多發性硬化的診斷miRNA概況的制作方法

多發性硬化的診斷miRNA概況的制作方法
【專利摘要】本發明涉及使用miRNA標志診斷多發性硬化的方法。在患有非典型表象的患者中和在可能涉及炎癥脫髓鞘的第一神經缺欠期間診斷多發性硬化是挑戰性的。為了確定用于診斷MS的生物標志，獲得了對miRNA表達式樣的深入分析。確定明顯失常的miRNA，根據微RNA疾病數據庫過去沒有將明顯失常的miRNA和MS相關聯。這些miRNA能夠潛在地充當MS的未來診斷生物標志，并有助于在患有MS的患者中診斷、監測疾病活動和評估治療應答。
【專利說明】多發性硬化的診斷miRNA概況

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種診斷多發性硬化（multiplesclerosis)的方法。

【背景技術】
[0002] 最近，分子診斷已經受到越來越多的關注。分子診斷發現了進入疾病的臨床診斷 (特別是傳染性病原體的檢測、基因組突變的檢測、病變細胞的檢測和對疾病誘因的危險因 子的識別）的入口。
[0003] 特別地，通過確定組織中的基因表達，核酸分析在疾病的研究和診斷方面開辟了 新的極具前景的可能性。
[0004] 待檢測的目標核酸包括基因組DNA、表達mRNA和其它例如微RNA(MicroRNA)(簡 稱miRNA)的RNA。miRNA是一類新的具有各種生物功能的小型RNA(A.Kelleretal.，Nat Methods. 20118(10) :841-3)。它們是發現于真核細胞的短（平均為20?24個核苷酸）核 糖核酸（RNA)分子。在哺乳動物中已經確定有數百種不同種類的微RNA(即數百個不同的 序列）。它們對于后轉錄的基因調控來說是重要的，并且與靶信使RNA轉錄物（mRNAs)上的 互補序列結合，這可導致翻譯阻抑或祀退化（targetdegradation)和基因沉默。因此，也 可將它們用作為研究、診斷和治療目的而使用的生物標記。
[0005]多發性硬化（MS)是中樞神經系統的炎癥自身免疫病，其中大腦和脊髓的軸突周 圍的髓鞘受到破壞，從而導致脫髓鞘和瘢痕形成以及廣泛的臨床信號和癥狀。可以將MS歸 類成不同的疾病亞類，包括復發/緩解MS(RRMS)、繼發進展MS、原發進展MS和進展復發MS。 復發-緩解亞類以不可預測的復發為特征，后續相對安靜（緩解）的數月至數年的時間段 內沒有任何疾病活性的新跡象。復發-緩解亞類通常以臨床孤立綜合征（CIS)為起點。在 CIS中，患者遭受暗示脫髓鞘的攻擊。通常CIS標志著MS的開始。
[0006] 多發性硬化的診斷通常涉及不同臨床數據、成像數據和實驗數據的分析。一些患 者在攜帶MS生活數年之后才被診斷患病。
[0007] 綜合征可以和其它疾病和醫學問題相似。為了診斷需要得到MS病變傳播的臨床、 成像、實驗和放射學數據，這會是費時的、昂貴的且困難的。可以實施腦脊液（CSF)的測試 以助于診斷MS，然而，為了獲得CSF會涉及腰穿刺這一令人不愉悅的且冒險的步驟。
[0008] 因此，亟需一種有效的、簡單的、可信賴的MS診斷測試。
[0009]
[0010] 除非另有聲明，本文所使用的技術和科學術語的含義與本發明所屬領域的普通技 術人員通常所理解的含義相同。
[0011] 如本文所使用的術語"多發性硬化"或"MS"涉及神經系統的炎癥疾病，并意指包 括疾病的全部臨床階段和亞類，包括MS的臨床孤立綜合征（CIS)、復發/緩解MS(RRMS)、繼 發進展MS、原發進展MS和進展復發MS。
[0012] 如本文所使用的術語疾病的"預測結果（predictinganoutcome) "是指既包括預 測接受給定治療的患者的結果，也包括沒有接受治療的患者的預后。
[0013] 本發明含義范圍內的"結果"是在疾病過程中達到的明確狀態。該疾病結果可能 是例如臨床狀態，例如"疾病的復發"、"疾病的緩解"、"治療應答"、疾病階段或等級等。
[0014] "風險"理解為受試者或患者發展或到達某種疾病結果的可能性。本發明上下文中 的術語"風險"不是意指表達與患者健康相關的任何正面或負面的含義，而僅僅是指給定事 件或狀態出現或發展的概率（proability)或可能性（likelihood)。
[0015]術語"臨床數據"涉及和患者的健康狀況相關的全部可得數據和信息，包括但不 限于年齡、性別、體重、絕經的/激素的狀態、疾病發生學數據、病歷數據、通過體外診斷方 法例如血液或尿液測試得到的數據、通過成像方法例如X-射線、計算機斷層攝影術、MRI、 PET、SPECT、超聲得到的數據、電生理學數據、遺傳分析、基因表達分析、活檢評估、手術中的 發現。
[0016]如本文所使用的術語患者的"樣品的歸類"涉及用至少兩個類別中的至少一個類 別關聯所述樣品。這些類別可以是例如"高風險"和"低風險"，高的、中等的或低的風險，其 中風險是在某一時間段內出現某一事件例如疾病出現、疾病進展等的概率。它還可以表示 疾病的有利的或不利的臨床結果的類別、給定治療的應答或非應答等。通過使用算法、特別 是判別函數（discriminantfunction)可以進行歸類。算法的簡單實例是根據在某一閾值 以上或以下的第一定量參數例如目標核酸的表達水平進行歸類。患者樣品的歸類可以用于 預測疾病的結果或發展疾病的風險。可能使用多個目標核酸的總分數而不是使用單個目標 核酸的表達水平。而且，可以將附加數據和第一定量參數組合使用。這種附加數據可能是 來自患者的臨床數據，例如性別、年齡、患者體重、疾病等級等。
