用于任何聚合酶延伸活性的靈敏的,定量的聚合酶活性檢測和用于確定活細胞的存在的方法

用于任何聚合酶延伸活性的靈敏的,定量的聚合酶活性檢測和用于確定活細胞的存在的方法
【專利摘要】公開了一種新的，高度靈敏，定量以及快速的DPE-PCR分析方法，可用于例如存在純化或選擇的細胞類型的原核細胞，并且能夠在低于10cfu細菌聯合到珠裂解水平可重復的檢測DNA聚合酶延伸活性。還公開了本發明的DPE-PCR分析方法用于普通檢測微生物的可能性，通過測定包括革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌或念珠菌的微生物平板。進一步，公開了本發明的DPE-PCR分析方法可用于評估細菌細胞生存力，通過可重復的DNA聚合酶延伸活性與cfu指示的增殖之間的強烈相關度而提供。相信本發明公開的分析方法可作為有用的定量工具，廣泛用于藥學、環境，食品和臨床事件的檢測。
【專利說明】用于任何聚合酶延伸活性的靈敏的，定量的聚合酶活性檢 測和用于確定活細胞的存在的方法
[0001] 對相關專利的交叉引用
[0002] 本申請為非-臨時申請，通過引用并入并要求申請日為2012年04月12日，美國 臨時申請61/623, 114的優先權。
[0003] 發明【背景技術】
[0004] 本部分和全文用到的參考文獻編號是指列于"參考文獻"部分的那些文獻。
[0005]DNA聚合酶活性對于基因組復制和生物體在所有生物區傳播是不可缺少的（1^3)。 原核生物包含5種不同類型的DNA聚合酶，但哺乳動物細胞包含15種明顯不同的細胞DNA 聚合酶，但其中僅僅只有4種致力于DNA復制，而其他的則致力于DNA修復和特異的DNA合 成工序，這些都實質上有助于基因完整性的保持。盡管這些酶的大部分涉及細胞核的DNA 修復和復制，但發現于線粒體的DNA聚合酶y(Polg)僅保持DNA聚合酶活性（Hum.Mol. Genet. (Ijuly2005) 14 (13) : 1775-1783)。由于它的這種最初的特性(4)，體外治理DNA聚合 酶活性的能力，使得它成為了分子生物學研宄領域的基本工具(5)。超出它在研宄中業已建 立的重要性，體外DNA聚合酶活性測量可能在制藥和臨床事件中提供大量的有益的應用。 例如，由于細菌的DNA聚合酶正在積極用于新型抗微生物劑的開發(6'7)，能夠快速和靈敏的 測定DNA聚合酶活性的分析方法是必要的。此外，喪失或獲得DNA聚合酶活性與人類疾病 密切相關。例如，DNA聚合酶活性和遺傳畸變之間出現的關聯表明該酶是作為抗癌療法的 靶標(8' 9)。DNA聚合酶活性的缺陷也和線粒體疾病關聯(1(1)。另外，DNA聚合酶活性的測定有 可能作為快速和靈敏的診斷工具，在無菌的給定環境或生物基質中能夠檢測幾乎任何攜帶 活性DNA聚合酶的生物體。
[0006]用于體外測量DNA聚合酶活性最常見的方法取決于放射性標記的核苷酸的摻入 (11)。然而，由于這種方法的固有風險以及放射性同位素相關聯的限制，使得常規使用這種DNA聚合酶測定是不受歡迎的。因此，在過去的幾十年中開發了許多非放射性體外聚合酶 檢測方法。有些方法依賴于DNA聚合酶介導的單鏈結合蛋白（12)或PicoGreen?結合于雙鏈 DNA(13'14)釋放產生的熒光的測量。其他方法依賴于微板耦合及熒光標記的核苷酸檢測 （15)。 最近，基于分子標燈(16)和電化學的（17)DNA聚合酶測定法得到了發展。盡管成功地避免使 用放射性的，但上述方法由于差的靈敏度，小的測定線性動態范圍，或者使用純化聚合酶而 受限制。在過去的五十年，聚合酶活性的體外測定已成為一個重要的分子生物學工具。由 于放射性核苷酸的使用，用于體外測量聚合酶活性的傳統的方法并不理想。已開發基于熒 光的聚合酶分析方法，然而，它們也遭受各種限制。
[0007] 發明概述
