一種羥基苯甲酸酐二聚體類化合物、制備方法及用途的制作方法

專利名稱：：一種羥基苯甲酸酐二聚體類化合物、制備方法及用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種具有對稱或不對稱結構的羥基苯甲酸酐類化合物，更具體地說，涉及一種含兩個及兩個以上羥基取代的苯甲酸縮合生成的酸酐二聚體化合物或其類似物、其制備方法，及其作為高效HIV-1整合酶抑制劑，用于制備抗人乳頭瘤病毒、皰滲病毒、艾滋病毒和抗腫瘤藥物的用途。
背景技術：
：艾滋病毒(HIV)、皰瘆病毒(HSV)、人乳頭瘤病毒(HPV)都具有整合進入人體細胞染色體的特征，但各自又有不同的遺傳和代謝特性。HIV-1是導致艾滋病的病毒，它編碼三種酶逆轉錄酶(reversetranscriptase,RT，)、蛋白酶(Protease，PR)和整合酶(Integrase,IN)。這三種酶是HIV復制和感染所必需的基本酶。目前臨床上用于治療艾滋病的藥物都是逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，但這兩類藥均不能根除HIV，并出現了毒性、病人的并發癥和多重抗藥性等副作用，因此，具有新穎作用機制的整合酶抑制劑有望提高療效，并能與已有的抗艾滋病藥物產生協同作用，組成新的有效的聯合療法。HIV-1整合酶(IN)是病毒復制所必需的三大基本酶之一，逆轉錄病毒DNA在整合酶的催化下插入宿主染色體內，使之與人類染色體連成一體后，病毒便可以復制，整合酶控制HIV侵入染色體，整合酶抑制劑能夠阻止HIV侵入正常細胞的染色體。現在認為，這是抗艾滋病藥物研制領域的一大突破。而且HIV-1整合酶以單一的活性部位與病毒和宿主兩種不同構象的DNA底物作用，有可能限制HIV對整合酶抑制劑藥物產生抗藥性；加之整合酶只存在于病毒中，哺乳動物均無此類酶，因此HIV-1整合酶成為大有前景的抗HIV藥物設計的新型靶蛋白(Curr.Opin.Drug.Discov.Devel.2001,4,402-410)。目前許多合成的化合物具有抑制HIV-1整合酶的效果，但這些化合物或是結構不穩定，或是合成工藝復雜，或是原料來源少，生產成本較高。都沒有進入巿場，僅在進行I期臨床研究。人乳頭瘤病毒(HPV)與誘發多種生殖器的炎癥和癌有密切關系，如尖銳濕疣、宮頸炎和宮頸癌。尖銳濕疣又稱生殖器疣或性病疣，是由人乳頭瘤病毒(HPV)引起的皮膚黏膜良性新生物，為目前最常見的性傳播病之一。人乳頭瘤病毒(HPV)有八十多種亞型，已經證明，其中一些高危亞型如16、18型的病毒可以整合進入宮頸黏膜細胞的DNA中，現有的藥物不能將病毒殺滅，其可誘發宮頸癌。近年研究結果表明(陳富強等，腫瘤防治雜志，2001,8(4)342-344;徐成康，中山醫科大學學報，1998,19(3):223-226),29.3%的宮頸糜爛患者呈現HPV陽性，而正常宮頸陽性率只為11.1%。據報道(Ahnwsetal,JCellBiochemSuppl,1997;28-29:133-139),慢性宮頸炎中高危HPV(人乳頭瘤病毒)16、18型表達率為69%，高危型HPV16、18檢出率隨宮頸糜爛程度的增加呈現遞增趨勢，顆粒型或乳突型糜爛HPV16、18檢出率與正常宮頸比較差異顯著。用PCR可測得宮頸癌中HPV16、18陽性率達83.33%,高危型HPVDNA整合到宿主細胞染色體，可產生E6、E7腫瘤蛋白，它們分別抑制抑癌基因p53和Rb,使細胞逃脫p53和Rb的控制，導致細胞周期控制失常，使通常處于靜止狀態的細胞增生活躍、胂瘤生長。若HPV16持續存在，就可使宮頸病變進展。宮頸HPV感染與外陰感染不同，宮頸中以HPV16/18型為主，常不發生濕疣改變，而是以隱性感染長期存在，先引起不典型增生，當有其他因子參與時而導致癌變。現在較缺乏治療尖銳濕疣、宮頸糜爛的有效藥物，一些藥物如鬼臼毒素d，優點是療程短，但存在刺激性、毒副作用大的問題。具體表現是疼痛、水腫、糜爛等。外用藥治療尖銳濕疣的重組人干擾素cc-2p凝膠是當前公認有效果的藥物。但由于這些藥物不能根除整合進入人體細胞的病毒，使感染經久不愈，轉化為惡性腫瘤。單純皰滲病毒(HSV)是雙股DNA病毒，其經口腔、呼吸道、生殖道粘膜和破損皮膚等多種途徑侵入機體。人感染非常普遍，感染率達80~90%,常見的臨床表現是粘膜或皮膚局部集聚的皰疹，偶而也可發生嚴重的全身性疾病，累及內臟。