipofectamine2000瞬時轉染細胞，繼續在5% C02、37°C條件下培養；48小時后，抽取各組細胞總RNAjlJ用Realtime PCR探針法檢測miR-126表達水平，結果顯示，p-miR-126-sponge轉染組中，miR-126表達水平明顯下調(圖4),提不該載體可以顯者下調miR-126的表達；
6)我們進一步檢測了各轉染組中HepG2細胞生長的變化，如圖5、圖6所示，培養72小時后，與p-Cont轉染組相比，p-miR-126-sponge載體轉染組中HepG2細胞的生長明顯減弱(p〈0.05)，提示miR-126表達水平下調后，可顯著削弱腫瘤細胞體外生長，結果表明，含CMV啟動子的miR-126-sponge真核表達載體不僅可以下調miR-126在真核細胞中的表達，同時，我們也可通過體 外轉染觀察miR-126下調表達后的生物學效應。
【權利要求】
1.一種下調微小RNA-126表達的方法,其特征在于:在含CMV啟動子的真核載體上構建革El向miR-126的真核表達載體pEGFP-C2-miR-126_sponge,以下調miR-126在真核細胞中的表達；且將該載體體外轉染真核細胞后，利用熒光定量PCR儀檢測miR-126成熟體的表達，通過體外實驗觀察下調miR-126表達后的生物學效應。
2.根據權利要求1所述的下調微小RNA-126表達的方法，其特征在于:所述的pEGFP-C2_mi R-126-sponge的構建，具體是，利用軟件完成miR-126-sponge的序列設計；再用Hind III/KpnI雙酶切骨架載體pEGFP_C2、目的片段miR-126-sponge，回收片段純化，在16 °C條件下過夜連接；連接后轉化，挑取6個菌落，接種到含lOμg/ml卡那霉素的LB培養基中，12小時后提取菌液和質粒小抽法抽提質粒，并通過引物實現目的片段的PCR擴增，擴增目的片的引物序列為:上游，5 ’ -ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3 ’ ；下游，5’ -GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC-3’ ；重組質粒經Hind III和KpnI雙酶切后，成功構建重組質粒 pEGFP-C2-mi R-126_sponge。
【文檔編號】C12Q1/68GK104031980SQ201310543832
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】徐林, 胡燕, 周涯, 李永菊, 廖珍媛 申請人:遵義醫學院