一種牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應用。本發明所述引物組合物由引物組A和引物組B組成，所述引物組A由引物1和引物2組成，所述引物組B由引物3和引物4組成；引物1～引物4的核苷酸序列分別如SEQIDNO.1～4所示。本發明還提供了包含所述引物組合的試劑盒，本發明試劑盒應用于牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的方法如下：提取牛血液中的全組DNA作為模板，進行巢式PCR（NestedPCR）擴增，所得PCR產物進行測序，根據測序結果可直接了解突變位點的堿基變化，確保了結果的準確性，滿足快速、精準、高通量等特點的檢測技術的需求。
【專利說明】一種牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】。更具體地，涉及一種牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應用。
【背景技術】
[0002]隨著人工授精和胚胎移植技術的推廣和應用，奶牛優秀種質(胚胎、精液、種牛)在全球范圍內的廣泛應用，在顯著提高遺傳性能的同時，加速了牛隱性遺傳疾病對牛群的危害。特別是一頭優秀的種公牛一生可以生產幾十萬劑甚至上百萬劑冷凍精液，如果攜帶隱性遺傳缺陷基因，有可能在全世界范圍內快速蔓延，給畜牧業的生產帶來巨大的經濟損失。我國主要從美國、加拿大、德國、澳大利亞、新西蘭和烏拉圭等國進口大量奶牛優秀種質，進口時檢疫重點在于防止動物傳染病和寄生蟲病的傳入，卻沒有包括防止牛遺傳缺陷的檢疫要求，所以存在的牛遺傳性缺陷攜帶者進入我國的風險。
[0003]遺傳缺陷病是生殖細胞或受精卵內的遺傳物質發生基因突變和染色體畸變導致的，從而使發育個體出現解剖結構上的異常或生理機能上的損害，常常導致某些器官的損害，形成畸形，影響生產性能，甚至導致死亡。具有先天性和家族性的特征。遺傳缺陷性病分為常染色體遺傳缺陷病和性染色體遺傳缺陷病，其中常染色體遺傳缺陷病根據致病原因又分為單基因遺傳缺陷病、多基因遺傳缺陷病和染色體畸變遺傳缺陷病三種，性染色體遺傳缺陷較少見。常染色體單基因遺傳缺陷病是由一對等位基因控制的，隱性有害基因攜帶者表型正常，兩個親本都為攜帶 者時，后代有1/4可能出現隱性純合子，即表型為患病，1/2可能為隱性雜合子，即為有害基因攜帶者。
[0004]瓜氨酸血癥(Citrullinemia，CN)是荷斯坦牛尿素循環發生代謝紊亂的一種常染色體單基因隱性遺傳缺陷病。該病最早于1986年在澳大利亞的荷斯坦牛群中發現(Harper等，1986)。病牛出生時表現正常，但不久后出現精神沉郁、步態紊亂、驚厥、失明等癥狀，一般出生后5 d死亡，死亡率100%。瓜氨酸血癥(CN)遺傳學基礎是由奶牛第11號染色體(BTAll)上的編碼精氨酸琥拍酸合成酶的ASS基因(Argininosuccinate synthetase, ASS)第5外顯子發生C — T的點突變，使密碼子CGA轉變為終止密碼子TGA，從而其翻譯產物精氨酸琥珀酸合成酶變成了截短了的85個氨基酸的蛋白質(正常為412個氨基酸)，而失去精氨酸琥珀酸合成酶活性。導致瓜氨酸不能轉變為精氨酸琥珀酸而大量積蓄于組織及血液中，從而造成尿素循環發生代謝障礙，進而導致血清淀粉酶過高。患病牛主要癥狀為血液中瓜氨酸含量升高，尿素循環受阻引起高氨血癥，導致出生后一周內死亡。
[0005]根據這一突變位點，目前主要有PCR-RFLP和AS-PCR兩種方法檢測瓜氨酸血癥(CN)。PCR-RFLP方法是在突變點處設計酶切位點，對PCR產物進行酶切，根據酶切結果判斷是否具有酶切位點用以判斷是否含有突變點，但該方法引入錯配堿基后，PCR的擴增效率會受到影響，另外存在假陽性的可能。AS-PCR方法根據突變位點設計特異的引物，其中一條鏈與突變位點的一種堿基狀態互補，另一條鏈按常規方法進行設計，特異引物在一種基因型中有擴增產物，在另一種基因型中沒有擴增產物，根據擴增產的有無，從而確定是否有喊基的突變，但是該方法有時會引起在引物的3’末端的喊基與|吳板的喊基不互補的情況下，延伸仍然可以進行，容易造成結果的誤判。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是克服現有牛瓜氨酸血癥有害基因檢測檢測技術的不足，提供一種牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物。
[0007]本發明要解決的另一技術問題是提供一種牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的試劑盒。
[0008]本發明還有一要解決的技術問題是提供所述引物組合物和試劑盒的應用。
[0009]本發明上述目的通過以下技術方案實現:
本發明提供了一種新的引物組合物，為牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物，由引物組A或引物組B組成；所述引物組A由引物I和引物2組成；所述引物組B由引物3和引物4組成；引物I~4的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1~4所示。
[0010]所述引物組A為外引物，引物組B為內引物，內引物是設計在外引物擴增的片段上的。
[0011]優選地，所述 牛瓜氨酸血癥有害基因是精氨酸琥珀酸合成酶基因的第86個氨基酸密碼子發生無義突變的基因。
[0012]優選地，引物I和引物2的摩爾比為1: 1，引物3和引物4的摩爾比為1:1。
[0013]本發明提供所述牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物在采用巢式PCR方法檢測牛瓜氨酸血癥有害基因方面的應用。
[0014]本發明同時提供一種含有所述牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物的試劑盒。
[0015]在所述試劑盒中，優選地，所述引物組A或引物組B為完整獨立包裝。
[0016]優選地，所述試劑盒，包含有如下組分:本發明所述牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物、DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、dNTP和滅菌水。
[0017]優選地，所述試劑盒除了包含所述牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物，還包含有 Pfu DNA Polymerase 酶(2.5U/ul)和 IOXPfu Buffer、dNTP Mixture (2.5 mmol /L)，以及 ddH20。
[0018]本發明同時提供所述試劑盒在檢測牛瓜氨酸血癥有害基因方面的應用。
[0019]本發明牛瓜氨酸血癥有害基因檢測方法是利用巢式PCR方法進行兩次PCR反應，第一次PCR反應的模板為牛血液中的全組DNA，引物為引物組A ;第二次PCR反應的模板為第一次PCR反應產物的稀釋液(無菌水稀釋)，引物為引物組B ;對PCR產物進行測序，根據測序結果檢測牛瓜氨酸血癥有害基因。
[0020]優選地，所述第一次PCR反應擴增得到精氨酸琥珀酸合成酶基因的一個420bp的片段，如SEQ ID N0.5所示；第二次PCR反應擴增得到精氨酸琥珀酸合成酶基因的一個162bp的片段，如SEQ ID N0.6所示；根據測序結果檢測牛瓜氨酸血癥有害基因具體方法為根據測序圖查看精氨酸琥珀酸合成酶基因的第86個氨基酸密碼子是否發生無義突變。如果測序圖中該位點為單峰C，則為非瓜氨酸血癥有害基因；該位點為雙峰，同時含有C和T，則為牛瓜氨酸血癥有害基因；該位點為單峰T,則為牛瓜氨酸血癥患者。[0021]優選地，所述第一次PCR反應的擴增體系中各組分的比例:引物1:引物2: PCR反應緩沖液:dNTP: DNA聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10:1: 73 ;
優選地，第二次PCR反應的擴增體系中各組分的比例:引物3:引物4: PCR反應緩沖液:dNTP: DNA 聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10:1: 73。
[0022]本發明具有以下有益效果:
本發明科學設計一組新的引物組合物，具有優良的擴增特異性，擴增效率高，有效避免假陰性的結果，應用于檢測牛瓜氨酸血癥(CN)有害基因準確性高。
[0023]本發明同時提供了檢測牛瓜氨酸血癥(CN)有害基因的方法，創造性地研究牛的基因，根據牛的基因組較大的特點，總結出兩次的巢式PCR檢測方法，通過兩次PCR，避免了現有技術只通過一次PCR，由于DNA模板的濃度和純度的關系，擴增效率不高，而且容易發生錯誤片段的問題。而且第二次PCR反應出現引物配對在錯誤片段上并擴增的概率極低。
[0024]本發明最終結果的判定是通過測序進行，可直接測出突變位點的堿基變化，進一步確保了結果的準確性。
[0025]本發明克服了現有技術所需要的凝膠電泳等繁瑣操作，本發明具有快速、精準、高通量的優點，為檢測牛瓜氨酸血癥(CN)有害基因提供了有力的技術基礎，并特別適用于進出口貿易中對牛瓜氨酸血癥(CN)有害基因的檢測技術需求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1為非瓜氨酸血癥有害基因攜帶者(正常型)奶牛ASS基因測序圖，箭頭處為突變位點。
[0027]圖2為瓜氨酸血癥有害基因攜帶者奶牛ASS基因測序圖，箭頭處為突變位點。
[0028]圖3為CN基因均一化的HRM溫度變化圖。
[0029]圖4為CN基因的HRM差異視圖。
【具體實施方式】
