一種檢測稀有缺失型地中海貧血的引物組和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種檢測稀有缺失型地中海貧血的引物組和試劑盒。可直接用于國內11種已知稀有缺失型地中海貧血進行快速、穩定的檢測。本發明的用于檢測稀有缺失型地中海貧血的引物組，包括引物組A和引物組B；所述引物組A包括檢測α-地貧缺失基因型的12條引物，所述引物組B包括檢測β-地貧缺失基因型的10條引物。本發明試劑盒可采用多重Gap-PCR技術對11種稀有缺失基因型進行檢測，可以直接一次檢測多達11種稀有缺失地貧基因型，較在產前診斷利用巢式PCR結合遺傳分析操作簡單、省時、節約成本，為更全面的進行地貧篩查創造條件，為婚前、產前檢測和孕期胎兒的地中海貧血診斷提供科學的依據。
【專利說明】一種檢測稀有缺失型地中海貧血的引物組和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及ー種檢測稀有缺失型地中海貧血的引物組和試劑盒。
【背景技術】
[0002]地貧是世界上最常見的人類單基因遺傳血液病之一，被世界衛生組織列入危害人類健康的6種常見病，也是中國南方各省最常見、危害最大的遺傳病。
[0003]a -地中海貧血(Thalassemia，以下簡稱a -地貧)，是ー組因a -珠蛋白鏈合成減少或不能合成，a-鏈/非a-鏈比例失衡為特征的遺傳溶血性血紅蛋白病。我國最常見的缺失類型為-03.7、-04.2、-SEA3種，隨著a-地中海貧血機制的進ー步闡明，一些新的基因缺失類型相繼被發現，例一11.1、-FIL、一THA1、- a 27.6、- a 2.4、- a 2.8，--11.1 -FIL, -THAI 均是缺失了兩個a基因，當與--SEA結合時可產生一定量的HbBarts，而-a27.6、-a2.4、-a2.8均是缺失了ー個a基因，當這些基因型結合--SEA時，會引起Hb H病，這些新缺失類型的發現說明我國a-地貧有較廣的基因譜，對目前地貧基因缺陷的篩查有重要的補充作用，提醒我們要避免異常基因型的漏檢。
[0004]β-地中海貧血(簡稱0 -地貧)是位于11號染色體末端llpl5.3位點上的人 β- 珠蛋白基因(HBB)的先天性遺傳缺陷。β-缺陷的后果是珠蛋白肽鏈合成減少或缺如，
導致Hb生成障礙，而產生溶血性貧血。β-地貧主要是因點突變(或少數幾個核苷酸的插入或缺失)使β-珠蛋白肽鏈合成障礙(減少或缺如)所致。此外，由于β-珠蛋白基因簇的大片段缺失而導致的遺傳性持續性胎兒血紅蛋白綜合征(hereditary persistence offetal hemoglobin, HPFH)和δβ-地中海貧血(簡稱δβ-地貧)在中國人群中也占有相當的比例，其共同特征是基因發育階段特異性表達失控而使出生后胎兒血紅蛋白(fetalhemoglobin, HbF)持續增高,是ー組遺傳異質性很大的血紅蛋白病。
[0005]目前世界上在不同種族中已報道了至少40種此類因P -珠蛋白基因簇的大段缺
失而引起的血紅蛋白病，中國人群中最常見的類型是βChinese(AYδβ)0(中國型)、βSEAβ0 (東南亞型，SEA)、βThai(AYδβ)0 (泰國型)，另外 βTunnanese(AYδβ)0(云南型)、βCatonese(AYδβ)0(廣東型)、βTaiwanese(AYδβ)0(臺灣型)也有報道。缺失型β -地貧雜合子與β -地貧點突變雜合子婚配后，有生育缺失突變復合β -地貧點突變患兒的風險，此類雙重雜合子患兒多表現為中間型或重癥β -地貧，也是需要重點預防的類型。缺失型β -地貧具有特異的表型，在臨床上較易被發現，但目前暫時沒有相關的基因檢測試劑盒上市，給產前診斷帶來一定困難，因此，開展并推廣缺失型β -地貧的表型篩查和基因診斷技術，有助于我國β -地貧高發區產如診斷水平的進一步提尚。
[0006]目前，地貧還沒有效的根治方法，主要以預防為主。因此開展稀有缺失型地貧的檢測，提早發現地貧異常基因的攜帯者，對指導婚前及產前診斷具有重要的意義。
[0007]1、現有地貧檢測技術簡介:
