一株玫煙色擬青霉及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株玫煙色擬青霉及其應用。本發明所提供的玫煙色擬青霉(Paecilomyces?fumosoroseus)TRCC22001保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為：CGMCC?No.7993，以及本菌株在防治刺吸式口器害蟲方面的應用。
【專利說明】一株玫煙色擬青霉及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus),同時還涉及一種該玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)的制備方法,及其在防治刺吸式口器害蟲中的應用。
【背景技術】
[0002]隨著可持續農業觀的建立，探索無公害、無污染的生物防治措施已成為植物病害綜合治理中的重要課題，日益受到世界各國的重視。
[0003]據不完全統計，世界上記載的蟲生真菌約100屬800多種。在我國已報道的達405種，其中蟲草屬80種，寄生線蟲的真菌10種，寄生昆蟲的真菌種類215種，報道的新種達24種。我國自50年代以來，開發應用的昆蟲病原真菌約20種，使用面積最廣的是白僵菌和綠僵菌。
[0004]昆蟲病原真菌是指那些在寄主正常生理條件下能直接侵入體內、增殖和迅速引起死亡的類群。它們以吸收血淋巴中的養分、分解寄主組織或產生有毒代謝產物而殺死昆蟲。在引起昆蟲傳染性疾病的致病微生物中，由真菌引起昆蟲死亡的情形最多，約占60%。同時，昆蟲病原真菌種類繁多，對蟲口密度起著重要的調節作用，所以利用昆蟲病原真菌種類資源進行“以菌治蟲”應是生物防治工作的重要組成部分。昆蟲病原真菌的致病機理:昆蟲病原真菌從孢子萌發到菌體重新在蟲體上產生孢子一般分為10個階段:(I)孢子附著于寄主表皮；(2)孢子萌發；(3)穿透表皮；(4)菌絲在血腔內生長；(5)毒素產生；(6)寄主死亡；(7)菌絲侵入寄主的所有器官；(8)菌絲穿出表皮；(9)產生孢子；(10)侵染單位的擴散。只要完成了前四個階段，就完成了對寄主的入侵和感染；當病原真菌在體內的菌絲大量增殖時，就可導致寄主死亡。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供了一種防治刺吸式口器害蟲的昆蟲病原真菌一玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)。其 rDNA ITS1-5.8S-1TS2 序列:
[0006]5，-TCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTAACGAGTTTTTTCAACTCCCTAACCCTTTGTGAACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGCGTCCGGACGGCCCTGCGCCGCCCGCGACGGACCCAGGCGGCCGCCGGAGACCCACAAATTCTGTTTCTATCAGTCTTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGC CTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACACCTTCGGGGGAGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCATACCGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGTAGTACTCCAACGCGCACCGGGAACCCGACGCGGCCACGCCGAAACACCCAACTTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAA-3，。