[0030]以下結合附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、設備和方法為本【技術領域】常規試劑、設備和方法。
[0031]本發明實施例所用Pfu DNA Polymerase 酶(2.5U/ul)和 IOXPfu Buffer、dNTPMixture (2.5 mmol/L),均購自天根生物科技有限公司。
[0032]實施例1制備篩查牛瓜氨酸血癥的巢式PCR反應試劑盒 1、引物設計
根據NCBI上ASS基因序列(GenBank: AC_000168)結合本發明整體思路不斷分析、總結和調整引物的設計，最終根據牛第11號染色體(BTAll)上的編碼精氨酸琥珀酸合成酶的ASS基因(Argininosuccinate synthetase, ASS)第5外顯子發生C —T的點突變，設計了一種檢測牛瓜氨酸血癥有害基因的巢式PCR方法，獲得引物1、引物2、引物3和引物4。序列如SEQ ID N0.1~4所示:
引物 1:SEQ ID N0.1:actgcatttt caagaccacc ctg ；
引物 2:SEQ ID N0.2:tctgggcggg aaccaacgat tgtc ；引物 3:SEQ ID N0.3:attgaggaca tcagcaagga g ；
引物 4:SEQ ID N0.4:cacatacttg gctccttctc。
[0033]其中，引物I和引物2為引物組A(外引物)，引物3和引物4為引物組B(內引物)。
[0034]所有引物可以采用合成等常規方法獲得。本實施例引物由上海英駿生物技術有限公司合成。
[0035]以本發明所述引物組和PCR反應相關試劑組成試劑盒。所述引物組是引物組A和引物組B ;所述PCR反應相關試劑為DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、dNTP和滅菌水。
[0036]本實施例以引物組A和引物組B同時使用(巢式PCR反應試劑盒)為例，說明檢測牛瓜氨酸血癥有害基因的試劑盒的制備。
[0037]2、本實施例制備的巢式PCR反應試劑盒包括兩個部分:第一次PCR (外引物)試劑盒和第二次PCR (內引物)試劑盒。
[0038](I)第一次PCR (外引物)試劑盒
試劑盒除了包括外引物(引物I和引物2)，還包括PCR反應試劑:Pfu DNA Polymerase酶(2.5U/ul)、10XPfu Buffer,dNTP Mixture (2.5 mmol/L)、ddH20。PCR 反應的引物 I 為正向引物，引物2為反向引物，正反向引物濃度均為10pmol/L。
[0039]PCR反應體系以25 uL體系為例:引物I和引物2各0.5mL，IOXPfu Buffer
2.5mL、dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2.5mL> Pfu DNA Polymerase 酶(2.5U/ul) 0.25mL、ddH20 18.25mL,剩下的0.5mL體積為模板DNA。即用于第一次PCR反應的試劑混合液中各成分比例為，引物 1:引物 2:1OXPfu Buffer: dNTP Mixture: Pfu DNA Polymerase酶:ddH20=2: 2: 10: 10:1: 7`3。
[0040]實驗時根據體系的總量按比例加入相關成分并混勻，加入模板DNA進行第一次PCR反應。
[0041](2)第二次PCR (內引物)試劑盒:
試劑盒包括外引物(引物3和引物4)，PCR反應的引物3為正向引物，引物4為反向引物，正反向引物濃度均為lOpmol/L。除引物外，其他相關成分和各成分的比例同第一次PCR試劑盒相同。即引物3:引物4:1OXPfu Buffer: dNTP Mixture: Pfu DNA Polymerase酶:ddH20=2: 2: 10: 10:1: 73。
[0042]實驗時根據體系的總量按比例加入相關成分并混勻，以便加入模板DNA進行第二次PCR反應。
[0043]實施例2利用實施例1制備的巢式PCR反應試劑盒檢測奶牛瓜氨酸血癥 1、牛血液中全組DNA的提取
頸靜脈采血法隨機采集江蘇某隔離場243頭荷斯坦奶牛的血液樣本5mL/頭，并置于真空肝素鈉抗凝管中搖勻后用離心管分裝每管2ml，-20°C凍存備用。
[0044]采用Promega Maxwell 16核酸自動提取儀進行血液基因組DNA的提取，使用配套試劑盒(Promega 公司的 AS1010)。Promega 的 AS1010 試劑盒包含 Maxwell 16 Blood DNACartridges、Purification Plungers、Elution Tubes、Elution buffer。操作按試劑盒說明書進行，該儀器啟動后大約每28min可以完成16個樣品DNA的提取。DNA提取完畢后，將其從洗脫管中轉移至離心管(Ep管)中，置于_20°C保存待用。