[0008] 按照本發明，上述方法的各種限制已經尋找到解決方案，并且提供具有快速，高靈 敏度和定量測定方法，能夠測量來自純化的聚合酶或直接從粗細胞裂解物，或亞細胞器的 聚合酶延伸活性。當用純化的DNA聚合酶進行測試時，該試驗檢測小至2Xl(rnU的酶50 分子），同時展現出優異的線性度（R2= 〇. 992)。低至至少lOcfu加入革蘭氏陽性或革蘭氏 陰性細菌耦合到珠磨機裂解時，也能夠檢測到內源性DNA聚合酶延伸活性，同時保持R2 = 0.999。另外，按照本發明，已經證明，DNA聚合酶延伸活性是細胞生存力的指標，這也由細 胞信號與活細胞計數之間可重復的強烈一致所證實。類似地，通過選擇性樣本細胞制備，完 整的哺乳動物細胞也可以通過DNA聚合酶延伸分析方法來進行定量和生存力評估。總之， 在給定的樣本基質中，在此描述的本發明的新方法對包含活性聚合酶的任何可能細胞或亞 細胞器的靈敏的檢測表現出顯著改進。
[0009] 本發明的發明人對涉及酶的模板生成和擴增（ETGA)方法具有持續的興趣。例如， 美國專利申請序列號13/641480,申請日為2012年10月16日和共同轉讓的提交，描述了 一種涉及這種ETGA方法及其用途的新技術。所述美國序列號為13/641480的這種ETGA方 法的技術范圍在此并不作明確描述，但在此描述和要求保護的發明的完全公開可能是必要 的，上述美國專利申請的全部公開內容通過引入并入本說明書。
[0010] 在此，我們描述了基于耦合到定量PCR讀出器的DNA聚合酶延伸活性測量的改進 的，新的ETGA方法。本文中，通常我們將參照如ETGA，或者如DNA聚合酶延伸偶聯聚合酶鏈 反應（DPE-PCR)的測定方法。樣品制備的變化可以并且將與ETGA和DEP-PCR結合用于具 體的細胞或聚合酶類型的具體應用。
[0011] 附圖簡述
[0012] 圖1顯示由本發明所提供的新的DPE-PCR測定方法的基本概述。DNA聚合酶與包 含預退火Olig〇-1和Oligo-2的底物溫育。37°C下溫育20分鐘DNA聚合酶僅延伸Oligo-1 的3'末端。3ylDNA聚合酶延伸反應混合物隨后被轉到含有尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG) 的熱啟動qPCR反應中。在Taq酶的激活之前和過程中，UDG降解Oligo-2中的脫氧尿苷， 只留下從DNA聚合酶介導的01igo-1延伸而衍生的單鏈產物。Taq酶激活之后，通過引物結 合到Oligo-1延伸產物啟動基于PCR的擴增。在每個PCR反應競中出現40c〇pieS的競爭 性內部對照DNA序列。圖1A顯示出參與聯合DNA聚合酶的延伸活性到qPCR的機制的示意 圖。圖2A顯示了根據本發明DNA聚合酶I延伸活性的測定，實現了在很寬范圍內加入酶。
[0013] 圖2顯示使用根據本發明的一個優選DPE-PCR分析方法對純化DNA聚合酶的靈敏 檢測的描述。以10倍增量開始于每個反應2X1(T5單位（U)下調至2Xl(TnU對商業來源 的DNA聚合酶進行一式兩份的測定。顯示每個聚合酶加入水平組和0加入對照組（NIC)的 代表性DPE-PCR曲線。A圖由n= 4的每個聚合酶加入水平的數據點構成，來自兩個獨立 的實驗并對其進行線性回歸分析。一式三份含有2XUTUDNA聚合酶I，Klenow酶，Klenow 酶（外切）和E.coliDNA連接酶的反應物進行分析并和NIC對比。顯示每個測定的酶和 NIC的代表性DPE-PCR曲線。對應于含50yM的[dATP,dGTP,dITP]混合液中添加50yM 的dCTP或ddCTP的DNA聚合酶延伸反應物顯示三個DPE-PCR曲線。dCTP或ddCTP摻入 DNA底物的第一個可能位點的部分示意性顯示于DPE-PCR曲線附近。圖2B顯示在DPE-PCR 循環閾值和商業DNA聚合酶I加入單位之間具有很強的正線性相關（R2= 0. 992)的回歸 分析（CT)，其來源于兩個獨立的檢測試驗極限的圖表數據。圖2C顯示按照本發明在與野 生型DNA聚合酶I相似的水平的Klenow酶和Klenow酶外切-的檢測，提供的證據表明， DPE-PCR檢測信號源自DNA聚合酶依賴性延伸而不是內在的核酸外切酶活性。圖2D說明通 過DNA聚合酶ddCTP摻入所述底物第一個可能的位置。
