利用l-乳酸生物合成s-1,2-丙二醇的方法
【專利摘要】本發明公開了一種制備S-1,2-丙二醇的方法。本發明所提供的制備S-1,2-丙二醇的方法具體包括用重組生物細胞將L-乳酸或其鹽轉化為S-1,2-丙二醇的步驟；所述重組生物細胞表達具有將L-乳酸或其鹽轉化為S-1,2-丙二醇功能的酶系統。所述酶系統包括如下（a1）-（a3）：（a1）具有將L-乳酸或其鹽轉化為L-乳酰輔酶A功能的酶1；（a2）具有將所述L-乳酰輔酶A轉化為L-乳醛功能的酶2；（a3）具有將所述L-乳醛轉化為S-1,2-丙二醇功能的酶3。本發明對建立擁有自主產權的、原料價格低廉的、合成途徑全新的、轉化效率較高的S-1,2-丙二醇的生物合成方法具有重要意義。
【專利說明】利用L-乳酸生物合成S-1 ’ 2-丙二醇的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種制備S-1，2-丙二醇的方法，特別涉及一種利用重組大腸桿菌將L-乳酸及其鹽形式轉化為S-1，2-丙二醇的方法。
【背景技術】
[0002]丙二醇的結構區別將其區分為1，2-丙二醇和1，3-丙二醇。1，2-丙二醇主要用來生產不飽和聚酯樹脂、防凍劑、增塑劑替代乙二醇用于防凍飛行器及在食品中作冷卻劑和熱載體等，它還可用于非離子洗滌劑或保濕劑。丙二醇還是良好的溶劑，可用于食品調味品和香料，或醫藥工業的軟膏油膏等。
[0003]光學活性1，2-丙二醇具有活性基團，可作為手性起始物用于藥物、除草劑、信息素和液晶的合成，具有很高的研究價值。大腸桿菌中自身存在有生成1，2_丙二醇的代謝通路。在代謝L-鼠李糖和L-巖藻糖途徑中，磷酸化后的糖由醛縮酶催化生成L-乳醛和二羥丙酮磷酸(DHAP)，后在厭氧的條件和NADH存在下L-乳醛被催化為L-1，2-丙二醇，即S-1.2-丙二醇。但由于原料價格過高，此通路并沒有很好經濟效益，所以沒有很好的研究價值。在嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)中也有從甲基乙二醒(methylglyoxal)分別生成乳醒(Lactaldehyde)或丙酮醒(Acetol)最終生成1，2_丙二醇的路徑，但其中有些路徑只是猜想的，目前并沒有證據表明存在實際的酶去催化。
[0004]關于生物催化合成R-1，2-丙二醇的研究，目前，國外已有關于生物催化合成R-1，2-丙二醇的報道，Tadashi等采用氣升式發酵罐對酵母還原丙酮醇生成R_l，2-丙二醇和酵母氧化拆分外消旋1，2-丙二醇進行了研究，但仍未得到工業化應用，而國內少有報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種制備S-1，2-丙二醇的方法，具體為利用L-乳酸生物合成S-1，2-丙二醇的方法。
[0006]本發明所提供的一種制備S-1，2-丙二醇的方法，包括用重組生物細胞將L-乳酸或其鹽轉化為s-l，2-丙二醇的步驟；所述重組生物細胞表達具有將L-乳酸或其鹽轉化為S-1, 2-丙二醇功能的酶系統。
[0007]在上述方法中，所述將L-乳酸或其鹽轉化為S-1，2-丙二醇，具體包括如下(O- (3)的步驟:
[0008](1)將L-乳酸或其鹽轉化為L-乳酰輔酶A ；
[0009](2 )將所述L-乳酰輔酶A轉化為L-乳醛；
[0010](3)將所述L-乳醛轉化為S-12-丙二醇。
[0011]在上述方法中，所述酶系統具體包括如下(al) - (a3):
[0012](al)具有將L-乳酸或其鹽轉化為L-乳酰輔酶A功能的酶I ;
[0013](a2)具有將所述L-乳酰輔酶A轉化為L-乳醛功能的酶2 ；[0014](a3)具有將所述L-乳醛轉化為S_l，2_丙二醇功能的酶3。
[0015]在本發明中，所述酶I為丙酰輔酶A轉移酶；所述酶2為輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶；所述酶3為3-羥基丙酸脫氫酶。
[0016]進一步,所述丙酰輔酶A轉移酶為丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰輔酶A轉移酶的點突變蛋白，其氨基酸序列具體如序列表中序列I所示；所述輔酶A依賴型琥拍酸半醒脫氫酶為小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)的輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶，其氨基酸序列具體如序列表中序列2所示；所述3-羥基丙酸脫氫酶為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的3_羥基丙酸脫氫酶，其氨基酸序列具體如序列表中序列3所示。