[0007]同時，本發明的目的還在于提供一種玫煙色擬青霉(Paecilomycesfumosoroseus)的菌種培養方法和固體培養方法。
[0008]更進一步地，本發明的目的在于提供了一種玫煙色擬青霉(Paecilomycesfumosoroseus)的應用。為了實現上述目的，本發明的技術方案采用了一種玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus),其保藏號為 CGMCC N0.7993。
[0009]同時，本發明的技術方案采用了一種玫煙色擬青霉(Paecilomycesfumosoroseus)的菌種培養方法，(I)斜面種子培養。斜面菌種培養基為改良式PDA:20%馬鈴薯，2%蔗糖，0.2%蛋白胨，0.1% K2HPO4.3H20，0.3% NaNO3,0.05% MgSO4.7Η20，0.05%KC1，0.01% FeSO4, 2%瓊脂，水1000ml。121攝氏度高壓蒸汽滅菌30min。試管接種后放置26攝氏度恒溫培養1d備用。(2)液體種子培養。培養基:改良式PDA (去瓊脂)。將其裝Λ 500ml三角瓶，每瓶裝100ml，121攝氏度高壓蒸汽滅菌30min。接入試管斜面菌種(每支接兩瓶)，放置搖床(180轉/ min) 26攝氏度培養60h備用。
[0010]同時，本發明的技術方案采用了一種玫煙色擬青霉(Paecilomycesfumosoroseus)的固體培養方法:固體培養基為70%麥麩+30%米糠。按固體培養基配比稱取原料，加1.2倍水充分拌勻，過夜后121攝氏度高壓蒸汽滅菌30min備用。
[0011]進一步地，本發明的技術方案采用了一種玫煙色擬青霉(Paecilomycesfumosoroseus)在防治刺吸式口器害蟲方面的應用。
[0012]本發明所涉及的玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)在對小菜蛾防治過程中，玫煙色擬青霉孢子粉對小菜蛾幼蟲的死亡率為76.2%，玫煙色擬青霉孢子懸浮液對小菜蛾幼蟲的死亡率為59.8%，玫煙色擬青霉孢子培養液對小菜蛾幼蟲的死亡率為58.5%。
[0013]本發明所涉及的玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)在對茶小綠葉蝶防治過程中，防效最聞可達71.3%。
[0014]本發明的菌株:玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)已經保藏與中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為:中國.北京.北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物所，保藏日期為2013年08月13日，其保藏編號為 CGMCC N0.7993。
【具體實施方式】
:
[0015]實施例1TRCC22001菌株的鑒定:
[0016]分子系統學鑒定，DNA提取方法:采用石英砂研磨CTAB提取法(Scott et al.，2000)。
[0017]遺傳標記:rDNAITS1-5.8S-1TS2，擴增引物:ITS5, ITS4(White et al.，1990)。
[0018]PCR擴增反應條件:先94°C加熱3分鐘使模板DNA變性，然后進入下列溫度循環:94 V變性30秒，50 V退火30秒，72 °C延伸45秒，共進行35個循環，最后在72 °C延伸5分鐘(Wang,2012)。
[0019]PCR 產物檢測和測序:PCR 產物與 10bp DNA ladder (MBI Fermentas)用 2.0% 的瓊脂糖凝膠(agarose gel)在0.5 X TBE電泳緩沖液中于80V電壓下電泳20分鐘，然后置于
0.5 μ g / ml的溴乙淀(EB, ehidium bromide)溶液中染色15分鐘,在波長365和254nm的紫外光下檢測為明顯單一條帶的產物由擎科生物技術有限公司純化后用ABI3700 (AppliedB1systems)進行雙向直通測序。