[0014] 圖3顯示聯合珠裂解至DPE-PCR方法的示意圖，并示出了已知含有或懷疑含有微 生物的液體樣品，加入到珠磨機裂解管中，裂解，并立即轉換到本發明的DPE-PCR檢測。
[0015] 圖4顯示通過在粗裂解液中DNA聚合酶延伸活性的測定，根據本發明的DPE-PCR 法能夠靈敏和定量檢測革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌。減少的E.colicfu攙入到珠裂解 聯合的DPE-PCR。0加入對照組（NIC)也包括監測試劑本底水平。所有cfu刺突（spike) 和NIC-式三份進行。DPE-PCR曲線顯示于每個細菌加入水平的下面。進行菌落計數平板 和gsPCR以獲得更好的每個點實際植入的cfu評估。顯示大腸桿菌DNA聚合酶活性和線性 回歸分析的圖表。細菌尖峰加入cfu的范圍為IXKf-lXlO1-式三份的反應得到平均Ct 值生成圖形。用于金黃色葡萄球菌cfu滴定實驗和上述大腸桿菌菌落計數平板的方法完全 相同。圖4A顯示，當和珠磨機裂解聯合時，本發明的DPE-PCR測定能夠檢測具有寬泛動態 范圍加入的大腸桿菌的量，低于每裂解管10菌落形成單位（cfu)。圖4B顯示檢測大腸桿菌 的線性回歸分析，也是低于lOcfu加入細菌進行的，并顯示如R2值所示的0. 999,加入cfu 和DNA聚合酶的延伸活性信號之間有很強的正向線性關系。如圖4C所示，金黃色葡萄球菌 的裂解產物的DNA聚合酶的延伸活性，檢測到了類似的加入水平，并且，如圖4D所示，金黃 色葡萄球菌的檢測圖也低至lOcfu加入細菌，加入菌落和DNA聚合酶延伸活性信號之間也 表現出很強的線性相關（R2= 0. 999)。
[0016] 圖5顯示通過由ddCTP封閉的DPE-PCR的細菌測定。5yL大腸桿菌懸液加入到珠 裂解耦合DNA聚合酶分析中，該方法包括包含50yMdCTP或50yMddCTP的dNTP的混合 物。顯示代表大腸桿菌-衍生的DNA聚合酶活性的DPE-PCR曲線。在指定的條件下反應， 一式三份用平均qPCR的Ct值生成圖形。上述用于大腸桿菌中進行的ddCTP終止和dCTP 拯救實驗完全用于金黃色葡萄球菌的檢測。圖5A和5B所示，與標準的反應混合物對比，顯 示出ddCTP替代阻止大腸桿菌，金黃色葡萄球菌cfu尖峰衍生信號的生成。
[0017] 圖6顯示由本發明的分析方法的優選實施例產生的PCETGAPCR數據。
[0018] 發明優選實施例的詳細描述
[0019]概沭
[0020]DNA聚合酶的延伸活性的測定可作為一種有深遠意義的有用工具，例如，但不限 于，在體外篩選候選的聚合酶抑制劑，或取決于細胞選擇性樣品的制備，在不同范圍內的樣 品類型中檢測任何活細胞類型（攜帶活性DNA聚合酶）的存在。如果用于這些目的，通常 使用的摻入放射性標記的核苷酸的傳統聚合酶檢測是沒有吸引力。因此，近十年開發了眾 多的非放射性DNA聚合酶延伸分析方法。盡管成功地避免使用放射性，目前熒光為基礎的 DNA聚合酶檢測還存在各種不足。例如，通過幾個現有的非放射性測定法檢測DNA聚合酶活 性是依賴于PicoGreen?結合到新生成的雙鏈DNA的（13'14)。如果旨在從新鮮裂解生物體中 分析DNA聚合酶活性，PicoGreen?為基礎的檢測可能會被由PicoGreen?結合基因組DNA 所產生的背景焚光所阻礙。也開發了基于微板（microplate-based)的DNA聚合酶測定法 (15)。由于下列眾多原因，基于微板測定法的預期敏感性降低，包括依賴于產物或底物與微板 的相互結合和/或通過DNA聚合酶修飾的dNTP的低效率摻入。最近，公開了通過分子信標 實時測量DNA聚合酶活性(16)。該方法盡管提高了靈敏度，直接測量分子信標熒光也可能潛 在地通過暴露于粗細胞裂解物而被阻礙。