[0017]其中，序列I由524個氨基酸組成；序列2由462個氨基酸組成；序列3由292個
氨基酸組成。
[0018]所述重組生物細胞是將如下編碼基因導入目的生物細胞后得到的表達所述酶系統的重組生物細胞: [0019]如序列表中序列4所示的所述丙酰輔酶A轉移酶的編碼基因；
[0020]如序列表中序列5所示的所述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的編碼基因；
[0021]如序列表中序列6所示的所述3-羥基丙酸脫氫酶的編碼基因。
[0022]其中，序列4由1575個核苷酸組成，編碼序列表中序列I所示的蛋白；序列5由1389個核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的蛋白；序列6由879個核苷酸組成，編碼序列表中序列3所示的蛋白。
[0023]在本發明的一個實施例中，將所述酶系統的編碼基因導入目的生物細胞，具體為通過將攜帶并表達所述酶系統的編碼基因的重組質粒導入所述目的生物細胞中實現的。所述重組質粒具體為下述重組質粒A和下述重組質粒B。
[0024]在上述方法中，所述生物細胞可為微生物細胞、動物細胞或植物細胞。
[0025]在本發明的一個實施例中，所述生物細胞具體為大腸桿菌，如大腸桿菌Origami(DE3)。
[0026]進一步，所述重組生物細胞為下述的重組大腸桿菌I。
[0027]在本發明的一個實施例中，所述方法中，所述“用重組生物細胞將L-乳酸或其鹽轉化為S-1，2-丙二醇”具體為用所述重組生物細胞將L-乳酸鈉轉化為S-1，2-丙二醇。
[0028]在所述方法中，所述“用重組生物細胞將L-乳酸或其鹽(如L-乳酸鈉)轉化為S-12-丙二醇”具體包括如下(A)和(B)的步驟:
[0029](A)向0D600=0.6的所述重組大腸桿菌I的培養液中加入終濃度為0.2%(0.2g/100mL)的L-阿拉伯糖，37°C 180rpm震蕩培養，Ih后加入終濃度為0.05mM的IPTG，轉至20°C 180rpm震蕩培養16_18h ；
[0030](B)收集菌體，先用濃度為0.9% (0.9g/1OOmL)的NaCl水溶液洗兩次，后用IOOmM磷酸鹽緩沖液(PH7.4)重懸至0D600=30，加入終濃度為IOOmM的L-乳酸或其鹽(如L-乳酸鈉)，370C，200rpm,培養48h，從培養液中獲得S-1，2-丙二醇。
[0031]本發明的再一個目的是提供如下(I)或(II)或(III)的生物材料。
[0032](I)如下DNA片段中的全部或部分:
[0033](bI)核苷酸序列為序列表中序列4所示的DNA片段(丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)的丙酰輔酶A轉移酶的點突變優化后核苷酸序列)；
[0034](b2)核苷酸序列為序列表中序列5所示的DNA片段(小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)的輔酶A依賴型琥拍酸半醒脫氫酶的優化后核苷酸序列)；
[0035](b3)核苷酸序列為序列表中序列6所示的DNA片段(蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的3_羥基丙酸脫氫酶的優化后核苷酸序列)；
[0036]以上所述優化為在不改變相應酶的氨基酸序列的前提下，將野生型基因的密碼子替換為大腸桿菌偏好(高頻使用)的密碼子。
[0037](II)重組質粒A和/或重組質粒B:
[0038]所述重組質粒A為攜帶并表達(bl)中所述DNA片段的重組表達載體；所述重組質粒B為攜帶并表達(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的重組表達載體。
[0039]在所述重組質粒A中，啟動(bl)中所述DNA片段轉錄的啟動子為araBAD啟動子；在所述重組質粒B中，啟動(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段轉錄的啟動子均為T7啟動子。
[0040]具體的，所述重組質粒A為在pBAD43載體的多克隆位點(如EcoR I和Hind III)處插入序列表中序列4所示DNA片段后得到的重組質粒(pBAD-pct);所述重組質粒B為在pETDUET-Ι載體的多克隆位點I (如Nco I和Hind III)處插入序列表中序列5所示DNA片段，同時在多克隆位點2 (如Nde I和Xho I)處插入序列表中序列6所示DNA片段后得到的重組質粒(pETDUET-pm)。