[0020]數據處理和統計學分析:原始序列用生物軟件B1edit7.0.9(Hall，1999)編輯后得到準確無誤的序列，與GenBank下載的模式和權威菌株序列組成序列數據矩陣。對于序列矩陣，在B1edit7.0.9下做必要的人工編輯和調整得到的新矩陣。將該矩陣用MEGA5.0 (Tamura et al., 2011)進行鄰居連接法(neighbor-joining, NJ)分析，推斷出系統發育樹，并用自展法(bootstrap)進行1000次重復評估各分支的可靠性。
[0021]菌株系統發育樹見附圖1、附圖2。結果表明TRCC22001菌株與(Paecilomycesfumosoroseus)相似度為98.90 并且其菌體形態和生理生化指標符合(Paecilomycesfumosoroseus)的特征，所以可以鑒定 TRCC82001 菌株為(Paecilomyces fumosoroseus)。后經中科院微生物研究所將(Paecilomyces fumosoroseus)命名為玫煙色擬青霉。TRCC22001菌株于2013年8月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為:CGMCC N0.7993。
[0022]實施例2菌種培養:
[0023](I)斜面種子培養。斜面菌種培養基為改良式PDA:20%馬鈴薯，2%蔗糖，0.2%蛋白胨，0.1% K2HPO4.3H20，0.3% NaNO3,0.05% MgSO4.7Η20，0.05% KCl，0.01% FeSO4, 2%瓊脂，水1000ml。121攝氏度高壓蒸汽滅菌30min。試管接種后放置26攝氏度恒溫培養1d備用。(2)液體種子培養。培養基:改良式PDA (去瓊脂)。將其裝入500ml三角瓶，每瓶裝100ml，121攝氏度高壓蒸汽滅菌30min。接入試管斜面菌種(每支接兩瓶)，放置搖床(180轉/ min) 26攝氏度培養60h備用。
[0024]實施例3固體培養
[0025](I)培養基配比:70%麥麩+30%米糠。按配比稱取原料，加1.2倍水充分拌勻，過夜后121攝氏度高壓蒸汽滅菌30min備用。(2)培養方法及性狀觀察。將培養基分別鋪在無菌瓷盤上(厚度以2~3cm為宜)，各按10%接種量接入液體種子，混合均勻，蓋上蓋子，26攝氏度恒溫培養。第7d翻動I次后噴霧濕潤或“灌水濕潤”培養，第15d再次翻動后噴霧濕潤或“灌水濕潤”，連續培養20d，作好生長狀況記錄。培養20d后，32攝氏度烘40h即可。(3)產孢量測定:稱取I g，放入三角瓶中，加適量的含有吐溫-80的蒸餾水，打散孢子，用血球記數板計算每克的孢子數。
[0026]實施例4玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)的毒力
[0027]1、玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)對小菜蛾幼蟲的侵染過程觀察
[0028]挑取剛蛻皮的小菜蛾3齡幼蟲，將培養好的玫煙色擬青霉孢子粉接菌到小菜蛾3齡幼蟲體表，接菌后于20攝氏度、相對濕度75%~80%條件下飼養，每天定時更換新鮮甘藍葉片。3次重復，每重復20頭幼蟲。處理后1h開始取樣，每2h取樣I次，16h后每4h取樣I次。樣品用3%的戊二醛固定，系列處理后于掃描電鏡下觀察、拍照。孢子萌發以芽管長度超過孢子直徑長度(非圓形孢子按較小的直徑)的一半作為萌發標準。
[0029]2、致病力測定
[0030](I)接種孢子粉:將小菜蛾3齡幼蟲和涂有火棉膠的蓋玻片置于培養皿蓋中，然后將25攝氏度、SDA培養基培養14d的玫煙色擬青霉菌落倒置于內放小菜蛾幼蟲的皿蓋上，用手輕拍培養皿底部數次，使孢子粉落到小菜蛾幼蟲和蓋玻片上，取出蓋玻片反蓋在血球計數板上，滴兩滴棉藍液，使蓋玻片上孢子數量為6~7個mm 2。將處理后的小菜蛾幼蟲放入墊有濕濾紙、直徑為15cm的培養皿內飼養。飼養條件為20攝氏度、相對濕度75%~80%，每天定時更換新鮮甘藍葉，觀察感病癥狀并記錄死亡蟲數。3次重復，每重復20頭幼蟲，以不接菌的小菜蛾幼蟲為對照。數據處理采用Duncan新復極差法。