[0021] 在本發明的研發中，我們著手開發能夠快速，簡單，高靈敏和定量的分析方法，該 方法能夠測定源自純化的商業來源或任何類型活細胞新鮮裂解物的DNA聚合酶延伸活性。 圖1A包含參與耦合DNA聚合酶的延伸活性到qPCR的機制的示意圖。尤其是，在Taq酶的 激活之前和過程中，01ig〇-2被尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG)清除，從而避免了不希望的PCR循環之前的Taq依賴的底物延伸。先前已報道了一種聯合T4DNA連接酶的活性和PCR擴增 的微生物檢測方法(18)，該方法包含與我們DPE-PCR分析方法相似之處，是另外一種ETGA方 法。然而，在我們這這個方法的修改版，旨在檢測微生物來源的NAD-依賴的DNA連接酶活 性，因受制于靈敏性缺乏和普遍的微生物檢測的缺陷，引領我們去開發改進的新型DNA聚 合酶為基礎的方法，本文描述命名為DPE-PCR。
[0022] 實施例1
[0023] 純化的DNA聚合酶延伸活性的靈敏的和線性的檢測，相關定量分析的建立
[0024] 我們著手使用市售的DNA聚合酶I確定DPE-PCR測定法的近似分析靈敏度。在本 實施例中，將來自于DNA聚合酶I的減少量的DPE-PCR信號與未加入DNA聚合酶（以下簡 稱為"未加入對照組"或NIC)的平行反應進行比較。如圖2A所示，能實現在一個寬的酶加 入范圍內檢測到DNA聚合酶I延伸活性。事實上，在酶低至2XKT11單位（U)(相當于約50 分子聚合酶），DNA聚合酶I延伸活性仍可和NIC組區分。據我們所知，現有DNA聚合酶測 定方法都不能在這個水平檢測DNA聚合酶延伸活性。由于已報道的大腸桿菌每個細胞(11) 內含有大約400個DNA聚合酶I與已報道的哺乳動物的每個細胞的DNA聚合酶分子數相 似，從理論上講，該水平的靈敏度可以如檢測微生物一樣容易地檢測到單個細胞。從兩個獨 立限制（independentlimit)的檢測試驗的圖標數據回歸分析也顯示，DPE-PCR循環閾值 (Ct)和加入的商品化DNA聚合酶的單位之間有很強的正線性相關（R2= 0. 992)(圖2B)。 這種令人驚奇的優良線性關系低至50個DNA聚合酶分子，這為可靠的以及穩定的對DNA聚 合酶分子、完整細胞和攜帶這些聚合酶的細胞器（例如細胞核和線粒體）的定量檢測的開 發提供了基礎。
[0025] 進行靈敏度和線性度實驗之后，確定DPE-PCR檢測信號是否是不依賴于內在外切 酶活性非常重要。為此，我們隨后對2X1(T7U的DNA聚合酶I，缺乏5' -3'核酸外切酶 活性（Klenow)的DNA聚合酶I和其他版本的缺乏所有核酸外切酶活性（Klenowexo_)的 酶所產生的信號進行了比較。為了另外的特異性和背景信號檢測，2X1(TU大腸桿菌DNA連 接酶和NIC平行進行測試。如圖2C所示，與野生型DNA聚合酶I相比，在相似水平都檢測 到Klenow和Klenowexo-，該證據表明，DTO-PCR檢測信號來源于DNA聚合酶依賴性延伸， 而不是內在的外切酶活性。
[0026] 除了用外切核酸酶游離聚合酶，我們著手進一步證明DPE-PCR檢測信號來源于 qPCR之前的聚合酶依賴性DNA底物延伸。由于雙脫氧核苷酸的摻入是一種完善的用于終止 DNA聚合酶鏈延伸活性的方法（19'2(0,在我們的DNA聚合酶延伸反應混合物中我們選擇雙脫 氧CTP(ddCTP)替換dCTP。圖2D所示的示意圖顯示，通過DNA聚合酶將ddCTP摻入底物的 第一個可能的位置。如果ddCTP摻入該位置，Oligol的延伸產物的長度對后續通過qPCR引 物1進行的檢測來說將是不足的（參見圖1示意圖）。如圖2D所示，用ddCTP替換dCTP消 除了由DNA聚合酶I產生的信號，從而表明該DPE-PCR檢測信號是依賴于qPCR之前的DNA 聚合酶底物延伸。低拷貝競爭性內部擴增對照的存在證實了qPCR并沒有被低量的ddCTP 出現抑制，該抑制由DNA聚合酶測定試劑延續。