研究表明HSV-1和HSV-2可能分別與唇癌、外陰癌及子宮頸癌有關，曾受到人們重視(孫荷等，中國實用婦科與產科雜志，2001，17(7):407-409)。目前治療藥物有皰疹凈、阿糖胞苷、阿糖腺苷、溴乙烯尿苷和無環鳥苷等，但治療時間較長，需要5至7天。惡性胂瘤嚴重威脅人類健康和生命。目前臨床應用的化療藥物毒性較大,對實體瘤效果較差，接受化療的病人絕大多數最終都死于腫瘤細胞轉移。因此，尋找低毒性而能抑制腫瘤生長和轉移的藥物是腫瘤化療研究的重要任務。人們一直在研究開發抗HIV、HSV和HPV病毒感染以及抗腫瘤的新藥。3，4.5-三羥基苯甲酸及其葡萄糖生成的衍生物具有抑制HIV-l整合酶的作用(KaneCJ等PlantaMed2002May;68(5):457-9)，但活性不高。CN1234353C公開了3，4,5-三羥基苯甲酸用于抗腫瘤的用途，具體來說是抗肝癌和宮頸癌方面的用途。但已知3，4,5-三羥基苯甲酸在人體環境條件下不穩定。
發明內容本發明的目的是提供一類具有高效抗病毒、抗腫瘤活性的羥基苯甲酸酐二聚體化合物，該類化合物具有抗人乳頭瘤病毒、皰瘆病毒和具有HIV-1整合酶抑制劑活性，可抗一類能夠整合進入人體細胞染色體的病毒、能夠抑制整合進入染色體病毒的繁殖，阻止病毒感染的復發。本發明的另一目的是提供一類羥基苯甲酸酐二聚體化合物的制備方法。本發明的再一目的是提供羥基苯甲酸酐二聚體類化合物在制備治療和預防病毒性疾病、腫瘤的藥物上的應用。本發明基于HIV-1整合酶與其抑制劑相互作用的晶體結構和構效關系，由于HIV-1整合酶表現出以二聚或四聚體形式起催化作用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，13040-13043)，但低聚體的精確性質仍未知，因此，發明人從具有抗病毒活性的羥基苯甲酸類化合物出發，通過縮合生成羥基苯甲酸酐二聚體類化合物，以獲取高活性的抗病毒劑。本發明具有結構式(I)的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物為<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中R1、R2、R3、R4、R5和R1'、R'2、R3'、R4'、R5'各獨立地選自OH或H并其中一個苯環上至少含二個OH。優選的為，R2、R3、R4、R5和R1'、R'2、R3'、R4'、R5'中苯環上各獨立包括三個以上的OH。更優選的為，3，3',4，4',5，5'-六羥基二苯甲酸酐、2,2'，3,3'-四羥基二苯甲酸酐或3,3',4，4'-四羥基二苯甲酸酐。具有結構式(I)的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物是通過下列反應制備的<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其制備過程為以各種具有不同取代位置和數量羥基(-OH)的苯甲酸為原料，原料包括但不限于對羥基苯甲酸、鄰羥基苯甲酸、2，3-二羥基苯甲酸、2,4-二羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸、2，3，4-三羥基苯甲酸、3，4,5-三羥基苯甲酸、2，4，5-三羥基苯甲酸。先將苯環上具有二個或二個以上羥基的羥基苯甲酸溶解于有機溶劑中，在催化劑及加熱的條件下進行縮合反應，然后將溶劑、雜質去除而成。所述的有機溶劑為l，4-二氧六環、苯或甲苯，所述的催化劑為濃硫酸、對甲苯磺酸或乙酸酐和磷酸的混合物中的任意一種，優選濃硫酸，催化劑的量為羥基苯甲酸量的0.5~20%。本發明所述加熱溫度為加熱的溫度范圍10020(TC。可以通過水洛、油洛或微波進行加熱，優選微波加熱。本發明縮合反應后的溶劑、雜質去除過程為先將縮合反應中的有機溶劑蒸干，用丙酮進行重結晶、過濾、烘干，得提純的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物。其中重結晶、過濾均可釆用本領域常用的方式。采用DMSO溶解縮合產物，通過核磁共振測試證明產物為羥基苯甲酸酐二聚體類化合物。采用有效劑量的本發明羥基苯甲酸酐二聚體類化合物與藥學上可接受的載體制成藥劑。