[0008](1) Southern印跡雜交-限制性酶譜分析法:曾是a -地貧基因診斷的主要方法，但由于操作繁瑣，所需時間較長，一般只適合研究使用，不適于臨床的推廣應用；(2)RFLP (限制性片段長度多態性)連鎖分析:其先決條件是在該家庭中至少有ー個患兒或一個正常兒，以前是P地貧產前診斷最常用的方法，限制性片段長度的差異反應了各種基因型的差異，是ー種間接測試法，對部分家系不能診斷，且操作比較繁瑣；(3)寡核苷酸探針技木:這ー技術可快速簡便地檢測已知突變的地貧基因，具有很高的靈敏性和準確性，但ー次雜交只能檢測ー種突變，而且還需要同位素探針，難以推廣應用；(4)依賴探針連接擴增技術(MLPA):MLPA能對所有的缺失基因型檢測以及未知的基因型開展檢測，具有聞效、特異的特點，常用于a、(6-地貧大片段缺失基因型的檢測，但由于檢測成本高，操作繁瑣，耗時較長，檢測流程長達16小時，且需要特殊的儀器設備，一般只用于研究使用，不便于分子篩查方法的推廣應用；(5)測序技術:測序技術直接對DNA序列的分析，一直被認為是臨床檢測的金標準；目前測序技術面臨著標本的處理(核酸提取)擴增標準化認證問題，信號檢測、測序平臺特異的出錯和糾錯問題，以及生物信息學方面可能出現的問題，臨床驗證程序和標準化問題等，一直沒有有效的解決，因此還未能在臨床中推廣應用；(6)反向斑點雜交(Reverse Dot Blot, RDB)法:這ー方法具有靈敏度高、特異性好和準確性高等優點，目前已廣泛應用于a、(6-地貧點突變的臨床產前診斷和基因診斷。這種方法靈敏，但耗時較長，一般用于點突變檢測；(7)實時熒光定量PCR (Taqman探針法):實時熒光定量PCR是目前臨床診斷系統最受歡迎的檢測平臺。在地中海貧血檢測中，報道的均只局限于ー種基因型的檢測，工作量大，由于探針需要進行熒光標記，檢測成本高；(8) Gap-PCR及其改進的技木:由于其易操作，此技術廣泛用于缺失地貧的分子診斷，在缺失區域兩端設計ー對引物，正常情況下兩引物擴增 產物很長不屬于擴增的范圍，而出現缺失區域的時候能出現特異性的擴增。目前市場上以Gap-PCR開發的試劑盒只能檢測中國最常見的3種缺型-a3.7、-a4.2和」'而不能檢測一11_1、--^--1^1、-027_6、-02_4、-02_8等非常見的0-地貧缺失基因型
和 3 Chinese (A Y中國型)、^ SEABO (東南亞型，gEA ) > &5@)° (泰國型)、^ Y—…5
(云南型)、^TaiWaneSe0°(臺灣型)等P -地貧缺失基因型。
[0009]2、現有產品及專利:
[0010]盡管檢測地貧的方法和產品很多，但是目前尚未有直接、快速、同時檢測多種稀有缺失型地貧的產品。本公司相關專利為《診斷a-地中海貧血的核酸膜條及試劑盒》(專利號為ZL200710074203.5)、《用于診斷P -地中海貧血的核酸雜交膜條及試劑盒》(專利號為ZL200510034015.0)和《a和0地中海貧血基因檢測的核酸膜條及試劑盒》(專利號為ZL201210494748.2)，這些專利和本申請發明專利不屬于同一個技術平臺，與本申請發明專利相關的已經公開或者有權的專利相關統計對比如下，見表1。
[0011]表1與本申請專利相關的已經公開或者有權的部分專利
[0012]
【權利要求】
1.用于檢測稀有缺失型地中海貧血的引物組，其特征在于，包括引物組A和引物組B; 所述引物組A包括檢測a -地貧缺失基因型的12條引物，所述12條引物的序列分別如下:引物 A1:SEQ ID NO:1 ;引物 A2:SEQ ID NO:2 ;引物 A3:SEQ ID NO:3 ;引物 A4:SEQID NO:4 ;引物 A5:SEQ ID NO:5 ;引物 A6:SEQ ID NO:6 ;引物 A7:SEQ ID 勵:7;引物八8:SEQ ID NO:8 ;引物 A9:SEQ ID NO:9 ;引物 AlO:SEQ ID NO:10 ;引物 All:SEQ ID NO:11 ；引物 A12:SEQ ID NO:12 ； 所述引物組B包括檢測P -地貧缺失基因型的10條引物，所述10條引物的序列分別如下:引物 B1:SEQ ID NO:13 ;引物 B2:SEQ ID NO:14 ;引物 B3:SEQ ID NO:15;引物 B4:SEQ ID NO:16 ;引物 B5:SEQ ID NO:17 ;引物 B6:SEQ ID NO:18 ;引物 B7:SEQ ID NO:19 ；引物 B8:SEQ ID NO:20 引物 B9:SEQ ID NO:21 ;引物 BlO:SEQ ID NO:22。