[0027] 另外，在未加入-DNA聚合酶（未加入對照組）的組中觀察到弱的，但是可檢測的 信號。由于DPE-PCR分析精湛的靈敏度，我們已經證明，弱背景噪聲信號可以歸結為存在于 反應裝備前DNA聚合酶延伸的儲存試劑中的"污染物"DNA聚合酶活性。因此，對DNA聚合 酶延伸反應物（見材料和方法部分）進行常規地預處理，就足以消除觀察到的污染物DNA 聚合酶的信號（參見圖2A中的示例）。此外，我們已經證實，不想要的Taq-依賴的信號的 主要潛在來源可能來自操作者未能將活化的UDG添加到qPCR基本混合物（mastermix)中。 例如，從qPCR基本混合物中刻意省略掉UDG引起源自DNA底物Taq酶依賴性延伸的高背景 信號（參見圖2B)，但是，當如方法部分所描述的那樣加入UDG時，我們從未觀察到高背景信 號（由UDG缺乏所引起）。另一個增加的背景信號的假設來源可能來自于實驗期間由操作 者引入的DNA聚合酶。
[0028] 因此建議，在本發明的實踐中，操作者在制備樣本和用于DNA聚合酶延伸和qPCR 分析部分的試劑時展現出良好的無菌技術（見材料和方法對于污染預防的建議一節）。鑒 于上述情況，我們認為這是非常重要的：NIC與每個實驗并行運行，以驗證起始試劑是無污 染和UDG已被添加到qPCR標準混合物中。
[0029] 結論：這些數據表明在至少5個數量級的線性動態范圍內具有優異的線性關系， 下限低至大約50個DNA聚合酶分子水平。這個實施例中的數據為可靠，穩定定量測定DNA 聚合酶分子，完整細胞和攜帶這些聚合酶的例如細胞核和線粒體細胞器的研發提供了基 礎。
[0030]方法：
[0031] 金黃色葡萄球菌（S.aureus)和大腸桿菌（E.coli)的培養物生長至0D6(i(i為 1.0±0. 2(約lX109cfu/mL)。對于每種生物體，將lml培養物沉淀，在T.E.中洗滌三次。 該細菌懸浮液連續稀釋于T.E.，將5yL的各個儲液添加到含50yLDNA聚合酶延伸反應 混合物的珠磨裂解管中（參見上面的組合物）。每種生物體一式三份地進行1X105? IX10°cfu/反應的滴定曲線，包括無細菌懸浮液的一式三份反應。
[0032] 通過使用100yL大小的Eppendorf槍頭吸取60yL(濕體積）0? 1mm的玻璃珠 (ScientificIndustriescat#SI_G01)以及通過使用改良的lOOOuL大小的Eppendorf 槍頭吸取 50yL(濕體積）0? 5mm的玻璃珠（ScientificIndustriescat#SI_BG05)來產生 珠磨裂解管（為了能夠使該0. 5mm珠更具有可重復性和精確分配，用無菌刀片將1000yL 大小的Eppendorf槍頭的端部切成1mm內徑）。一旦兩個尺寸的珠子的衆料分散到1. 5mL 管（帶螺絲帽）中，隨后使用連接到真空源的無菌凝膠上樣槍頭（sterilegelloading pipettetip)吸出水性上清液。抽吸后，將試管加蓋并在使用前進行熱處理（參見上述熱 處理部分）。
[0033] 加入5yL細菌備用品后，采用裝備有裂解頭的digitalVortex Genie(ScientificIndustries)將反應管在轉速2800rpm下珠研磨6分鐘。裂解后立即將 樣品試管置于37°C下，20分鐘。在溫育20分鐘后，樣品管轉移至95°C下，5分鐘，以及移至 室溫下冷卻。然后將樣品管在12KXg下旋轉30秒，并將3yL各反應物放入DPE-PCR測定 法的qPCR部分。將5yL各細菌的備用品置于平板中以獲得更準確的菌落的加入水平。還 對用于DNA聚合酶檢測的相同的裂解物進行了基因特異性PCR。
[0034] DNA底物設計和制備