可為片劑、膠囊、軟膠囊、散劑、顆粒劑、細粒劑、丸劑、微乳液、懸濁劑或泡騰片等口服制劑，亦可為凍干粉、注射液、栓劑、軟膏、硬膏、貼劑、噴霧劑或滴眼劑等非口服制劑。這些制劑都可采用本領域技術人員熟知常用的制備方法而獲得。本發明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物可用于制備預防和治療病毒性感染疾病，其中病毒性感染是指人和動物人乳頭瘤病毒、皰滲病毒、艾滋病毒感染。可用于制備治療人和動物病毒性疾病藥物，特別是用于治療人和動物人乳頭瘤病毒(HPV)、皰瘆病毒(HSV)、艾滋病毒等病毒性疾病，包括艾滋病、尖銳濕疣、單純皰瘆、陰道炎、宮頸炎及宮頸糜爛。本發明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物可用于制備預防和治療腫瘤的藥物，包括但不限于腦膠質瘤、結腸癌、肝癌、肺癌、人子宮內膜癌、腎癌、胃癌細胞株、宮頸癌。本發明通過基本骨架羥基苯甲酸及其類似物與具有二個或二個以上羥基取代的羥基苯甲酸縮合成具有母核對稱結構、苯環上具有相同或不同數目羥基取代的羥基苯甲酸酐二聚體(如結構式(I))，經皰滲病毒感染患者局部外用，證明具有非常顯著的抗皰瘆病毒活性，經過對各個化合物的HIV-1整合酶抑制活性以及抗HPV、HSV和抑制多種腫瘤細胞生長的活性等進行測定，藥理試驗證明其具有非常高的抗人乳頭瘤病毒和具有HIV-1整合酶抑制劑活性，其對于底物的3'端切斷和鏈轉移的半抑制濃度IC50均在88.92-10.20ing/ml范圍內；且能有效地殺滅和抑制HPV6/11、16/18型，可用于制備治療HPV的病毒感染和的藥物，治療尖銳濕疣、陰道、宮頸炎及宮頸糜爛和輔助治療子宮頸癌。同時利用藍四唑法，檢測羥基苯甲酸酸酐二聚體類化合物對體外培養的人腫瘤細胞增殖具有非常高的腫瘤細胞抑制活性。因此，本發明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物可抗一類能夠整合進入人體細胞染色體的病毒、能夠抑制整合進入染色體病毒的繁殖，阻止病毒感染的復發。具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。本發明所采用的主要材料(含量均大于99%)及其來源材料來源2，3-二羥基苯甲酸臺州巿中大化工有限公司3，4-二羥基苯甲酸臺州巿中大化工有限公司3，4，5-三羥基苯甲酸南京龍源天然多酚合成廠微波爐2M0(MHz)三洋電機(中國)有限公司實施例l3，3’，4,4’，5,5’-六羥基二苯甲酸酐取200毫升燒杯，將3，4，5-三羥基苯甲酸20克溶解在1，4-二氧六環100克中，在溶液中加入濃硫酸1克(5%)，在三洋微波爐2450(MHz)加熱至全部溶解后，再加熱3分鐘(200℃),再將1,4-二氧六環蒸干，用丙酮進行重結晶，再進行過濾，70℃烘干，得紅橙色狀物，產率96%。1HNMR(400MHz，DMSO):δ6.901(6H)，δ2.486-2.494(4H).IR(KBr，CM-1):3463.6，3059.2，2667.5，1917.4,1867.5，1828.9，1794.6，1657.6,1614.7，1542.6，1454.5，1434.8，1318.0，1265.5，1227.4，1170.1-471.2。實施例23,3'，4,4'—四羥基二苯甲酸酐取200亳升燒杯，將3，4-二羥基苯甲酸20克溶解在甲苯100克中，在溶液中加入對甲苯磺酸0.5克，在三洋微波爐2450(MHz)加熱至全部溶解后，再加熱5分鐘(150℃),然后，將甲苯蒸干，用丙酮進行重結晶，再進行過濾，70℃烘干，得橙色狀物，3,3，,4，4，-四羥基二苯甲酸酐，產率86%。'HNMR(400MHz,DMSO):δ6.756-7.321(4H)，δ2.485-2.494(2H).IR(KBr，CM-1):3546.2,3205.5,2652.6，1871.2，1845.1，1676.3,1600.8,1526.6，1466.8,1419.6，1380.0，1346.1，1298.24，1190.6，1126.9-450.9。實施例32,2'3,3'-四羥基二苯甲酸酐取200亳升燒杯，將2，3-二羥基苯甲酸20克溶解在100克苯中，在溶液中加入磷酸2克和乙酸酐2克，在三洋微波爐2450(MHz)加熱至全部溶解后，再加熱6分鐘(100℃)，然后，將苯蒸干，用丙酮進行重結晶，再進行過濾，70℃烘干，得橙色狀物，2，2，,3,3，-四羥基二苯甲酸酐，產率82%。'