[0045]經過測定，提取的牛血液全組DNA樣品的濃度為83ng/ μ L。[0046]2、第一次PCR (外引物)反應
以上述抽提得到的DNA為模板，用實施例1中的第一次PCR試劑盒進行擴增。體系為25U L:模板DNA 0.5mL (41.5 ng)、第一次PCR試劑混合物24.5mL (其中包括引物I和引物2各 0.5mL, IOXPfu Buffer 2.5mL、dNTP MixtureC2.5 mmol/L)2.5mL、Pfu DNA Polymerase酶(2.5U/ul) 0.25mL、ddH20 18.25mL)。擴增條件為:94°C 3min，94°C 30s、62.2°C 30s、70°C 15s,30cycles,70°C lmin。
[0047]以無菌水為模板作為陰性對照。
[0048]3、第二次PCR (內引物)反應
取5mL第一次PCR產物稀釋100倍作為第二次PCR反應的模板，用實施例1中的第二次PCR試劑盒進行擴增。體系為50 ii L:模板DNA lmL、第二次PCR試劑混合物49mL。擴增條件為:94°C 3min,94°C 30s,61.2°C 30s,70.4°C 15s, 30 cycles, 70.4°C lmin。
[0049]4、分別對第一次PCR和第二次PCR產物進行測序(測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成)，擴增產物的測序結果用DNAMAN軟件分析，附圖中箭頭所標位點為導致CN的SNP位點。根據測序圖查看牛瓜氨酸血癥有害基因攜帶者突變位點是否有變化，如果測序圖中該位點為單峰C (如圖1所示，箭頭處為突變位點)，則為非瓜氨酸血癥有害基因攜帶者(正常型);如果該位點為雙峰，同時含有C和T (如圖2所示，箭頭處為突變位點)，則為瓜氨酸血癥有害基因攜帶者(雜合子)；如果該位點為單峰T，則為瓜氨酸血癥患者(突變型，篩查中未發現此類)。
[0050]統計結果顯示，243份樣品中，CN正常型238份，CN雜合子5份，CN突變型0份。
[0051]對 比例I利用HRM檢測方法檢測奶牛瓜氨酸血癥
1、材料
(I)試驗樣本:同實施例2，頸靜脈采血法隨機采集江蘇某隔離場243頭荷斯坦奶牛的血液樣本5ml/頭，并置于真空肝素鈉抗凝管中搖勻后用離心管分裝每管2ml，-2(TC凍存備用。
[0052]DNA提取方法同實施例2。
[0053](2)試劑及試劑盒
普通Taq酶試劑盒，購自水源生物科技(上海)有限公司；
Gel extraction kit,購自上海捷瑞生物科技有限公司；
100 bp DNA Ladder Marker，購自水源生物科技(上海)有限公司；
Hot start Taq酶試劑盒,購自水源生物科技(上海)有限公司；
EverGreen Q-PCR Mix，購自水源生物科技(上海)有限公司；
T-載體，購自寶生物(大連)生物工程有限公司；
SYBR GREEN I，購自北京普博欣生物科技有限公司。
[0054](3)主要試劑的配制
電泳緩沖液(50 X TAE貯存液):稱取Tris 242g，冰乙酸57.lmL，加入IOOmL 0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)，定容至1L，用前以蒸餾水稀釋為IX工作液。
[0055]SYBR Green I染料(電泳級)工作液:按1:3的比例配置，取TAE電泳工作緩沖液與 SYBR Green I 染料。
[0056]2、標準質粒的構建采用全基因合成的方法(由上海捷瑞生物科技有限公司合成)，構建CN標準品，突變基因型質粒(T/T型)、野生基因型質粒(G/G型)，再以二者等比例混合做成雜合基因模版(G/T型)。
[0057]3、HRM引物的設計與合成
根據Genbank已發表的CN序列，應用DNAstar軟件設計特異性PCR的引物。引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。具體引物如下:
Fl:5’ - AAGGAGTTTGTGGAGGAGTTCATC-3’ ；
Rl: 5’ -GAGAGGTGCCCAGGAGGTATC-3’。
[0058]引物的產物大小為82bp，退火溫度為60°C。 [0059]4、HRM檢測方法的初步建立
(1)243頭荷斯坦奶牛的血液樣本DNA的基因型的確定方法為，參照標準質粒的曲線形態來確定。
[0060](2)取I μ L各標準質粒的野生和突變的純合性及混合質粒DNA分別做模板，按照如下體系進行PCR擴增。PCR體系為30yL，包括15yL的2XMix buffer、5 μ L的dNTP、上下游引物各0.5 μ LU μ L模板DNA、13 μ L的ddH20。
[0061]反應條件為94°C預變性3min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，40個循環，反應在Roche480熒光定量PCR儀上進行，反應結束后進行HRM分析。HRM分析采用Roche480熒光定量PCR儀，檢測條件為95°C變性lmin，40°C復性lmin，50°C保持IOs,從50°C開始，以0.01°C /s升溫速度采集熔解曲線數據，每秒采集40次數據，至95°C結束熒光米集。
