一種應用微生物細胞催化法制備羥基醛的方法
【專利摘要】本發明涉及一種應用微生物細胞催化法制備羥基醛的方法，包括：S1，構建膜結合乙醛脫氫酶敲除的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌；S2，制備所述氧化葡萄糖酸桿菌工程菌的靜息細胞；S3，溶解于有機溶劑的底物二元伯醇被懸浮于水溶液中的所述靜息細胞氧化為羥基醛。根據本發明的方法，可以利用靜息細胞作為催化劑選擇性地氧化二元伯醇類化合物，從而制備多種羥基醛。與化學方法制備羥基醛相比，根據本發明的方法的副反應少，具有反應條件溫和、對環境友好，操作簡便，易于放大等優勢。本發明的方法中所使用的水溶液-有機溶劑的兩相催化體系，可解除產物羥基醛對細胞活性的抑制，且產物羥基醛主要分布于有機相中，易于產物分離。
【專利說明】一種應用微生物細胞催化法制備羥基醛的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，更具體地涉及一種應用微生物細胞催化法制備羥基醛的方法。
【背景技術】
[0002]醛是一類重要的化合物，可作為天然的風味添加劑應用于食品工業上，可作為香精香料用于化妝品工業，也可作為有機合成的中間體應用于醫藥、農藥、香料、染料、感光材料、液晶材料等的合成工業中。一些具有醇和醛的雙重性質的羥基醛化合物，在香料、食品、化妝品工業以及有機合成領域的應用尤為廣泛，例如水楊醛。水楊醛，又稱鄰羥基苯甲醛，可用作制造香豆素、香蘭素等食用香料、以及咳喘寧、紫外線吸收劑、殺蟲劑、滅菌劑和電鍍光亮劑的原料。近年來，香料和醫藥工業對無氯水楊醛的需求量越來越大，無氯水楊醛合成新工藝的研究和開發的關注度日益提升。
[0003]目前，國內外主要通過氧化伯醇的方法實現醛的生產，其中又以化學催化法為主。羥基醛可通過二元伯醇的選擇性、不完全氧化而獲得。由于醛比醇更容易被氧化，為了控制合成的醛不被進一步氧化，化學催化條件控制嚴苛，且過程煩瑣。此外，化學催化難以實現多羥基醇的區域選擇性轉化。生物催化具有效率高、專一性強、選擇性高、反應條件溫和、環境友好等特點。尤其在醛作為食品和化妝品使用時，生物法生產的醛可被看做天然物質，價值會有大幅提升。迄今為止，已報道的生物法合成的醛的種類非常有限，主要是一些單一功能團的醛，如利用運動假單胞菌合成乙醛，利用酵母屬微生物氧化短鏈脂肪醇生成相應的脂肪醛，利用醇脫氫酶、輔酶及過氧化物酶組成復合體系合成長鏈醛等。目前還沒有文獻報道過具有醇和醛雙重功能團的羥基醛的生物法合成方法。
【發明內容】
[0004]本發明旨在提供一種應用微生物細胞催化法制備羥基醛的方法，從而選擇性地將多元醇氧化為羥基醛。
[0005]本發明所述的應用微生物細胞催化法制備羥基醛的方法，包括:S1，構建膜結合乙醛脫氫酶敲除的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌；S2，制備所述氧化葡萄糖酸桿菌工程菌的靜息細胞；S3，溶解于有機溶劑的底物二元伯醇被懸浮于水溶液中的所述靜息細胞氧化為羥基醛。
[0006]優選地，通過同源重組和基因插入失活的方法來使得膜結合乙醛脫氫酶基因沉默，從而得到醛氧化途徑被阻斷的所述氧化葡萄糖 酸桿菌工程菌。
[0007]優選地，所述氧化葡萄糖酸桿菌工程菌的制備包括以下步驟:S11，以攜帶有乙醛脫氫酶基因的原始菌的基因組DNA為模板進行PCR擴增得到乙醛脫氫酶基因的內部片段，所述原始菌為氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003 ;S12，將所述乙醛脫氫酶基因的內部片段與質粒載體分別進行酶切反應，將酶切反應的產物進行連接得到連接反應物；S13，將所述連接反應物轉化E.coli JM109感受態細胞；S14，在克隆到載體上的乙醛脫氫酶基因內部選擇合適的酶切位點Xhol，與經XhoI酶切的Kam基因的PCR產物連接，轉化至感受態E.coliJM109，通過平板篩選得到重組質粒；S15，將含敲除突變載體的E.coli JM109作為供體菌用于三親接合，受體菌為氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003，將含Kam基因的乙醛脫氫酶片段整合到氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003的染色體上，通過Cefoxitin、Km來篩選三親接合子；S16，分別提取氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003及膜結合乙醛脫氫酶缺失菌株的基因組用作PCR模板，得到所述膜結合乙醛脫氫酶敲除的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌。