HNMR(400MHz，DMSO):δ6.99-7.24(4H)，δ2.49(2H).IR(KBr，CM"):IR(KBr，CM"):3377.2，3243.0，3096.5,2578.6，1916.3，1847.1,1794.7，1678.8，1656.6，1598.9，1559.8，1540.9,1474.7，1433.7,1382.37，1354.0，1301.7，1258.0,1233.46,1158.65,1070.3-419.3實施例4抗HPV病毒微乳液的制備取1，2-丙二醇30ml、吐溫8020ml、氮酮5ml混合，加滅菌蒸餾水至總體積為100ml，得外用制劑溶液。取3,3'，4,4',5,5'-六羥基二苯甲酸酐10g,加外用制劑溶液50ml，調節pH至5.5，然后加外用制劑溶液至100ml，得10%本發明的抗HPV病毒微乳液。實施例5抗HPV病毒3,3'，4，4'，5,5'六羥基二苯甲酸酐注射液的制備取3，3',4，4'，5，5'六羥基二苯甲酸酐10g、氯化鈉8.5g、1，2-丙二醇10ml、吐溫8010ml,混合后加滅菌蒸餾水使其溶解，并加滅菌蒸餾水至100ml,調節pH至7.4，濾過，灌封，在10(TC滅菌30min。即得3,3，,4,4，，5,5，六羥基二苯甲酸酐注射液。實施例6復方3,3',4，4',5，5'六羥基二苯甲酸酐泡騰片的制備取3,3，，4，4，,5,5，六羥基二苯甲酸酐0.25g、聚肌胞O.Olg、酒石酸0.45g分別過80目篩，以95%乙醇制成軟材，過12目篩制濕粒，于5(TC干燥，備用。另取碳酸氫鈉0.65g、糊精0.02g加無菌蒸餾水制軟材，過12目篩制濕粒，于5(TC干燥，然后與上述干粒混合，整粒，加適量滅菌蒸餾水，烘片刻，加O.OlgPEG6000。混勻，壓片，即得。實驗例1本實驗例在于研究本發明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的HIV-1整合酶抑制活性。一、HIV-1整合酶抑制試驗的測試原理HIV-1整合酶的作用機制是兩步反應1)3，端加工(3'Processing):整合酶結合前病毒DNA的長末端重復區域(LTR)的特定序列形成穩定的復合物，然后進行核苷3'端的內切核苷酸解加工，特異性地切掉序列…CAGT-3，末端的GT二核苷酸，露出凹進的3，位羥基；2)鏈轉移(StrandTransfer):加工過的DNA/整合酶預整合復合物穿過核膜進入核子中心，與宿主的DNA結合，然后整合酶催化病毒DNA凹進的3'位羥基通過酯交換反應嵌入宿主細胞的染色體內，成為成熟的前病毒。因此，整合酶抑制劑的活性表現在對病毒DNA的3'端切除的抑制或鏈轉移的抑制，以半抑制濃度ICs。來表征。用合成的30個寡核苷酸作供體底物，用合成的20個寡核苷酸作為靶底物，在96孔板包被供體底物加入純化的HIV-1整合酶，進行ELISA反應，檢測靶DNA的鏈轉移的產物，以生物素標記的堿性磷酸酶系統顯色，酶標儀測定0D值。在反應體系中加入樣品可用于篩選該酶的抑制劑。二、測試材料和方法1.HIV-1整合酶中國國家新藥篩選中心和中國醫學科學院醫藥生物技術研究所提取并保存。2.樣品處理樣品配置濃度按表l，臨用前溶于DMSO配成適當濃度，再作5倍稀釋，4個稀釋度。供體底物和靶底物上海生工合成。3.測試方法樣品稀釋后加入供體底物包被96孔板中，并加入含有整合酶和biotin-靶底物的反應緩沖液中，在最佳反應條件下孵育，以生物素標記的堿性磷酸酶系統顯色，測定405nm吸收值OD值。三、測試結果見表l。