[0035]DNA底物的序列改編自以前用于通過T4DNA連接酶(18)以測量細菌來源的ATP的 DNA寡核苷酸。寡核苷酸l(Oligol) (5'-gccgatatcggacaacggccgaactgggaaggcgagactg accgaccgataagctagaacagagagacaacaac-3 ')和寡核昔酸 2 (01igo2) (5 '-uaggcgucggu gacaaacggccagcguuguugucucu[dideoxyCytidine]-3 ')分別通過IntegratedDNA技 術（Coralville，Iowa)合成。01igo2中的"U"代表脫氧尿苷。雙脫氧胞苷（ddC)被包括 進去作為01ig〇2的3'端的最后一個堿基以阻止DNA聚合酶介導的延伸（參見圖1示意 圖）。首先，凍干的Oligol和01ig〇2以100yM的終濃度懸浮于pH為8. 0 (Ambion)的無 菌Tris-EDTA(T.E.)中。底物進行如下的常規預退火：首先，將lOOyL的01igol(100yM 備用品）和l〇〇yL的01igo2(100yM備用品）加到pH8.45的800yL退火緩沖液中 (200mMTris，lOOmM氯化鉀和 0?ImMEDTA)，形成Oligol和 01igo2 均為 10yM的lml混 合液。將10UM寡核苷酸混合物的100yL等分試樣分配到薄壁0. 2mL的PCR管中，加蓋， 放入GeneAmp?_ 9700熱循環儀（AppliedBiosystems)，并進行下述預退火程序：95°C2 分鐘，以默認速度漸變至25°C并保溫5分鐘，再以默認速度漸變至4°C。通過在無菌水中 1:10稀釋寡核苷酸退火緩沖液（Ambion，cat#AM9932)(如上所述）制備底物稀釋緩沖液。 預退火的DNA底物隨后被稀釋至在寡核苷酸稀釋緩沖液中的最終濃度為0. 01yM(10X備 用品），分裝并儲存于_20°C。
[0036] 定量PCR引物，探針和競爭性內部對照設計
[0037] 此處所描述的DPE-PCR引物以前用來擴增由T4DNA連接酶改性的DNA底物(18)，如 下：正向引物（5' -ggacaacggccgaactgggaaggcg-3'），反向引物（5'-taggcgtcggtgaca aacggccagc-3')。在本研宄中使用的檢測用探針為（5'FAM-actgaccgaccgataagctagaac agagag-IABk_FQ3')。作為監視qPCR抑制的工具，生成包含以下序列（5'-gccgatatcgga caacggccgaactgggaaggcgagatcagcaggccacacgttaaagacagagagacaacaacgctggccgtttgtcac cgacgccta-3')競爭性內部對照^ 通過IntegratedDNA技術（Coralville，Iowa)合成并 克隆作為"微基因（minigene)"的內部對照序列。在接收時，內部對照微基因質粒用限制 性內切酶PvuI(NewEnglandBiolabs)線性化，并使用PCR凈化柱（Qiagen)重新純化。使 用NanoDrop分光光度計（ThermoScientific，ND-1000)對純化的內部對照進行了定量，在 T.E.中稀釋到所需濃度并存儲在-20°C。內部對照DNA的特異性探針用IntegratedDNA 技術合成（5'TX615_atcagcaggccacacgttaaagaca_IAbRQSp3')。圖 1 中可找到底物 / 競 爭性內部對照中的引物/探針的相對位置的詳細示意性說明。
[0038]DNA聚合酶延伸反應條件
[0039]DNAPolI(NEBcat#M0209L)，Klenow(NEBcat#M0210S)和Klenowexo(-)(NEB cat#M0212S)在無菌T.E.，pH8.0稀釋到所指示的U/yL備用品。首先，將各個濃度的 2yLDNA聚合酶備用品加入到50yLDNA聚合酶延伸反應混合物中，該混合物含有下列成 分：50yMdNTP，20mMTrispH8.0，10mM硫酸銨，10mM氯化鉀，2mM硫酸鎂，1%BSA，0.1% TritonX-100,0.1 %吐溫20和0.001yM預退火的DNA底物（如上所述。2yLT.E?(無 DNA聚合酶）常規加入到含有完整的DNA聚合酶延伸反應混合物的另外一個管，被稱為"未 加入對照"(NIC)。含DNA聚合酶的反應物（或未加入對照）簡單渦旋混合，并在37°C下放 置20分鐘。20分鐘后，將3yL含有純化DNA聚合酶的各個反應物立即放入qPCR反應中 (見下面qPCR條件部分）。