[0041](III)重組大腸桿菌I或/和重組大腸桿菌2或/和重組大腸桿菌3:
[0042]所述重組大腸桿菌I為攜帶`(II)中所述重組質粒A和所述重組質粒B，并表達(bl)中所述DNA片段、(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大腸桿菌；
[0043]所述重組大腸桿菌2為攜帶(II)中所述重組質粒A，并表達(bl)中所述DNA片段的大腸桿菌；
[0044]所述重組大腸桿菌3為攜帶(II)中所述重組質粒B，并表達b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大腸桿菌。
[0045]在本發明的一個實施例中，所述重組大腸桿菌I為采用所述重組質粒A和所述重組質粒B共轉化大腸桿菌Origami (DE3)后，得到的表達所述酶1_酶3的大腸桿菌。
[0046]當然，只要是采用本發明所提供的利用L-乳酸生物合成S-1，2-丙二醇的三步反應，或是其中的若干步反應，來合成s-l，2-丙二醇，則含有(bl)- (b3)所述DNA片段，或是其中的若干DNA片段的表達盒、重組細胞系，以及除上述重組大腸桿菌外的其他重組菌也均屬于本發明的保護范圍。
[0047]所述生物材料在利用L-乳酸或其鹽(如L-乳酸鈉)合成S-1，2-丙二醇中的應用也屬于本發明保護范圍。
[0048]本發明建立了全新的以L-乳酸或其鹽(如L-乳酸鈉)為原料，通過生物合成途徑制備S-1, 2-丙二醇的方法。本發明對建立擁有自主產權、原料價格低廉、合成途徑全新、轉化效率較高的S-1，2-丙二醇生物合成方法具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0049]圖1為重組表達載體pBAD-pct、中間質粒pETDUET-pdcd和重組表達載體pETDUET-pm的酶切鑒定圖譜。其中，泳道M為DNA分子量標準；泳道I和3為重組表達載體pBAD-pct的BamH I單酶切結果；泳道2和4為未經酶切的重組質粒pBAD-pct對照；泳道5和6為中間質粒pETDUET-pdcd的Sph I單酶切結果；泳道7和8為重組表達載體pETDUET-pm的BsaA I單酶切結果。
[0050]圖2 為 S-1, 2-丙二醇標準品和重組菌株 Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的發酵濾液的HPLC圖譜的HPLC圖譜。其中，a)為S-1，2-丙二醇標準品的HPLC圖譜；b)為重組菌株Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的發酵濾液的HPLC圖譜。
[0051]圖3 為 S-1, 2-丙二醇標準品和重組菌株 Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的發酵濾液的質譜鑒定結果圖譜。其中，A為S-1，2-丙二醇標準品；B為重組菌株Origami(DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的發酵濾液由乙酸乙酯萃取后樣品
【具體實施方式】
[0052]本發明中制備S-1，2-丙二醇的方法，是在生物細胞中通過酶系統將L-乳酸或其鹽(如L-乳酸鈉)轉化為S-1，2-丙二醇。具體包括如下三步驟:
[0053](I)將L-乳酸或其鹽轉化為L-乳酰輔酶A ；
[0054](2 )將所述L-乳酰輔酶A轉化為L-乳醛；
[0055](3)將所述L-乳醛轉化為S-1, 2-丙二醇。
[0056]以上6步反應順次所·對應的酶為如下(al) - (a3):
[0057](al)具有將L-乳酸或其鹽轉化為L-乳酰輔酶A功能的酶1，如丙酰輔酶A轉移酶；
[0058](a2)具有將所述L-乳酰輔酶A轉化為L-乳醛功能的酶2，如輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶；
[0059](a3)具有將所述L-乳醛轉化為S-1，2-丙二醇功能的酶3，如3-羥基丙酸脫氫酶。
[0060]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0061]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0062]pBAD43載體:Addgene公司，產品目錄號為VYA0258。