[0008]優選地，所述質粒載體為自殺質粒pSUP系列。選用的質粒載體是自殺質粒，進入氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003后不久就不能存在，只有含Kam基因的乙醛脫氫酶片段整合到染色體上的氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003才具Km抗性，因此可以通過Cefoxitin、Km來篩選
三親接合子。
[0009]優選地，所述靜息細胞的制備包括以下步驟:S21，發酵培養所述氧化葡萄糖酸桿菌工程菌得到細胞發酵液；S22，將所述細胞發酵液離心收獲菌體沉淀，用磷酸鹽緩沖液懸浮所述菌體沉淀得到所述靜息細胞。
[0010]優選地，所述有機溶劑選自:環己烷，正己烷，正庚烷，異辛烷，正十二烷，油酸。
[0011]優選地，所述水溶液為lOOmmol/L的磷酸鹽緩沖液。
[0012]優選地，所述有機溶劑與所述水溶液的體積比為1:1。
[0013]優選地，所述二元伯醇為芳香族二元伯醇。
[0014]優選地，所述二元伯醇選自:水楊醇，對羥基苯甲醇，間羥基苯甲醇，對羥基苯乙
醇，苯乙二醇。
[0015]優選地，溶解于所述有機溶劑的所述二元伯醇的濃度為10_30g/L。
[0016]優選地，所述氧化反應的溫度為20~40°C。
[0017]優選地，所述氧化反應的溫度為28~30°C。
[0018]優選地，在振蕩條件下或通氣攪拌條件下進行所述氧化反應。
[0019]根據本發明的方法，可以利用靜息細胞作為催化劑選擇性地氧化二元伯醇類化合物，從而制備多種羥基醛。與化學方法制備羥基醛相比，根據本發明的方法的副反應少，具有反應條件溫和、對環境友好，操作簡便，易于放大等優勢。本發明的方法中所使用的水溶液-有機溶劑的兩相催化體系，可解除產物羥基醛對細胞活性的抑制，且產物羥基醛主要分布于有機相中，易于產物分離。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1是轉化液的HPLC檢測結果。其中，在5.078min處是底物水楊醇。
[0021]圖2是轉化液的GC檢測結果。其中，在2.4min處是異辛烷，在3.2min處是內標苯乙醇，在3.0min處是產物水楊醒。
[0022]圖3是氧化葡萄糖酸桿菌工程菌催化水楊醇積累水楊醛的過程示意圖。
[0023]圖4是添加不同濃度的水楊醇時的催化結果。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖，給出本發明的較佳實施例，并予以詳細描述。
[0025]本發明中，靜息細胞是指將在生長培養基上培養至一定時間后、用適當的方法收集并用緩沖液進行洗滌的微生物細胞，是去除營養成分、終止生長的微生物細胞。
[0026]在本發明的下述實施例中，使用的二元伯醇包括水楊醇、對羥基苯甲醇、間羥基苯
甲醇、對羥基苯乙醇、苯乙二醇、肉桂醇等芳香族二元伯醇。
[0027]在本發明的下述實施例中，液相色譜(HPLC)檢測水楊醇的轉化率的檢測條件如下:色譜柱為Agilent的SB-AQ,流速0.8ml/min,柱溫:30°C,流動相為甲醇:水=50:50(v/V)，檢測波長215nm。
[0028]氣相色譜(GC)檢測水楊醛的得率的檢測條件如下:色譜柱為Agilent的DB-1毛細管色譜柱，進樣口溫度為250°C，檢測器溫度為250°C，流速為1.0ml/min,分流比50: 1，升溫程序為100°C保持lmin，然后以8°C /min的速度升溫至180°C，保持Imin。
[0029]實施例1膜結合乙醛脫氫酶敲除的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌的構建膜結合乙醛脫氫酶敲除的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌的構建可參考文獻(Biotechnology andBioprocess Engineering, 2012, 17 (6): 1156-1164.)，具體方法如下:
[0030](I)根據氧化葡萄糖酸桿菌621H (G.0Xydans621H)膜結合乙醛脫氫酶(G0X0587)基因序列設計引物 aldhA-F (SEQ ID N0.1):5’ -TACTGCAGTCTGCCATGCCGCCGGAAGC-3’ ；aldhA-R (SEQ ID N0.2):5’-AACTGCAGTGGGCTITTCGGTGTTCTGGATGA-3’(捷瑞生物)并加上PstI酶切位點，擴增目標基因2000bp的內部片段。