[0040]基于f，3<-雙脫氧胞苷-5'-三磷酸（ddCTP)的雙脫氧鏈終止實驗[0041]用ddCTP終止純化的DNA的延伸活性：
[0042]如上所述用 50yM[dATP，dGTP，dlTP]混合物添加 50yMdCTP或 50yMddCTP(Affymetrix#77332)制備DNA聚合酶延伸反應物。向添加有50yMdCTP或 50yMddCTP的包含50yM[dATP，dGTP，dlTP]混合物的50yLDNA聚合酶延伸反應物中加 入2yLlXl(T9U/yL的DNA聚合酶備用品（NewEnglandBiolabs#M0209)。一式三份反應 物在37°下溫育20分鐘，將3yL的各個反應物隨后置于qPCR。
[0043] DNA聚合酶延伸反應物組分的熱處理
[0044] 使用之前，對DNA聚合酶延伸反應試劑備用品（除去DNA底物）進行如下熱處理： 10XdNTP的混合物[500yMdATP，dCTP，dGTP，dlTP〕在 90°C加熱 30 分鐘。10X核心反應混 合物[200mMTrispH8. 0，100mM硫酸銨，100mM氯化鉀，20mM硫酸鎂〕在90°C加熱30分鐘。 1.43父85六/去污劑混合物[1.43%85六，0.143%!^仂11父-100,0.143%吐溫20]在75°〇加 熱45分鐘。pH8. 45的底物退火緩沖液（200mMTris，100mM氯化鉀和0.ImMEDTA)在90°C 加熱30分鐘。珠磨試管在95°C加熱20分鐘。
[0045] 定量PCR組合物及熱循環參數
[0046]每 30yL的qPCR反應物包含：1XLightCycler480MasterMix(來源于 2X備用 品Rochecat#04707494001)，333nM正向和反向引物，166nM檢測探針（FAM)，166nM內部對 照探針（TxRed)，1. 2U尿嘧啶DNA糖基化酶（此后縮寫為UDG，Biolinecat#BI0-20744) 以及40個拷貝的競爭性內部對照（如上所述）。將3yL各DNA聚合酶延伸反應 物（來自純化DNA聚合酶或微生物細胞裂解液）加入到27yLqPCR基本混合物中，在 SmartCycler(Cepheid,SunnyvaleCA)進行兩步熱循環操作，運行如下：初始在40°C溫育 10分鐘，50°C下溫育10分鐘，并在95°C下溫育5分鐘（以激活Taq酶以及完成UDG-介導 的01igo2的DNA主鏈的水解），隨后在95°C下變性5秒，在65°C下退火/延伸20秒，循 環45次。循環閾值（CT)通過利用出現的qPCR曲線的二階導數分析的SmartCycler軟件 自動生成。
[0047] 實施例2
[0048] 通過測量直接來源于細胞珠磨裂解液的內源性DNA聚合酶的延伸活性來對微生 物進行靈敏的，定量的和通用的檢測
[0049] 除了檢測純化的聚合酶活性，簡便，靈敏及通用測量微生物來源的DNA聚合酶活 性的方法將是非常可取的。例如，DNA聚合酶延伸活性的測定可以用來篩選環境或生物樣品 中的任何攜帶活性DNA聚合酶的微生物的存在。為此，我們開發了一個簡單的方法，將微生 物裂解與我們的DPE-PCR檢測相聯系。如圖3所示，將已知含有或懷疑含有微生物的液體樣 品加入到珠磨裂解管中，裂解，并立即轉到DPE-PCR測定。我們選擇一種革蘭氏陰性菌（大 腸桿菌）和一種革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）以證明我們的測定方法具有測量粗細胞 裂解物中微生物來源的DNA聚合酶延伸活性的能力。如圖4A所示，當與珠磨裂解聯合時， DPE-PCR方法能夠在低至每個裂解管10集落形成單位（cfu)的寬泛的動態范圍內檢測到加 入的大腸桿菌。也對低至加入l〇cfu細菌的大腸桿菌檢測結果進行線性回歸分析，顯示R2 值為0. 999,表明加入的cfu(inputcfu)和DNA聚合酶延伸活性信號之間有很強的正線性 相關性（圖4B)。菌落計數板和大腸桿菌-基因特異性qPCR(gsPCR)平行運行，以確認每個 反應物的菌落加入水平和確認對來自完全相同的裂解物的完整基因組DNA的監控能力。檢 測到與加入水平（inputlevel)類似的金黃色葡萄球菌的裂解產物的DNA聚合酶延伸活性 (圖4C)。對加入細菌低至lOcfu的金黃色葡萄球菌檢測進行繪圖，其中也顯示inputcfu和DNA聚合酶的延伸活性的信號之間有很強的線性相關性（R2= 0. 999,圖4D)。菌落計數 板和gsPCR平行運行，以確認存在于每個珠裂解管中的金黃色葡萄球菌數量，以及直接可 分析的基因組DNA的存在。