2.一種用于檢測稀有缺失型地中海貧血的試劑盒，其特征在干，包括PCR反應液A和PCR反應液B，所述PCR反應液A包含如權利要求1所述的引物組A，所述PCR反應液B包含如權利要求1所述的引物組B。
3.根據權利要求2所述的用于檢測稀有缺失型地中海貧血的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液A還包括dNTP、taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反應緩沖液、PCR增強劑組合，所述PCR反應液B還包括dNTP、taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反應緩沖液、PCR增強劑，所述PCR增強劑組合包括5XQ Solution和Surfactin。
4.根據權利要求2所述的用于檢測稀有缺失型地中海貧血的試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應液A各組分含量為:
5 X Q Solution:5 u L ；`
10XCoralLoad PCR Buffer:2.5 u L ；
2.5mM dNTP:2.0u L ；
25u M Surfactin:1.0 u L;
IOOii M 弓丨物 Al:0.051 u L ；
IOOiiM 弓丨物 A2:0.052u L ；
IOOiiM 弓丨物 A3:0.05u L ；
IOOiiM 引物 A4:0.05u L ；
IOOiiM 弓丨物 A5:0.047 u L ；
IOOiiM 引物 A6:0.049 u L ；
IOOiiM 弓 I物 A7:0.035u L ；
IOOiiM 引物 A8:0.038u L ；
IOOiiM 引物 A9:0.04u L ；
IOOiiM 引物 AlO:0.037u L ；
IOOiiM 引物 All:0.05u L ；
IOOiiM 引物 A12:0.05u L ；
5U/u L Hotstar-Taq DNA polymerase:0.5 U L ； 去尚子水:9.451 u L0
5.根據權利要求2所述的用于檢測稀有缺失型地中海貧血的試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應液B各組分含量為:.5X Q Solution:5.0u L ;IOXCoralLoad PCR Buffer:2.5u L ；.2.5mM dNTP:2.0u L ；.25 u M Surfactin:1.0 u L;IOOiiM 弓丨物 BI:0.03u L ；IOOiiM 引物 B2:0.03u L ；IOOiiM 引物 B3:0.033u L ；IOOiiM 引物 B4:0.035u L ；IOOiiM 引物 B5:0.028u L ；IOOiiM 引物 B6:0.028u L ；IOOiiM 引物 B7:0.036u L ；IOOiiM 引物 B8:0.033u L ； IOOiiM 引物 B9:0.04u L ；IOOiiM 引物 BlO:0.043 u L ；.5U/u L Hotstar-Taq DNA polymerase:0.5 U L ；去尚子水:9.664 u L0
【文檔編號】C12Q1/68GK103602752SQ201310656450
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年12月6日 優先權日:2013年12月6日
【發明者】李印淑, 劉福平, 劉晶晶, 任維 申請人:亞能生物技術（深圳）有限公司