[0063]pETDUET-Ι載體:Novagen公司，產品目錄號為71146。
[0064]大腸桿菌Origami (DE3):Novagen公司，產品目錄號為70627。
[0065]實施例1、用于生物合成S-1，2-丙二醇的重組大腸桿菌的構建
[0066]一、重組表達載體pBAD-pct和pETDUET-pm的構建
[0067]1、3步催化反應中步驟(1)所用酶基因的選擇及優化
[0068]針對3步反應中步驟(1)的催化反應,選取丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰輔酶A轉移酶的基因(pet)的CDS全序列(GenBank:AJ276553.1的第485-2059位)，經過設計和反復驗證得到適合于在大腸桿菌中表達的優化型丙酰輔酶A轉移酶基因序列，即將野生型丙酰輔酶A轉移酶基因序列在不改變氨基酸序列的前提下轉變成大腸桿菌偏好(高頻使用)的密碼子優化序列，從而提高丙酰輔酶A轉移酶在大腸桿菌培養環境中的表達水平。
[0069]接著，根據相關文獻報道(TaekHo Yang, Tae Wan Kim, Hye Ok Kang, Sang-HyunLee，Eun Jeong Lee, Sung-Chul Limj Sun Ok 0h，Ae-Jin Song, Si Jae Park, Sang Yup Lee.Biosynthesis of polylactic acid and its copolymers using evolved propionateCoA transferase and PHA synthase.Biotechnology and Bioengineering,2010，105，I50-160.)，將以上所得的優化型丙酰輔酶A轉移酶基因序列中對應于丙酰輔酶A轉移酶蛋白氨基酸序列第193位Val的三個核苷酸改為大腸桿菌偏好(高頻使用)的編碼Ala的密碼子，旨在減小蛋白表達過程中外源蛋白對宿主大腸桿菌的抑制作用(參考文獻“TaekHo Yang, Tae Wan Kim, Hye 0k Kang, Sang-Hyun Lee, Eun Jeong Lee, Sung-Chul Lim, Sun0k Oh, Ae-Jin Song, Si Jae Park, Sang Yup Lee.Biosynthesis of polylactic acidand its copolymers using evolved propionate CoA transferase and PHA synthase.Biotechnology and Bioengineering, 2010, 105, 150-160.” 中有報道)。
[0070]根據上述方法，最終獲得按大腸桿菌偏好設計的優化型點突變丙酰輔酶A轉移酶編碼基因，其基因序列為序列表中序列4，共由1575個核苷酸組成。該基因編碼的蛋白為序列表中序列I所示氨基酸序列組成的蛋白(即點突變丙酰輔酶A轉移酶)，與野生型丙酰輔酶A轉移酶基因(GenBank:AJ276553.1的第485-2059位)編碼的蛋白相比，其中第193位的 Val 突變為 Ala (V193A)。
[0071]針對步驟(2)的催化反應,選取小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)的輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的基因(pcdD)，對其采用同上的方式進行密碼子優化。優化后的所述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示，共由1388個核苷酸組成。該基因編碼序列表中的序列2所示的蛋白質。
[0072]針對步驟(3)的催化反應,選取臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的3_羥基丙酸脫氫酶的基因(_sB)，對其采 用同上的方式進行密碼子優化。優化后的所述3-羥基丙酸脫氫酶基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示，共由879個核苷酸組成。該基因編碼序列表中的序列3所示的蛋白質。
[0073]2、重組表達載體pBAD-pct的構建
[0074]以序列表中序列4所示DNA片段為模板，用引物I和引物2進行PCR擴增。
