雞隱性白基因的快速鑒定方法
【專利摘要】本發明提供了一種雞隱性白基因的快速鑒定方法，包括以下步驟：步驟（1）提取待鑒定雞的基因組DNA；步驟（2）以所述基因組DNA為摸板，用引物F1、引物F2、引物R1和引物R2組成的引物組合物進行PCR擴增反應，得到PCR擴增產物；F1引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，F2引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示，R1引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示，R2引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示；步驟（3）將所述PCR擴增產物進行電泳，依據電泳圖譜中出現的條帶數及大小判定基因分型的結果。本發明能夠快速、準確地鑒定出隱性白羽基因，達到縮短育種時間的目的。
【專利說明】雞隱性白基因的快速鑒定方法
【技術領域】[0001]本發明涉及一種基因的分子鑒定方法，具體地，涉及一種雞隱性白基因的快速鑒定方法。
【背景技術】
[0002]家禽的羽色種類很多，羽色是一個品種的重要特征，我國家禽品種審定條例把穩定一致的羽毛特征作為品種審定的基本條件之一。我國肉雞產業經過幾十年的發展，已經進入了一個由量變到質變的關鍵時期，中國消費者不喜歡白羽雞，中國本地優質黃羽肉雞越來越受到消費者的青睞。在20世紀90年代，我國大量從國外引進隱性白羽雞，主要用于與國內的雞種進行配套，以三元雜交為主的方式生產優質黃羽肉雞。
[0003]白羽分為二類，顯性白羽和隱性白羽，其中TYR基因(酪氨酸酶基因)控制的隱性白羽是其中一種。TYR基因是一種含銅的氧化還原酶，在黑色素合成的起始過程中的一種關鍵的起催化作用的限速酶。隱性白羽的形成是因為在TYR基因的第四內含子插入了 7.7kb的內源白血病病毒，從而抑制了羽毛中的色素沉著。隱性白羽基因是白化基因的復等位基因，而非隱性白羽雞是缺失了這7.7kb片段的純合型或雜合型。
[0004]隱性白羽雞在優質雞配套上的應用對我國優質雞產業的發展起到了巨大的推動作用。羽色雖為質量性狀，但遺傳較為復雜，傳統的育種方法是根據雜交后代雞的表型性狀留種，進行測交檢測，繁殖擴群等步驟，需要一個較長的過程，為了適應市場的快速變化，縮短育種時間，本方法嘗試建立一種可以快速鑒定隱性白羽基因的方法，從而達到縮短育種時間的目的。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服上述現有技術存在的不足而提供一種雞隱性白基因的快速鑒定方法，本發明能夠快速準確地鑒定出隱性白羽基因，達到縮短育種時間的目的。
[0006]本發明的目的通過以下技術方案實現，一種雞隱性白基因的快速鑒定方法，包括以下步驟:
[0007]步驟(1)提取待鑒定雞的基因組DNA ；
[0008]步驟(2)以所述基因組DNA為摸板，用引物F1、引物F2、引物Rl和引物R2組成的引物組合物進行PCR擴增反應，得到PCR擴增產物；F1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，F2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，Rl引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，R2引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0009]步驟(3)將所述PCR擴增產物進行電泳，依據電泳圖譜中出現的條帶數及大小判定基因分型的結果:如果得到592bp和891bp兩條PCR產物，樣本為隱性白羽基因純合子；如果僅得到460bp的PCR產物，樣本為非隱性白羽基因純合子；如果同時得到592bp、891bp和460bp的PCR產物，樣本為非隱性白羽基因雜合子。
[0010]優選的，所述基因組DNA的提取過程具體如下:雞翅靜脈采血2ml，4000r/min離心，倒掉上部黃色血清，底部即為紅細胞；取ΙΟμ I所述紅細胞加入470 μ I細胞裂解液、10 μ I質量體積百分比為10%的SDS和10 μ I濃度為10mg/ml的蛋白酶K，所述細胞裂解液由 0.lmol/L NaClUOmmol/L Tris-Cl 和 ρΗ8.0 的 IOOmmoI/L EDTA 組成，55°C空氣浴搖床過夜；再加入500 μ I Tris飽和酹,上下顛倒lOmin, 10000r/min離心IOmin,吸取上層水置于另一個EP管中；在吸得的上層水中加入等體積的Tris飽和酚、氯仿、異戊醇混合液，所述酹、氯仿和異戍醇的體積比為24:23 