豬傳染性胃腸炎病毒pr-pcr檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明為一種豬傳染性胃腸炎病毒PR-PCR檢測試劑盒，試劑盒包含RT反應液、陽性對照、陰性對照、DEPC水、2×Taq?PCR?Master?Mix、引物混合液。本發明與現有檢測技術相比具有靈敏度較高、特異性好、方法簡單實用等優點，可用于各種臨床樣品大批量快速檢測豬傳染性胃腸炎病毒的需要。
【專利說明】豬傳染性胃腸炎病毒PR-PCR檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種豬傳染性胃腸炎病毒PR-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，屬于生物檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]豬傳染性腸胃炎病毒(Transmissiblegastroenteritis of swine virus, TGEV)屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，和豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒一樣，是引起仔豬病毒性腹瀉的重要病原之一，可引起豬傳染性胃腸炎(TGE)疾病的發生。TGE是一種急性、高度接觸性傳染病，以嘔吐、嚴重腹瀉、脫水和對2周齡以內新生仔豬的高度致死為特征。TGE目前已在全世界范圍內廣泛發生，不同年齡和不同品種的豬對本病都易感，2周齡的仔豬的死亡率超過90 %，給養豬業造成了巨大的經濟損失。
[0003]豬傳染性胃腸炎病毒的檢測方法包括病毒分離鑒定、免疫熒光抗體、電鏡觀察、RT-PCR、ELISA和膠體金技術等一系列抗原抗體檢測技術，而豬傳染性胃腸炎病毒的細胞分離培養非常困難，而使用免疫熒光抗體技術、用電鏡技術等檢測病毒成本高而且需要特殊儀器，這些技術均不能滿足臨床上快速檢測豬傳染性胃腸炎病毒抗原的需求。由于豬場的豬傳染性胃腸炎病毒隱性感染較為普遍，而臨診對該病毒的確診難度較大，因此，研發一種靈敏度較高、特異性好、方法簡單實用、能直接快速地從豬糞便和腸道樣品中檢測豬傳染性胃腸炎病毒病原的試劑盒，將具大巨大的應用價值。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種豬傳染性胃腸炎病毒PR-PCR檢測試劑盒及其檢測方法。根據GenBank中傳染性胃腸炎病毒基因序列為模板，用軟件Primerf.0設計了一對特異性引物，通過使用RT-PCR的方法，對臨床樣品中的豬傳染性胃腸炎病毒感染情況進行檢測。該試劑盒耗時少，靈敏度高，適用于各種臨床樣品大批量快速檢測豬傳染性胃腸炎病毒的需要。
[0005]為了達到以上目的，本發明采取了以下技術方案:
[0006]一種用于檢測豬傳染性胃腸炎病毒的試劑盒，包含RT反應液、陽性對照、陰性對照、DEPC 水、2XTaq PCR Master Mix、引物混合液。
[0007]所述的RT反應液包含反轉錄酶、RNA酶抑制劑、下游引物P2、IOmM的dNTP、RT緩沖液，幾種組成成份的比例為1:1:2:2: 4，所述RT反應液的最終使用濃度為2X。
[0008]所述的陽性對照為TGEV W株細胞毒，陰性對照為DEPC水。
[0009]所述的引物混合液分別是上游引物Pl:5’-AGACAAACTCGCTATCGCATGG-3’ ；下游引物 P2:5’-TCTTGTCACATCACCTTTACCTGC-3’ 的混合液。
[0010]所述的引物混合液，經PCR反應后能夠擴增出531bp的DNA片段，擴增序列為:[0011 ] AGACAAACTCGCTATCGCATGGTGAAGGGCCAACGTAAAGAGCTTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGGTACTGGACCTCATGCAGATGCCAAATTTAAAGATAAATTAGATGGAGTTGTCTGGGTTGCCAAGGATGGTGC
【權利要求】
1.豬傳染性胃腸炎病毒PR-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內包含RT反應液、陽性對照、陰性對照、DEPC水、2 X TaqPCRMasterMix、弓丨物混合液。
2.權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒PR-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的RT反應液包含反轉錄酶、RNA酶抑制劑、下游引物P2、10mM的dNTP、RT緩沖液，幾種組成成份的比例為1:1:2:2: 4，所述RT反應液的最終使用濃度為2X。
3.權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒PR-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照為TGEVW株細胞毒。
4.權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒PR-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照為DEPC水。
5.權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒PR-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的引物混合液分別是上游引物P1: 5 ’ -AGACAAACTCGCTATCGCATGG-3 ’ ;下游引物P2:5’ -TCTTGTCACATCACCTTTACCTGC-3’ 的混合液。
6.權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒PR-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的引物混合液，經PCR反應后能夠擴增出531bp的DNA片段，擴增序列為:
7.權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒PR-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的PCR 反應條件為:94°C 7min，94°C 30s,56°C 30s,72°C 45s，反應 35 個循環，最后 72°C延伸IOmin0
【文檔編號】C12Q1/68GK103740860SQ201310737800
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】董劍輝, 張志剛, 張文利, 張曉杰, 金忠輝 申請人:北京偉嘉人生物技術有限公司, 湖南農大動物藥業有限公司