[0075]引物1:5’ -GAGGAATTCATGCGCAAAGTTCCGATTA-3，(下劃線部分為限制件內切酶EcoRI的識別序列，其后的序列為序列4的第1-19位)；
[0076]引物2:5’ -CCGGAAGCTTAGCTTTTCATTTCTTTCAGG-3> (下劃線部分為限制性內切酶Hind III的識別序列，該序列的第9-30位為序列4的第1554-1575位的反向互補序列)。
[0077]用限制性內切酶EcoR I和Hind III雙酶切PCR擴增產物，膠回收后與經過同樣雙酶切的PBAD43載體骨架大片段相連，得到重組質粒。將經過限制性內切酶BamH I單酶切初步鑒定正確(目的條帶752bp和6956bp，圖1中的泳道I和3)的重組質粒送樣測序。將經測序表明在PBAD43載體的多克隆位點EcoR I和Hind III之間插入序列表中序列4所示DNA片段后得到的重組質粒命名為pBAD-pct。在重組表達載體pBAD-pct中，啟動序列4所示DNA片段轉錄的啟動子為araBAD啟動子。
[0078]3、重組表達載體pETDUET-pm的構建
[0079]以序列表中序列5所示DNA片段為模板，用引物3和引物4進行PCR擴增，得到PCR產物I。以序列表中序列6所示DNA片段為模板，用引物5和引物6進行PCR擴增，得到PCR產物2。
[0080]引物3:5’-GAGTCATGAACACCAACGATCTGGAATC-3，(下劃線部分為限制性內切酶BspHI的識別序列，該序列的第6-28位為序列5的第1-23位)；[0081 ]引物4:5’-CGCAAGCTTAACGGATAGAAAAACCATT-3’ (下劃線部分為限制性內切酶HindIII的識別序列，該序列的第8-28為序列5的第1369-1389位的反向互補序列)。[0082]引物5:5 ’ -CGCGCTAGATGGAACATAAAACTTTATCA-3，(下劃線部分為限制性內切酶Bfa I的識別序列，其后的序列為序列6的第1-21位)；[0083]引物6:5，-GCGCTCGAGTTACCCCCTTATATATTTT-3，(下劃線部分為限制性內切酶 XhoI的識別序列，其后的序列為序列6的第861-879位的反向互補序列)。[0084]用限制性內切酶BspH I (與Nco I為同尾酶)和Hind III雙酶切PCR產物1，膠回收后與經過Nco I和Hind III雙酶切的pETDUET-Ι載體骨架大片段相連，得到中間質粒pETDUET-pdcd。將中間質粒pETDUET-pdcd用限制性內切酶Sph I單酶切，結果得到大小約為1222bp和5513bp的兩個目的條帶(圖1中的泳道5和泳道6)，與預期結果一致，證明中間質粒pETDUET-pdcd構建正確。[0085]再用限制性內切酶Bfa I和Xho I雙酶切PCR產物2，膠回收后與經過Nde I (與Bfa I為同尾酶)和Xho I雙酶切的中間質粒pETDUET-pdcd骨架大片段相連，得到重組質粒。將重組質粒用限制性內切酶BsaA I單酶切，結果得到大小約為1708bp、2270bp和3584bp的三個目的條帶(圖1中的泳道7和泳道8)，與預期結果一致。[0086]將以上經酶切鑒定初步證實構建正確的重組質粒送樣測序，將經測序表明在pETDUET-Ι載體的多克隆位點Nco I和Hind III和之間插入序列表中序列5所示DNA片段，同時在多克隆位點Nde I和Xho I之間插入序列表中序列6所示DNA片段后得到的重組質粒命名為pETDUET-pm。在重組表達載體pETDUET-pm中，啟動序列5所示DNA片段轉錄的啟動子和啟動序列6所示DNA片段轉錄的啟動子均為T7啟動子。[0087]二、用于從L-乳酸或其鹽合成S-1，2-丙二醇的重組大腸桿菌的構建[0088]將步驟一中的重組表達載體pBAD-pct和pETDUET-pm共轉化進入大腸桿菌0rigami(DE3)中，轉化后涂布到含有100 μ g/mL氨芐霉素和100 μ g/mL壯觀霉素的LB固體培養基平板上進行壓力篩選，挑取若干個單菌落，接種到含100 μ g/mL氨芐霉素和100 μ g/mL壯觀霉素的LB液體培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜。以菌液為模板，分別用引物對I(引物I/引物2)、引物對2 (引物3/引物4)、引物對3 (引物5/引物6)進行PCR擴增，分別能擴增得到大小約為1580bp、1396bp和885bp的目的條帶的單克隆菌株為陽性重組菌株，命名為 0rigami(DE3)/pBAD-pct/pETDUET-pm。