然后上下顛倒lOmin, 10000r/min離心IOmin,吸取上層水置于另一個EP管中；加入等體積的氯仿、異戊醇混合液，所述氯仿和異戊醇的體積比為23:1，然后上下顛倒lOmin，10000r/min離心lOmin，吸取上層水至于另一個EP管中；加入2倍體積的_2(TC預冷的無水乙醇,橫向劇烈震蕩3min, 10000r/min離心10min,EP管管底可見白色DNA沉淀，倒掉上清無水乙醇；加入Iml體積比為70%的乙醇，懸浮、洗滌DNA沉淀，8000r/min離心5min,倒掉乙醇,8000r/min離心15s,吸去乙醇,將EP管倒置在濾紙上直至管中的乙醇完全蒸發掉；加50 μ I雙蒸水，置55°C水浴中至DNA完全溶解，即得。
[0011]優選的，步驟(2)中，所述PCR擴增反應的條件為:94°C 5min ;然后94°C 30s，55°C 30s, 72°C 55s，30 個循環；最后 72°C IOmin0
[0012]優選的，步驟(3)中，所述電泳的具體過程如下:取5μ I PCR所述擴增產物，采用1%的瓊脂糖凝膠120V電泳15min。
[0013]與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果:本發明的方法中僅有4條引物，但組成了 3對，其中F1R2和F2R1是用于檢測隱性白羽等位基因，FlRl用于檢測有色羽等位基因，F1R2目的片段長度為891bp，F2Rl目的片段長度為592bp，FlRl目的片段長度為460bp，如果得到592bp和891bp兩條PCR產物，樣本為隱性白羽基因純合子；如果僅得到460bp的PCR產物，樣本為非隱性白羽基因純合子；如果同時得到592bp、891bp和460bp的PCR產物，樣本為非隱性白羽基因雜合子。因此，對于隱性白羽基因純合子的鑒定起到了雙重作用，更加確保鑒定結果的準確性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯:
[0015]圖1是本方法的PCR擴增產物的電泳結果圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。
[0017]本實施例涉及一種雞隱性白基因的快速鑒定方法，包括以下步驟:
[0018]步驟(1)提取待鑒定雞的基因組DNA
[0019]雞翅靜脈采血2ml (采血前用496EDTA潤濕注射器管壁)，4000r/min離心，倒掉上部血清(黃色)，底部即為紅細胞，取10 μ I紅細胞加入470 μ I細胞裂解液(0.lmol/L NaCl,I Ommo I/L Tris-Cl, 100mmol/L EDTA ρΗ8.0)、10μ1 SDS( 10%)和 10 μ I 蛋白酶 K( 10mg/ml)，55°C空氣浴搖床過夜；加500 μ I Tris飽和酹,上下顛倒lOmin, 10000r/min離心IOmin,小心吸取上層水置于新的EP管中，在吸得的上層水中加入等體積的酚、氯仿、異戊醇(體積比為24:23:1)混合液，上下顛倒10min，10000r/min離心lOmin，小心吸取上層水置于另一個EP管中；加入等體積的氯仿、異戊醇(體積比為23:1)混合液，上下顛倒lOmin，1000Or/min離心lOmin，小心吸取上層水至于另一個EP管中；加2倍體積無水乙醇(_20°C預冷)，橫向劇烈震蕩3min, 10000r/min離心lOmin,管底可見白色DNA沉淀,小心倒掉上清無水乙醇；加入lml70%乙醇,懸浮、洗漆DNA沉淀,8000r/min離心5min,倒掉乙醇；8000r/min離心15s，用吸管小心吸去乙醇，將EP管倒置在濾紙上直至管中的乙醇完全蒸發掉；加50 μ I雙蒸水，置55°C水浴中至DNA完全溶解，IOmin即可獲得基因組DNA原液；
[0020]步驟(2)以基因組DNA為摸板，用Fl引物、F2引物、Rl引物、R2引物組成的引物組合物進行PCR擴增反應，從而得到PCR擴增產物，各個引物的核苷酸序列如下:
[0021]Fl 引物:如 SEQ ID NO:1 所示；
[0022]F2 引物:如 SEQ ID NO:2 所示；
[0023]Rl 引物:如 SEQ ID NO:3 所示；
[0024]R2 引物:如 SEQ ID NO:4 所示；
[0025]PCR 反應體系(25 μ I ^nT=Premix Taq 12.5 μ 1，引物 I μ 1*4，DNA 模版 I μ 1，水
7.5 μ 1，合計 25μ I ；
[0026]PCR 擴增反應的條件為:94°C 5min;然后 94°C 30s，55°C 30s, 72°C 55s，30 個循環；最后 72 °C IOmin ；