[0017] "判別函數（discriminantfunction) "是用于對客體或事件歸類的一組變量的函 數。因此，根據從患者、樣品或事件得到的數據或參數，判別函數允許將患者、樣品或事件歸 類成一個類別或多個類別。這種歸類是本領域技術人員熟知的標準儀器的統計分析。例 如，根據從所述患者、樣品或事件得到的數據可以將患者歸類為"高風險"或"低風險"、"需 要治療"或"不需要治療"或者其它類別。歸類不是限制于"高和低"，而是可以劃分為多個 類別、等級等。進行歸類的判別函數的實例包括但不限于由以下定義的判別函數：支持向量 機（SVM)，k-最近鄰（kNN)，（樸素）貝葉斯模型，或者例如在亞群發現、決策樹、數據的邏 輯分析（LAD)等中的分段定義函數。術語"表達水平"是指例如目標核酸表達的確定水平。 術語"表達水平的式樣（patternofexpressionlevel)"是指，與例如來自對照的參照核 酸或例如在DNA-芯片分析中計算的平均表達值相比較的確定表達水平。式樣不限于兩組 基因的比較，而是還涉及基因和參照基因或樣品的多重比較。還可以通過比較和測量下文 所公開的多組目標核酸得到和確定某一表達水平式樣，并表現出這些轉錄物彼此之間的相 對豐度。相對于在不同組織中的表達、患者對健康對照等，還可以評估表達水平。
[0018] 在本發明的含義范圍內的"參照的表達水平式樣"應該理解為可以用于和另一個 表達水平的式樣相比較的任何表達水平的式樣。在本發明優選的實施方式中，參照的表達 水平式樣為例如在充當參照組的健康或患病個體的組中觀察到的表達水平的平均式樣。
[0019] 在本發明的上下文中，"樣品"或"生物樣品"是衍生自生物有機體的或者已經接 觸過生物有機體的樣品。生物樣品的實例是細胞、組織、體液、活檢試樣、血液、尿液、唾液 (saliva)、痰（sputum)、血楽、血清、細胞培養上清液等。
[0020] "探針"是能夠和特定生物分子特異性結合或相互作用的分子或物質。術語"引物 (primer) "、"引物對"或"探針"應該具有分子生物學領域的技術人員所知曉的這些術語的 通常含義。在本發明的優選實施方式中，"引物"、"引物對"和"探針"是指具有和待檢測或 量化的靶分子或靶序列的區域等同的、互補的、屬于同系物的或同源的寡核苷酸或多核苷 酸，從而引物、引物對或探針能夠和待檢測或量化的靶分子例如靶核酸、RNA、DNA、cDNA、基 因、轉錄物、肽、多肽或蛋白質特異性地結合。正如本文所理解的，引物本身可以充當探針。 本文所理解的"探針"也可以包括例如引物對和內標記探針的組合，正如在許多商業可得的 qPCR方法中常見的。
[0021] "基因"是一組包含以控制方式產生功能性RNA產物所必要的信息的核酸片段。"基 因產物"是通過基因轉錄或表達產生的生物分子，例如mRNA或翻譯得到的蛋白質。
[0022] "miRNA，，是短的、天然存在的RNA分子，并應該具有本領域技術人員所理解的通常 含義。"衍生自miRNA的分子"是由miRNA模板例如cDNA以化學的方式或以酶的方式產生 的分子。
[0023] 術語"陣列（array)"是指在裝置例如芯片裝置上的可尋址位置的排列。位置的 數目可以是從幾個至至少數百個或者數千個。每個位置表示獨立的反應位點。陣列包括但 不限于核酸陣列、蛋白質陣列和抗體陣列。核酸陣列是指包括核酸探針的陣列，例如寡核苷 酸、多核苷酸或基因的較大部分。陣列上的核酸優選是單鏈的。"微陣列"是指生物芯片或 生物學芯片，即具有每cm2至少約100個固定化探針的離散區域的密度的區域的陣列。
[0024] "基于PCR的方法（PCR-basedmethod) "是指包括聚合酶鏈反應PCR的方法。這 是通過使用一種、兩種或更多種引物進行體外酶促復制來指數式擴增核酸例如DNA或RNA 的方法。對于RNA擴增而言，可以使用逆轉錄作為第一步。基于PCR的方法包括特別適用 于表達水平分析的動態或定量PCR(qPCR)。當涉及確定表達水平時，例如可以使用基于PCR 的方法以檢測指定mRNA的存在，這通過（1)在逆轉錄酶的幫助下將完全mRNA庫（所謂的 轉錄物組）逆轉錄成cDNA和（2)在各自引物的幫助下檢測指定cDNA的存在。該方法通常 稱為逆轉錄酶PCR(rtPCR)。術語"基于PCR的方法"包括兩終點PCR應用以及應用特定熒 光團或嵌入染料的動態/實時PCR技術，所述特定熒光團或嵌入染料發出作為擴增目標的 函數的熒光信號和允許監測并量化目標。量化方法可以借助外標法標準曲線絕對化，或者 相對于對照內標。
[0025]術語"下一代測序（nextgenerationsequencing) " 或"高通量測序（high throughputsequencing) "是指使測序過程平行化從而同時制造數千個或數百萬個序列 的高通量測序技術。實例包括大規模平行簽名測序法（MPSS)、群落測序法、454焦磷酸測 序法、Illunima(Solexa)測序法、SOLID測序法、離子半導體測序法（Ionsemiconductor sequencing)、DNA納米球測序法（DNAnanoballsequencing)、Helioscope(TM)單分子測 序法、單分子SMRT(TM)測序法、單分子實時（RNAP)測序法、納米孔DNA測序法。
[0026] 術語"標志（marker) "或"生物標志"是指生物分子，例如核酸、肽、蛋白質、激素等， 能夠檢測它們的出現或濃度并與已知狀態例如病狀或者臨床結果例如治療應答聯系起來。
[0027] 發明目的
[0028] 本發明的技術問題是提供能夠診斷多發性硬化、預測發展多發性硬化的風險或者 預測多發性硬化的結果的生物標志。