表1HIV-1整合酶抑制試驗結果<table><row><column>樣品編號</column><column>初始濃度(pg/ml)</column><column>IC50(ng/ml)</column></row><row><column>3，3'，4,4，,5,5'-六羥基二苯甲酸酐</column><column>109</column><column>10.20±3.08</column></row><row><column>3，4,5-三羥基苯甲酸</column><column>109</column><column>100.46</column></row><row><column>3，3，,4，4，-四羥基二苯甲酸酐</column><column>109</column><column>35.42±14.61</column></row><row><column>3,4-二羥基苯甲酸</column><column>109</column><column>-</column></row><row><column>2，2'，3，3'-四羥基二苯甲酸酐</column><column>109</column><column>88.92</column></row><row><column>2，3-二羥基苯甲酸</column><column>109</column><column>-</column></row><table>注表中"-"表示樣品在初始濃度抑制HIV-1IN活性的百分率小于50呢。結論體外藥物抑制HIV-1整合酶實驗初篩結果顯示樣品3，3',4,4，,5,5'六羥基二苯甲酸酐、3,3',4,4'四羥基二苯甲酸酐和2，2，,3,3，-四羥基二苯甲酸酐抑制HIV-1整合酶的半數有效濃度(IC5o)分別為(10.20士3.08μg/ml、(35.42士14.61)μg/ml和(88.92)μg/ml。3，4，5-三羥基苯甲酸抑制HIV-1整合酶的IC50為100.46μg/ml，其它樣品抑制HIV-1整合酶活性的IC50>109μg/ml。藥理數據顯示，這類羥基苯甲酸酐二聚體類化合物具有非常高的HIV-1整合酶抑制活性，對于底物的3'端切斷和鏈轉移的半抑制濃度ICso均在88.92-10.20μg/ml范圍內，其中最好的化合物為3,3，,4,4，,5,5，六羥基二苯甲酸酐。2，2，,3,3，-四羥基二苯甲酸酐和3，3，,4，4，-四羥基二苯甲酸酐的抑制活性高于原羥基苯甲酸的單體化合物。實驗例2本實驗例在于研究本發明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物抑制HPV病毒的活性。本發明通過實時熒光定量PCR檢測HPV病毒的量的改變來觀察活性成分和產品效果，該方法已在數篇公開發表的文獻中應用(蔡有齡等，中國性病艾滋病防治，2002,8:2,108;吳元勝、范瑞強等，實用中西醫結合臨床，2003,3:2,1)。采用熒光定量PCR技術檢測HPV病毒篩選藥物實驗，按表2分組，各取樣品5克，分別加入1,2-丙二醇30毫升、吐溫80試劑20毫升，加至IOO毫升，制備成微乳液為供試樣品，生理鹽水空白對照。HPV病毒來源來自多位病人臨床標準的尖銳濕疣標本，切取后，用生理鹽水洗去血液，在無菌條件下，將標本剪碎，加入3倍體積生理鹽水混勻、研磨成勻漿放置-40℃備用。試驗方法取每種供試藥品微乳液及生理鹽水各50ul，分別加入尖銳濕疣組織勾漿50ul，37℃溫育24小時，然后按達安基因診斷中心提供的HPV6,11和16，18型FQ-PCR診斷試劑盒提供的操作步驟進行檢測，采用常規堿裂解法提取DNA0.2ml入薄壁反應管中，同時加入一定濃度的引物、F-PROBE、DNTP、DNA聚合酶及緩沖液等，用ABIPRISM7700熒光定量PCR擴增儀，93℃2min予變性后，按93℃45s，55℃l20s，反復進行40個循環，定量測得結果。數據見表2。表2熒光定量PCR檢測HPV病毒篩選藥物實驗<table><row><column>管號</column><column>病毒HPV6/11(拷貝/ml)</column><column>HPV16/18(拷貝/ml)</column></row><row><column>空白對照管</column><column>1.45x106</column><column>1.40x105</column></row><row><column>3,4,5-三羥基苯甲酸</column><column>0</column><column>0</column></row><row><column>沒食子酸丙酯</column><column>0</column><column>0</column></row><row><column>3，4-二羥基苯甲酸</column><column>1.90x104</column><column>8.50x104</column></row><row><column