[0062]5、數據分析
采用Roche 480自帶的HRM分析軟件進行分析。首先對原始熔解曲線進行均一化(normalization)，軟件會自動對曲線類型進行分組，具有相同或接近的曲線形態的樣品將被歸為一組，然后通過軟件的差別顯示功能顯出分組的結果。與已知標準質粒同組的樣品即具有該質粒基因類型的基因型。
[0063]結果如附圖3和附圖4所示，CN基因的正常型(T/T)和突變型(C/C) 二者差異明顯。
[0064]統計結果顯示，243份樣品中，CN正常型238份，CN雜合子5份，CN突變型O份。
[0065]結果與本發明巢式PCR方法結合測序的檢測方法所得的結果一致。
[0066]綜上所述，本發明利用巢式PCR方法結合測序檢測牛瓜氨酸血癥有害基因的方法簡單、易操作，且準確性高，適合快速、精準、高通量的檢測技術的需要。
【權利要求】
1.一種牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物，其特征在于，由引物組A和引物組B組成；所述引物組A由引物I和引物2組成；所述引物組B由引物3和引物4組成；引物I~4的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1~4所示。
2.根據權利要求1所述牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物，其特征在于，所述牛瓜氨酸血癥有害基因是精氨酸琥珀酸合成酶基因的第86個氨基酸密碼子發生無義突變的基因。
3.根據權利要求1所述牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物，其特征在于，引物I和引物2的摩爾比為1: 1，引物3和引物4的摩爾比為1:1。
4.權利要求1~3所述牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物在巢式PCR法檢測牛瓜氨酸血癥有害基因方面的應用。
5.一種含有權利要求1~3任一所述牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物的試劑盒。
6.根據權利要求5所述試劑盒，其特征在于，包含有如下組分:權利要求1~3任一所述牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物組合物、DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、dNTP和滅菌水。
7.權利要求5所述試劑盒在檢測牛瓜氨酸血癥有害基因方面的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，檢測方法是利用巢式PCR方法進行兩次PCR反應，第一次PCR反應的模板為牛血液中的全組DNA，引物為引物組A ;第二次PCR反應的模板為第一次PCR反應產物的稀釋液，引物為引物組B ;對PCR產物進行測序，根據測序結果判定是否為牛瓜氨酸血癥缺乏癥有害基因。
9.根據權利8所述應用，其特征在`于，第一次PCR反應擴增得到精氨酸琥珀酸合成酶基因的一個420bp的片段，如SEQ ID N0.5所示；第二次PCR反應擴增得到精氨酸琥珀酸合成酶基因的一個162bp的片段，如SEQ ID N0.6所示；所述判定的方法為根據測序圖查看精氨酸琥珀酸合成酶基因的第86個氨基酸密碼子是否發生無義突變來判斷，如果測序圖中該位點為單峰C,則為非瓜氨酸血癥有害基因；該位點為雙峰，同時含有C和T,則為牛瓜氨酸血癥有害基因。
10.根據權利8或9所述應用，其特征在于，所述第一次PCR反應的擴增體系中各組分的比例為模板:引物1:引物2: PCR反應緩沖液:dNTP: DNA聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10: I: 73 ； 第二次PCR反應的擴增體系中各組分的比例為模板:引物3:引物4: PCR反應緩沖液:dNTP: DNA 聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10:1: 73。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740816SQ201310708022
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】郭霄峰, 吳曉薇, 洪潔心, 代元元 申請人:華南農業大學, 廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心