[0031](2)接種孢子懸浮液:取25攝氏度、SDA培養基培養14天的玫煙色擬青霉分生孢子，用含0.1 %吐溫-80的無菌水制成孢子懸浮液(磁力攪拌器攪拌1min以上)，調節孢子懸浮液濃度為2 X 10 7個mL—1。用噴霧器對放在濾紙上的小菜蛾3齡幼蟲和蓋玻片定量噴霧，然后取出蓋玻片鏡檢孢子數量，使蓋玻片上孢子數為6~7個mm2。每處理20頭幼蟲，3次重復，以0.1%吐溫-80無菌水為對照。飼養條件及數據處理同上。
[0032](3)接種孢子培養液:取25攝氏度、SDA培養基培養14天的玫煙色擬青霉分生孢子置于沙氏液體培養基中，將孢子濃度調節為2X10 7個mL—1，搖床培養8小時后再進行接菌處理，接菌方法及飼養條件同上。
[0033]3、3種不同接菌方法對小菜蛾幼蟲的致病力
[0034]不同接菌方法玫煙色擬青霉對小菜蛾幼蟲的致病速率和致病力明顯不同。玫煙色擬青霉分生孢子培養液比孢子懸浮液和孢子粉對小菜蛾幼蟲的致病速率快，處理后44小時發現蟲體表現出明顯的感病癥狀，72小時出現死亡高峰，其致死中時為3.18天；孢子懸浮液和孢子粉處理的小菜蛾幼蟲，60小時出現感病癥狀，比孢子培養液晚16小時，96h出現死亡高峰,致死中時分別為4.20天和4.34天。
[0035]實施例4玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)制劑的制備及藥效
[0036]1、孢子粉生產與懸乳劑配制
[0037]將保存的菌種在SDAY平板上活化，恒溫(25e)光照培養至產孢時，取孢子粉至薩氏培養液(不含瓊脂的SDAY)中振蕩培養24小時，轉接后繼續培養48小時然后，將含大量菌絲的菌液接入經浸泡和蒸汽滅菌至適當熟度的大米上，接種量為10%，菌液與大米充分混合后攤于托盤中，在25度下培養10天，在35度下風干I天再過機械振動的120目篩而收集孢子粉，其含孢量大于lOllg—1，將定量孢子粉加入配方優化的可乳化溶劑油中而配制成孢子懸乳劑，含孢量為1010ml-1，此即為純孢子懸乳劑，簡稱純孢劑，在此基礎上，用10%吡蟲啉可濕性粉劑作為增效劑，按3% (W / V)的比例加入純孢子懸乳劑中(即Sg^lOOmr1)，由此獲得混配的孢子懸乳劑，簡稱混配劑。選吡蟲啉作為增效劑，一是因為它是目前被允許在茶園使用的化學殺蟲劑，二是因為它與殺蟲真菌之間極好的生物相容性。
[0038]2、田間試驗
[0039]選擇代表性茶園(茶小綠葉蟬危害嚴重且分布相對均勻)進行田間藥效試驗，管理條件一致；該茶園為典型山丘茶園，茶垅(寬約I~115米)呈梯級分布，坡度約60°，坡底至坡頂高約40m。試驗包括4個處理，清水對照(CK)、含3%吡蟲啉10%可濕劑的礦物油載體對照(01)、玫煙色擬青霉的純孢劑(OP)和混配劑(OPI)。每處理小區重復3次，每小區面積約60m2 (約60m長的獨壟)，小區之間設I壟空白(不作任何處理)作為保護區。各菌劑用水稀釋500倍噴霧，使噴液的實際孢子濃度為2 X 10 7個孢子^mr1,每小區噴菌液約5kg，非菌劑處理的噴液量(CK及01)相同，所有處理按隨機區組排列，共噴霧2次，第二次噴霧在第一次噴霧后的第12d進行，兩次用菌時間均為晴天傍晚。
[0040]3、蟲口調查
[0041]茶小綠葉蟬喜陰涼且活動性強，善跳躍，給田間抽樣調查帶來難度。試驗期間，抽樣調查一般在晨露未干前(早上8:30時以前)該蟲不太活動時進行，陰天則可全天進行。因每小區實為一壟，故采用對茶樹編號的方法，調查時隨機選取一編號的茶樹作為起始抽樣株，然后每隔2株抽取I株,每小區共查10株,每株抽查10片嫩葉(取芽下第二片嫩葉),輕輕地翻看(受觸動的芽葉不用于觀察)，就地計數并記載若蟲數和成蟲數，最后按處理統計每10葉蟲數，首次用菌前調查蟲口基數，然后每隔3或4天調查一次，在第二次用菌2周后作最后一次調查，田間試驗期間的當地氣象數據從當地氣象站獲得。