[0027]步驟(3)取5 μ I PCR上述擴增產物，采用1%的瓊脂糖凝膠120V電泳15min，依據電泳圖譜中出現的條帶數及大小判定基因分型的結果:通過在插入病毒的前后端設計4條引物(3對)，其中F1R2和F2R1是用于檢測隱性白羽等位基因，FlRl用于檢測有色羽等位基因，F1R2目的片段長度為891bp，F2R1目的片段長度為592bp，FlRl目的片段長度為460bp，如果得到592bp和891bp兩條PCR產物，樣本為隱性白羽基因純合子(aa);如果僅得到460bp的PCR產物，樣本為非隱性白羽基因純合子(AA);如果同時得到592bp、891bp和460bp的PCR產物，樣本為非隱性白羽基因雜合子(Aa)，如圖1所示。
[0028]以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員·可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發明的實質內容。
【權利要求】
1.一種雞隱性白基因的快速鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟(1)提取待鑒定雞的基因組DNA ； 步驟(2)以所述基因組DNA為摸板，用引物F1、引物F2、引物Rl和引物R2組成的引物組合物進行PCR擴增反應，得到PCR擴增產物；F1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，F2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，Rl引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，R2引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 步驟(3)將所述PCR擴增產物進行電泳，依據電泳圖譜中出現的條帶數及大小判定基因分型的結果:如果得到592bp和891bp兩條PCR產物，樣本為隱性白羽基因純合子；如果僅得到460bp的PCR產物，樣本為非隱性白羽基因純合子；如果同時得到592bp、891bp和460bp的PCR產物，樣本為非隱性白羽基因雜合子。
2.根據權利要求1所述的雞隱性白基因的快速鑒定方法，其特征在于，所述基因組DNA的提取過程具體如下:雞翅靜脈采血2ml，4000r/min離心，倒掉上部黃色血清，底部即為紅細胞；取10 μ I所述紅細胞加入470 μ I細胞裂解液、10 μ I質量體積百分比為10%的SDS和10 μ I濃度為10mg/ml的蛋白酶K,所述細胞裂解液由0.lmol/L NaCl、10mmol/L Tris-Cl和pH8.0的100mmol/L EDTA組成，55°C空氣浴搖床過夜；再加入500 μ I Tris飽和酚，上下顛倒lOmin，10000r/min離心lOmin，吸取上層水置于另一個EP管中；在吸得的上層水中加入等體積的Tris飽和酚、氯仿、異戊醇混合液，所述酚、氯仿和異戊醇的體積比為24:23:1，然后上下顛倒10min，10000r/min離心lOmin，吸取上層水置于另一個EP管中；加入等體積的氯仿、異戊醇混合液，所述氯仿和異戊醇的體積比為23:1，然后上下顛倒lOmin，10000r/min離心lOmin，吸取上層水至于另一個EP管中；加入2倍體積的_20°C預冷的無水乙醇，橫向劇烈震蕩3min，10000r/min離心lOmin，EP管管底可見白色DNA沉淀，倒掉上清無水乙醇；加入Iml體積比為70%的乙醇，懸浮、洗滌DNA沉淀，8000r/min離心5min，倒掉乙醇，8000r/min離心15s，吸`去乙醇，將EP管倒置在濾紙上直至管中的乙醇完全蒸發掉；加50 μ I雙蒸水，置55°C水浴中至DNA完全溶解，即得。
3.根據權利要求1所述的雞隱性白基因的快速鑒定方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴增反應的條件為:94°C 5min ;然后94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 55s, 30個循環；最后72°C IOmin。
4.根據權利要求1所述的雞隱性白基因的快速鑒定方法，其特征在于，步驟(3)中，所述電泳的具體過程如下:取5μ I PCR所述擴增產物，采用1%的瓊脂糖凝膠120V電泳15min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667486SQ201310659568
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】湯琳琳 申請人:上海市農業科學院