>2,3-二羥基苯甲酸</column><column>2.30x104</column><column>3.20x103</column></row><row><column>3，3，,4，4'，5,5，六羥基二苯甲酸酐</column><column>0</column><column>0</column></row><row><column>3,3'，4，4'四羥基二苯甲酸酐</column><column>0</column><column>0</column></row><row><column>2,2，,3，3，-四羥基二苯甲酸酐</column><column>0</column><column>0</column></row><table>結果顯示尖銳濕疣的組織勻漿在加入受試化合物后24小時后，3,3，，4，4，，5，5，六羥基二苯甲酸酐、3，3',4,4'四羥基二苯甲酸酐、2，2，,3，3，-四羥基二苯甲酸酐、沒食子酸丙酯、3,4，5-三羥基苯甲酸組，FQ-POVR不能再檢出HPV6/11和HPV16/18病毒；3，4-二羥基苯甲酸和2，3-二羥基苯甲酸組卻具有較高濃度的HPV6/11和HPV16/18病毒量，空白組有很高的HPV6/11和HPV16/18病毒量，說明本發明的化合物在體外細胞培養具有能快速有效地殺滅HPV病毒的能力。結論本發明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物能有效地殺滅和抑制HPV6/11、16/18型，可用于制備治療HPV的病毒感染的藥物，治療尖銳濕疣、陰道、宮頸炎及宮頸糜爛和輔助治療子宮頸癌。本發明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物可用于制備治療人和動物病毒性疾病藥物，特別是用于治療人和動物人乳頭瘤病毒(HPV)、皰瘆病毒(HSV)、艾滋病等病毒性疾病，包括艾滋病、尖銳濕疣、單純皰瘆、陰道、宮頸炎及宮頸糜爛和子宮頸癌。實驗例3臨床外用治療單純皰滲病毒(HSV)感染選經臨床診斷單純皰麥病毒(HSV)感染者36人，隨機平均分為3組取無環鳥苷軟膏、10%沒食子酸丙酯消毒液(10g沒食子酸丙酯、20ml1，2-丙二醇、15ml吐溫80和5ml氮酮，加蒸餾水至100亳升)和實施例4所得，每曰用藥三次，外用涂抹患處。結果顯示3,3，,4,4，，5，5，-六羥基二苯甲酸酐微乳液組平均痊愈天數為2天，而沒食子酸丙酯消毒液組平均痊愈天數為3天、無環鳥苷軟膏組平均痊愈天數為5.5天，3，3，,4,4，，5，5，-六羥基二苯甲酸酐微乳液組與另外兩組比較有顯著差異。3，3，，4，4，,5，5，-六羥基二苯甲酸酐組效果優于無環鳥苷軟膏組和沒食子酸丙酯組。實驗例4本實驗例在于研究本發明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物對腫瘤細胞抑制的活性。本發明利用藍四氮唑法，檢測羥基苯甲酸酐二聚體類化合物對體外培養的人腫瘤細胞增殖的抑制作用。一、材料1.腫瘤細胞株人腦膠質瘤細胞株(U251),人結腸癌細胞株(LOVO)，人肝癌細胞株(HepG2)，人肺癌細胞株(PC84045),人子宮內膜癌細胞株(JEC),人腎癌細胞株(GRC)，人胃癌細胞株(MCG804),人宮頸癌細胞株(HeLa),人肝癌細胞株(BEL-7402)、人臍靜脈血管內皮細胞株(ECV304)均購自中山醫學院動物實驗中心，由本室保存。2.主要儀器和試劑C02濕化孵箱Sheldon公司；超凈工作臺蘇州凈化設備廠；酶標儀Biored公司；胰蛋白酶(Trypsin):Sigma公司；RPMI-1640培養液Gibco公司；96孔培養板，Coming公司；新生牛血清杭州四季清公司。二、方法1.細胞培養腫瘤細胞系按常規方法培養于含15%新生牛血清的RPMI-1640培養液，置37C含5%0)2濕化孵箱內培養，倒置顯微鏡觀察生長情況。約3-5天傳代一次，取處于對數生長期細胞，用0.25%胰酶消化，用無血清RPMI-1640培養液制備細胞懸液，血球計數板計數，臺盼藍拒染法測定細胞活力，細胞活力>95%用于正式實驗。2.