實驗同時設置將pBAD43 空載體和 pETDUET-1空載體共轉化進入大腸桿菌Origami (DE3)的對照,所得重組菌株命名為Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET-l。[0089]實施例2、以L-乳酸鈉為底物生物合成S-1，2-丙二醇[0090]一、通過生物發酵將L-乳酸鈉轉化為S-12-丙二醇[0091]將實施例1構建的重組大腸桿菌Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm過夜培養，得到種子液，按體積比1%的比例接種到新的LB培養基中，37°C 180rpm震蕩培養。當0D600至0.6左右時加入終濃度為0.2% (0.2g/100mL)的L-阿拉伯糖，Ih后加入終濃度為0.05mM的IPTG進行誘導，轉至20°C 180rpm震蕩培養16_18h。[0092]誘導過后收菌,4°C,5000rpm,離心 lOmin。后用 0.9% (0.9g/100mL)NaCl 洗兩次。后用100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)重懸至0D600約為30左右。加入終濃度為100mM的L-乳酸鈉作為底物，37°C，200rpm反應24小時進行全細胞反應。之后，取發酵液，用于進行產物檢測。對照菌株Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET_l以相同方法進行發酵測試。實驗重復三次。其中，IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)的配方如下=K2HPO4.3H2018.3g，ΚΗ2Ρ042.7g，定容至IL去離子水中。
[0093]二、目標產物S-1，2-丙二醇的檢測
[0094]1、高效液相色譜檢測
[0095]S-1, 2-丙二醇標準品溶液的制備:取S-1，2-丙二醇標準品(sigma，目錄號540250)，用去離子水配制成適當濃度的溶液。
[0096]待測樣品溶液的制備:將步驟一所獲得的發酵液，12000rpm, 2min離心后取上清，用0.22 μ m濾膜過濾，得到待上機的待測樣品溶液。
[0097]將S-1，2-丙二醇標準品溶液和待測樣品溶液均按照如下條件進行HPLC檢測:色譜柱為有機酸柱 300mmX7.8mm Aminex HPX-87H(Bio-Rad);流動相為 6mM H2SO4 ;流速為
0.5ml/min ;上樣量為10微升；柱溫55°C ;示差折光檢測器。根據S-1，2-丙二醇標準品溶液和待測樣品的HPLC圖譜判定步驟一所獲得的發酵液中是否含有S-1，2-丙二醇。
[0098]實驗同時設置對照菌株Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET_l作為對照。
[0099]結果顯示，S-1，2-丙二醇標準品的HPLC圖譜如圖2中a)所示，從圖中可以看出，S-1, 2-丙二醇標準品的出峰時間為19.722min。重組菌株Origami (DE3)/pBAD-pct/pETDUET-pm的發酵濾液的 HPLC圖譜如圖2中b)所示，在與S-1，2-丙二醇標準品保留時間一致的位置也出現了目標峰。而對照菌株Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET_l的發酵濾液中則沒有該目標峰。根據以上結果，初步判定步驟一所獲得的發酵液中含有S-1，2-丙二醇，L-乳酸至S-1, 2-丙二醇的途徑已打通。
[0100]2、質譜鑒定
[0101]S-1，2-丙二醇標準品溶液的制備:取S-1，2-丙二醇標準品(sigma，目錄號540250)，用乙酸乙酯配制成適當濃度的溶液。
[0102]待測樣品溶液的制備:將步驟一所獲得的發酵液，12000rpm, 10min，4°C離心，收集上清，調節PH〈2.0，后加入0.5倍體積的乙酸乙酯，萃取收集有機相。
[0103]將S-1，2-丙二醇標準品溶液和待測樣品溶液(乙酸乙酯萃取后的有機相)，分別用
0.22微米有機濾膜過濾,分別進行GC/MS測定。具體條件如下:儀器型號=ThermoFisher公司生產的Trace ISQ氣相色譜質譜聯用儀(氣相=Tracel300)。GC條件:色譜柱:TG-WAXMS毛細柱(30mX0.25mmX0.25 μ m)。載氣:氦氣,流速lml/min。程序升溫:80°C維持Imin,后5°C /min升溫至200°C,維持5min。進樣方式:分流進樣，220°C,分流比1:10,1 μ I進樣。檢測器:ΕΙ源，質譜離子源溫度200°C，傳輸線溫度250°C，從9.5min開始質譜檢測，質量掃描范圍:35-300m/z。