[0042]4、數據分析
[0043]對各處理的茶小綠葉蟬密度(蟲量/ 10葉)，用DPS數據處理系統軟件進行方差分析。各處理的相對防效(E)按以下公式計算:
[0044]E= [1-(PCK0XPn) / (PckiXPto)] XlOO
[0045]式中，Ptci和Pn分別表示處理小區在處理前后調查的平均10葉蟲量，Pcxtl和Pm分別表示清水對照小區噴霧前后調查的平均10葉蟲量。
[0046]5、試驗結果
[0047](I)試驗期間天氣狀況:環境條件是影響真菌殺蟲劑的重要因素；本研究的田間試驗正值當地高溫季節，從噴菌至觀察結束的25天中，溫度變化范圍為21.2~38.1攝氏度，最低日均溫22.7攝氏度，最高日均溫31.2攝氏度，平均日均溫26.6攝氏度。從降雨情況看，共有14個降雨日，其中4個降雨日的雨量小于Imm, I~5mm的小雨日4d, 5~25mm的中雨日3天,25~50mm的大雨日4天,總降雨量達241.2mm。總之,6月中旬至7月中旬正是試驗所在地浙江遂昌的盛夏，溫度偏高，雨水偏多，因而試驗期間天氣變化較大。
[0048](2)田間防效:與清水對照相比，兩種真菌的孢子懸乳劑500倍稀釋液噴霧都對茶小綠葉蟬產生一定的控制效果，但以混配劑的效果明顯好于純菌劑，玫煙色擬青霉的最高防效為71.3%。單用含3%吡蟲啉10%可濕性粉劑的礦物油載體的500倍稀釋液噴霧也獲得相當的防效，且防效總是在施用后第一次調查最高，而后大幅下降。將用菌后歷次調查的防效給予平均和排序，結果是玫煙色擬青霉混配劑防效62.1 ±12.2 %，其次是含微量吡蟲啉的礦物油50.3±14.3%和玫煙色擬青霉純菌劑，僅有防效19.0±23.2%。
[0049]最后所應說明的是，以上實例僅用于說明而非限制本發明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解:依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
[0050]表1:3種不同接菌方法處理后小菜蛾幼蟲的死亡率
[0051]
【權利要求】
1.玫煙色擬青霉菌株，其于2013年8月13日保藏在中國微生物菌種保管管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為7993。
2.玫煙色擬青霉的菌種培養方法，其特征在于:(I)斜面種子培養，斜面菌種培養基為改良式 PDA:20%馬鈴薯，2%蔗糖，0.2%蛋白胨，0.1% K2HPO4.3H20,0.3% NaNO3,0.05%MgSO4.7Η20，0.05% KC1，0.01% FeSO4, 2%瓊脂，水 1000 毫升；121 攝氏度高壓蒸汽滅菌 30分鐘；試管接種后放置26攝氏度恒溫培養10天備用；(2)液體種子培養，培養基:改良式PDA (去瓊脂)；將其裝入500毫升三角瓶，每瓶裝100毫升，121攝氏度高壓蒸汽滅菌30分鐘；接入試管斜面菌種(每支接兩瓶)，放置搖床(180轉/分鐘)26攝氏度培養60小時備用。
3.玫煙色擬青霉的固體培養方法，其特征在于:按固體培養基配比稱取原料，加1.2倍水充分拌勻，過夜后121攝氏度高壓蒸汽滅菌30分鐘備用。
4.根據權利要求3所述的玫煙色擬青霉的制備方法，其特征在于:固體培養基為70%麥麩+30%米糠。
5.玫煙色擬 青霉菌株，其特征在于所述玫煙色擬青霉菌株在防治刺吸式口器害蟲中的應用。
【文檔編號】C12N1/14GK104073440SQ201310646232
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年12月6日 優先權日:2013年12月6日
【發明者】陳曉燕, 梁小文, 王根豪, 周立峰, 李肖宇, 馬忠巖, 肖筱成, 錢鳳, 蘆茜 申請人:江西天人生態股份有限公司