嚷唑鹽(MTT)比色法該方法是一種細胞活力的檢測方法，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可使外源的MTT(2.5-二苯基四氮唑溴鹽，又稱P塞唑鹽)，還原為難溶性的藍紫色結晶物，并沉淀于細胞中，而死細胞無此功能，可用二甲基亞砜(DMSO)異丙醇或10%酸化SDS(十二烷基硫酸鈉)將顆粒溶解，用酶標儀在A570波長處測OD值，可間接反映活細胞的數量，該法用于細胞因子生物活性檢測，抗腫瘤藥物及腫瘤放射敏感性及細胞毒試驗的測定，特點是簡便、快速、經濟、靈敏、準確，重復性好，無需采用放射性核素。目前已廣泛用于臨床前抗癌藥物篩選及新鮮腫瘤細胞的藥物敏感性檢測。方法如下(1)用0.25%胰蛋白酶消化法制備的腫瘤細胞懸液，用10%小牛血清的RPMI1640整細胞濃度為105/ml,于96孔板中每孔加100ul，培養24小時后加不同劑量藥物100ul/孔，設陰性對照組，陽性對照組和調零孔，每組4個平行孔。(2)37。C5呢C02繼續培養24-48小時，實驗終止前，每孔加入MTT溶液(5g/L)，用酶標儀檢測A570nm的OD值，以不加藥的陰性對照組A570的OD值均數作為對照，按下式計算細胞存活率及藥物對細胞的抑制率<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage16</formula>細胞抑制率(％)=(1-試驗組OD值/對照組OD值)x100%用細胞存活率對劑量對數作圖，并按作圖法求出IQo值。具體的實驗方法如下配液將化合物分別用代號進行標記，PBS溶解每種化合物，細菌過濾器除去細菌，每種化合物配成l(T3g/ml,10—4g/ml,10—5g/ml,保存在4。C待用。MTT法取培養4-5天，處于指數生長期的細胞培養一瓶，加入適量Trypsin-EDTA液，使貼壁細胞脫落，用10ml含15%新生牛血清的RPMI1640培養液配成懸液；用臺盼藍染色后再血球計數板上做細胞計數，使活細胞在97%以上；用完全培養基稀釋細胞懸液配成每100ml含5000~400000個細胞；用96孔平板，每孔加細胞懸液200ul。將96孔板置于37°C,5%C02溫箱24小時；受試化合物作3個稀釋度，每種濃度平行五個孔；同時設無血清RPMI1640為對照組。將96孔板在37。C,5%032及100%濕度的溫箱中孵育3天；MTT用無血清RPMI1640培養液配成lmg/ml溶液，每孔加50ul,37。C溫育4小時，使MTT還原成甲臜(Formazan);吸出上清液，加入200ulDMSO使甲臜溶解，用平板搖床振蕩5分鐘搖勻；用酶標儀計測量吸光值，測量波長570nm,參比波長630nm處測定每個小孔的吸光度值，所獲數據用SPSS11.0統計軟件處理，計算細胞的抑制率。抑制率％=(1-樣品組吸光度平均值/溶劑組吸光度平均值)xlOO%結果判斷抑制率〉50%為敏感；30%~50%為中度敏感；<30%為不敏感三.結果與分析表3化合物體外對腫瘤細胞抑制<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結果顯示在加入受試化合物后3天后，2,2，,3,3，-四羥基二苯甲酸酐對各種腫瘤細胞都有明顯抑制、但同時對正常的人臍靜脈血管內皮細胞株(ECV304)有抑制；3,3，,4,4，,5,5，六羥基二苯甲酸酐對各種腫瘤細胞也都有不同的抑制率，人肺癌細胞株(PC84045)，人子宮內膜癌細胞株(JEC)，人腎癌細胞株(GRC),人宮頸癌細胞株(HeLa)，人肝癌細胞株(BEL-7402)的抑制較明顯，而對正常的人臍靜脈血管內皮細胞株(ECV304)沒有抑制，另外，實驗結果顯示，3，4，5-三羥基苯甲酸組在濃度為10—3g/ml、10—4g/ml時，對正常的人臍靜脈血管內皮細胞株(ECV304)有抑制，分別為80.22和42.81。因此，3，3，，4，4，,5，5，六羥基二苯甲酸酐比其單體3,4,5-三羥基苯甲酸組的副作用要低。3,3，,4,4，四羥基二苯甲酸酐對腫瘤細胞有抑制，效果低于3，3，,4,4，，5,5，六羥基二苯甲酸酐。說明本發明多羥基取代的化合物抑制腫瘤細胞的效果較好。而效果最明顯的是2，2'，3,3，-四羥基二苯甲酸酐。因此，本發明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物或含有該化合物的組合物作為活性成分的有效劑量，可用于制備治療人和動物腫瘤的藥物，這類羥基苯甲酸酸酐二聚體類化合物具有非常高的腫瘤細胞抑制活性。