[0031](2)將目標基因內部片段和自殺載體pSUP202分別用PstI酶切后，用T4連接酶連接，轉化至感受態E.coli JM109，PstI酶切位點正好在載體的Amp位點上，當外源片段從這個位點插入載體后，可以通過含Amp的平板與含Cm的平板篩選得到含重組質粒的E.coliJM109。
[0032](3)在克隆到載體上的目標基因內部選擇合適的酶切位點Xhol，與經XhoI酶切Kam基因的PCR產物連接，轉化至感受態E.coli JM109，通過Kam抗性平板篩選重組質粒。擴增帶 XhoI 酶切位點的 Kam 基因引物是 Kam-XhoI F (SEQ ID N0.3): 5’-AATCTCGAGGCGAGGTATGTAGGCGGTGC-3’ ；Kam-XhoI R (SEQ ID N0.4):
[0033]5’ -CGCCTCGAGTTAGAAAAACTCATCGAGCA-3’。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0034](4)將含敲除突變載體的JM109作為供體菌用于三親接合，受體菌為G.0xydansDSM2003(德國微生物菌種保藏中心)。敲除突變載體可以在幫助菌的幫助下進入G.0xydansDSM2003,由于其上帶有目標基因的同源片段，因此可以和G.0xydans DSM2003染色體上該基因的DNA片段發生雙交換，將含Kam基因的目標基因片段整合到G.0xydans DSM2003的染色體上。質粒PSUP202是自殺質粒，進入G.0xydans DSM2003后不久就不能存在，只有含Kam基因的目標基因片段整合到染色體上的G.0xydans DSM2003才具Km抗性，因此可以通過Cefoxitin、Km來篩選三親接合子。
[0035](5)分別提取G.0xydans DSM2003及膜結合乙醛脫氫酶缺失菌株的基因組，用作PCR模板。一條PCR引物與Km抗性基因載體上的序列互補:Kam-Xho1-R (SEQ ID N0.5):
[0036]5，-CGCCTCGAGTTAGAAAAACTCATCGAGCA-3’ 或 Kam-Xho1-F (SEQ ID N0.6):5，-AATCTCGAGGCGAGGTATGTAGCGGTGC-3’，另一條引物與目標aldhA基因上游(或下游)序列互補:ALDH-F (SEQ ID N0.7):5’-GCGAATTCATTCATCGGGAGACATACTTGC-3’ 或ALDH-R (SEQ IDN0.8):5’ -AATCTAGAGCTTTCGGTCCAGCACAGG-3’。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。當Km基因插入到目標基因內部時，特定長度的PCR產物就會出現，并將PCR產物連接到T-載體進行測序，從而確定突變體菌株的目的基因中是否插入有外源載體。正確敲除膜結合乙醒脫氫酶的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌標注為G.0xydans aldhA::Km。
[0037]實施例2氧化葡萄糖酸桿菌的基因工程菌的靜息細胞的制備
[0038]培養基配方(g/L):山梨醇80.0g，酵母粉提取物20.0g，磷酸二氫鉀1.0g五水硫酸鎂0.5g，溶解于1000mL蒸餾水中。并于121°C滅菌15分鐘后備用。
[0039]從山梨醇固體平板上挑取G.0xydans aldhA::Km的單菌落接種于含有25 μ g/mL的硫酸慶大霉素的培養基A試管中，在30°C，250rpm的搖床上培養20h左右作為種子液，然后按10%的比例轉接于含有100ml同樣培養基的500ml三角瓶中，在250rpm和30°C條件下，振蕩培養24h。
[0040]將發酵液于8000rpm離心lOmin，收集菌體沉淀，并用生理鹽水洗滌菌體兩次,離心去上清，按濕菌體20g/L的菌體懸浮于0.1M的磷酸緩沖液(pH6.0)中，即得用于催化反應的靜息細胞。
[0041]實施例3水楊醇的轉化及產物的檢測
[0042]在50ml三角瓶中加入5ml終濃度lOOmmol/1水楊醇和5ml的異辛烷，再添加實施例2中獲得的靜息細胞20g/l，于30°C、200rpm的恒溫搖床中培養，反應8h后終止反應。將反應液于12000rpm離心IOmin,并用0.22 μ m的濾膜過濾，收集濾液,分別用液相色譜(HPLC)和氣相色譜(GC)檢測水楊醇的轉化率和水楊醛的得率。根據圖1和圖2的檢測結果，在8h后水楊醛的產率可達到86.2%，且無副產物產生(圖3)。
[0043]實施例4水楊醇濃`度對轉化反應的影響