[0050] 通過ddCTP替換消除微生物DPE-PCR檢測
[0051] 如先前在圖2D中所示，在我們的方法中，在DNA聚合酶延伸反應混合物中用ddCTP 取代dCTP表現為一種有力的阻斷Oligol延伸的工具。為了證明從細菌波峰（spikes)產 生的信號依賴于它們的DNA聚合酶延伸活性，而不是存在于裂解產物中的其它內源性細菌 酶的活性，我們建立了一個實驗，以比較使用含有（dATP，dTTP，dGTP，dCTP)的標準的DNA聚 合酶反應混合物和使用含有(dATP,dTTP,dGTP,ddCTP)反應混合物的來自大腸桿菌和金黃 色葡萄球菌的DPE-PCR信號。如圖5A和5B所示，相對于標準的反應混合物，ddCTP的取代 阻止了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌cfu波峰衍生信號的生成。總之，給出的數據有力支持 這種聲明：DPE-PCR分析特異性的檢測微生物的DNA聚合酶延伸活性，并且信號不是源自通 過酶活性的底物修飾而是源自DNA聚合酶（圖4C)。
[0052] 表1:下表展示的數據代表了利用本發明所提供的分析方法的優選實施方式檢測 17個其他臨床相關微生物種類的靈敏性和線性。
[0053]
【權利要求】
1. 一種檢測樣本中聚合酶活性的方法，作為包含活性聚合酶的活細胞或者亞細胞器存 在的指標，該方法包括如下步驟： (a) 將樣本中作為聚合酶活性底物的核酸分子與樣本接觸； (b) 在適合聚合酶活性的條件下孵育接觸的樣本；和 (c) 根據活化的聚合酶與底物核酸分子的作用結果確定核酸分子的存在（和/或定 量），從而指示樣本中活細胞或亞細胞器或總聚合酶活性的存在。
2. 如權利要求1所述的方法，其中聚合酶是DNA聚合酶。
3. 如權利要求1所述的方法，其中聚合酶或者是RNA聚合酶。
4. 如權利要求1所述的方法，其中樣本中的活細胞或者亞細胞器是完整的活細胞或者 亞細胞器。
5. 如權利要求4所述的方法，其中，在所述完整的活細胞或者亞細胞器中，所述核酸聚 合酶基因和其翻譯的活性蛋白聚合酶對于活細胞的存活是必需的，或者，核酸分子能作為 聚合酶活性細胞器的底物。
6. 如權利要求1所述的方法，其中作為聚合酶活性底物的核酸分子是固定化的。
7. 如權利要求1所述的方法，其中樣本通過差級細胞裂解制備方法制備，從而使得僅 僅來源于活細胞或者亞細胞器的聚合酶活性對聚合酶活性的底物進行修飾。
8. 如權利要求1所述的方法，其中樣本制備自粗細胞裂解物或純化的細胞組分。
9. 如權利要求8所述的方法，其中該方法進一步包括進行活細胞或亞細胞器基因組或 轉錄物序列分析的步驟。
10. 如權利要求9所述的方法，其中用單一樣本制備物進行序列分析。
11. 如權利要求9所述的方法，其中序列分析進一步包括具有抗活細胞或抗亞細胞器 或抗聚合酶活性的檢測試劑，用于診斷和管理患者的病理狀態。
12. -種包含權利要求1所述方法中使用到的試劑的分析試劑盒，所述試劑盒用于篩 查樣本中是否存在活細胞或亞細胞器，并用于提供診斷、預防或患者管理信息。
【文檔編號】C12Q1/68GK104520438SQ201380019842
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年4月12日 優先權日:2012年4月12日
【發明者】肖恩·馬克·奧哈拉, 丹尼爾·茲威特澤格 申請人:宙斯科技公司