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。權利要求1.具有結構式(I)的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物，id="icf0001"file="A2006101611790002C1.gif"wi="121"he="42"top="39"left="42"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中R1、R2、R3、R4、R5和R’1、R’2、R’3、R’4、R’5各獨立地選自OH或H，并其中一個苯環上至少含二個OH。2.根據權利要求l所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物，其特征在于苯環上各獨立包括三個以上的OH。3.根據權利要求l所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物，其特征在于化合物為3，3，，4，4，，5,5'-六羥基二苯甲酸酐、3，3，,4，4,-四羥基二苯甲酸酐或2,2',3,3'-四羥基二苯甲酸酐。4.一種制備權利要求l-3任意一項所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的方法，其特征在于，包括如下步驟先將苯環上具有二個或二個以上羥基的羥基苯甲酸溶解于有機溶劑中，在催化劑及加熱的條件下進行縮合反應，然后將溶劑、雜質去除而成。5.根據權利要求4所述羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的制備方法，其特征在于，所述的有機溶劑為l,4-二氧六環、苯或甲苯，所述的催化劑為濃硫酸、對甲苯磺酸或乙酸酐和磷酸的混合物中的任意一種，催化劑的量為羥基苯甲酸量的0.5~20%,所述加熱溫度為10020(TC。6.根據權利要求4或5所述羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的制備方法，其特征在于，所述的催化劑為濃硫酸。7.根據權利要求4-6任意一項中所述羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的制備方法，其特征在于，所述溶劑、雜質去除過程為先將縮合反應中的有機溶劑蒸干，用丙酮進行重結晶，過濾、烘干，得提純的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物。8.根據權利要求l-3任意一項所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物在制備預防和治療病毒性感染疾病的藥物中的應用。9.根據權利要求8所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的應用，其特征在于，所述病毒性感染為人或動物人乳頭瘤病毒、皰瘆病毒、艾滋病毒感染，特別是用于治療人和動物人乳頭瘤病毒、皰瘆病毒、艾滋病的病毒性疾病，包括艾滋病、尖銳濕疣、單純皰疹、陰道炎、宮頸炎及宮頸糜爛。10.根據權利要求1-3任意一項所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物在制備預防和治療腫瘤的藥物中的應用，所述的腫瘤為腦膠質瘤、結腸癌、肝癌、肺癌、人子宮內膜癌、腎癌、胃癌、宮頸癌。全文摘要本發明提供了一類具有結構式(I)的對稱或不對稱結構的羥基苯甲酸酐二聚體化合物、制備方法和用途。該類化合物通過基本骨架羥基苯甲酸及其類似物與具有相同或不同羥基取代的羥基苯甲酸縮合成具有母核對稱結構、苯環上具有相同或不同數目羥基取代的羥基苯甲酸酐二聚體，藥理試驗證明它具有抗人乳頭瘤病毒、皰疹病毒和具有HIV-1整合酶抑制劑活性，可抗一類能夠整合進入人體細胞染色體的病毒、能夠抑制整合進入染色體病毒的繁殖，阻止病毒感染的復發，同時具有抗腫瘤活性。文檔編號C07C65/00GK101200426SQ200610161179公開日2008年6月18日申請日期2006年12月11日優先權日2006年12月11日發明者李健誠,秦衛華,黃海蓮申請人:盛華(廣州)醫藥科技有限公司