[0044]在50ml三角瓶中加入5ml含有20g/l細胞的磷酸緩沖液(0.1Μ，ρΗ6.0)及5ml異辛烷，加入一定量(10-30g/l)的水楊醇底物，于150rpm，30°C下反應8h。當底物濃度低于或等于10g/l時，水楊醇幾乎完全轉化為水楊醛，產率大于95%。如果進一步增加底物濃度，底物對細胞活性產生抑制，導致反應的初速度開始下降(見圖4)。水楊醇的優選濃度為IOg/L.[0045]實施例5水楊醇轉化反應中有機溶劑的選擇
[0046]在50ml三角瓶中加入5ml含有20g/l細胞的磷酸緩沖液(0.1Μ，ρΗ6.0)及5ml有機溶劑(環己燒，正己燒，正庚燒，異辛燒，正十二烷油酸)，加入終濃度10g/l的水楊醇底物，于150rpm，28°C下反應8h。由表1所示，氧化葡萄糖酸菌工程菌靜息細胞催化水楊醇的反應，可在加入不同的有機溶劑所形成的兩相體系中進行。其中，優選異辛烷，此體系中產量最聞。
[0047]表1
【權利要求】
1.一種應用微生物細胞催化法制備羥基醛的方法，其特征在于，該方法包括:S1，構建膜結合乙醛脫氫酶敲除的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌；S2，制備所述氧化葡萄糖酸桿菌工程菌的靜息細胞；S3，溶解于有機溶劑的底物二元伯醇被懸浮于水溶液中的所述靜息細胞氧化為羥基醛。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過同源重組和基因插入失活的方法來使得膜結合乙醛脫氫酶基因沉默，從而得到醛氧化途徑被阻斷的所述氧化葡萄糖酸桿菌工程菌。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸桿菌工程菌的制備包括以下步驟:S11，以攜帶有乙醛脫氫酶基因的原始菌的基因組DNA為模板進行PCR擴增得到乙醛脫氫酶基因的內部片段，所述原始菌為氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003 ;S12，將所述乙醛脫氫酶基因的內部片段與質粒載體分別進行酶切反應，將酶切反應的產物進行連接得到連接反應物；S13，將所述連接反應物轉化E.coli JM109感受態細胞；S14，在克隆到載體上的乙醛脫氫酶基因內部選擇合適的酶切位點Xhol，與經XhoI酶切的Kam基因的PCR產物連接，轉化至感受態E.coli JM109，通過平板篩選得到重組質粒；S15，將含敲除突變載體的E.coli JM109作為供體菌用于三親接合，受體菌為氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003，將含Kam基因的乙醛脫氫酶片段整合到氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003的染色體上，通過CefoxitiruKm來篩選三親接合子；S16，分別提取氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003及膜結合乙醛脫氫酶缺失菌株的基因組用作PCR模板，得到所述膜結合乙醛脫氫酶敲除的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述質粒載體為自殺質粒pSUP系列。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述靜息細胞的制備包括以下步驟:S21，發酵培養所述氧化葡萄糖酸桿菌工程菌得到細胞發酵液；S22，將所述細胞發酵液離心收獲菌體沉淀，用磷酸鹽緩沖液懸浮所述菌體沉淀得到所述靜息細胞。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑選自:環己烷，正己烷，正庚烷，異辛烷，正十二烷，油酸。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑與所述水溶液的體積比為1:1。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述二元伯醇為芳香族二元伯醇。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述二元伯醇選自:水楊醇，對羥基苯甲醇，間羥基苯甲醇，對羥基苯乙醇，苯乙二醇。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，溶解于所述有機溶劑的所述二元伯醇的濃度為10-30g/L。
【文檔編號】C12P7/24GK103602708SQ201310601537
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月25日 優先權日:2013年11月25日
【發明者】林金萍, 魏東芝, 張行星 申請人:華東理工大學