[0104]S-l, 2-丙二醇標準品溶液和待測樣品溶液(乙酸乙酯萃取后的有機相)在氣相檢測的同一保留時間的出峰物質的質譜圖分別如圖3中A和B所示，從圖中可以看出，兩質譜圖相吻合，證明是同一物質。根據以上結果，進一步判定步驟一所獲得的發酵液中含有S-1, 2-丙二醇，L-乳酸至S-1，2-丙二醇的途徑已打通。
【權利要求】
1.一種制備s-l，2-丙二醇的方法，包括用重組生物細胞將L-乳酸或其鹽轉化為S-1, 2-丙二醇的步驟；所述重組生物細胞表達具有將L-乳酸或其鹽轉化為S-1，2-丙二醇功能的酶系統。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述酶系統包括如下(al)_(a3): (al)具有將L-乳酸或其鹽轉化為L-乳酰輔酶A功能的酶I ; (a2)具有將所述L-乳酰輔酶A轉化為L-乳醛功能的酶2 ； (a3)具有將所述L-乳醛轉化為S-1，2-丙二醇功能的酶3。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述酶I為丙酰輔酶A轉移酶； 所述酶2為輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶； 所述酶3為3-羥基丙酸脫氫酶。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述丙酰輔酶A轉移酶的氨基酸序列如序列表中序列I所示； 所述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示； 所述3-羥基丙酸脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述重組生物細胞是將如下編碼基因導入目的生物細胞后得到的表達所述酶系統的重組生物細胞: 如序列表中序列4所示的所述丙酰輔酶A轉移酶的編碼基因； 如序列表中序列5所示的所述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的編碼基因； 如序列表中序列6所示的所述3-羥基丙酸脫氫酶的編碼基因。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述生物細胞為微生物細胞、動物細胞或植物細胞。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述生物細胞為大腸桿菌。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述重組生物細胞為權利要求9中所述的重組大腸桿菌I。
9.如下(I)或(II)或(III)的生物材料: (I)如下DNA片段中的全部或部分: (bl)核苷酸序列為序列表中序列4所示的DNA片段； (b2)核苷酸序列為序列表中序列5所示的DNA片段； (b3)核苷酸序列為序列表中序列6所示的DNA片段； (II)重組質粒A和/或重組質粒B: 所述重組質粒A為攜帶并表達(bl)中所述DNA片段的重組表達載體；所述重組質粒B為攜帶并表達(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的重組表達載體。 (III)重組大腸桿菌I或/和重組大腸桿菌2或/和重組大腸桿菌3: 所述重組大腸桿菌I為攜帶(II)中所述重組質粒A和所述重組質粒B，并表達(bl)中所述DNA片段、(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大腸桿菌； 所述重組大腸桿菌2為攜帶(II)中所述重組質粒A，并表達(bl)中所述DNA片段的大腸桿菌； 所述重組大腸桿菌3為攜帶(II)中所述重組質粒B，并表達b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大腸桿菌。
10.權利要求9所述的生物材料在利用L-乳酸或其鹽合成S-1，2-丙二醇中的應用。
【文檔編號】C12R1/19GK103589756SQ201310573064
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】管祥辰, 王麗敏, 于波, 馬延和 申請人:中國科學院微生物研究所