【發明內容】

[0029] 在詳細描述本發明之前，應當理解本發明不受限于所描述方法的方法步驟的具體 組成部分，因為所述方法可以變化。還應該理解本文所使用的術語僅僅是用于描述具體實 施方式的目的，而不旨在是限定性的。必須指出，正如在說明書和所附的權利要求中所使用 的，單數形式"一種（a)"、"一種（an)"和"這種（the)"包括單數的和/或復數的代表物，除 非上下文以其它方式清楚地表明。還應該理解復數形式包括單數的和/或復數的代表物， 除非上下文清楚地另行說明。另外，還應當理解，在給出以數值為界的參數范圍的情形時， 應該認為這些范圍包括這些界限值。
[0030] 最通常來說，本發明涉及收集對診斷、預后、預測多發性硬化特別是CIS/RRMS有 用的miRNA標志。
[0031] 本發明涉及一種診斷多發性硬化、預測發展多發性硬化的風險或預測多發性硬化 的結果的方法，所述方法包括以下步驟：
[0032]a)在來自所述患者的樣品中確定至少一種選自由hsa-miR-16-2_3p、 hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、hsa-miR-100_5p、hsa-miR-20a_5p、 hsa-miR-151a_3p和hsa-miR-7-l_3p組成的組的miRNA的表達水平；
[0033]b)比較在步驟a)中確定的一種或多種表達水平的式樣和一種或多種參照的表達 水平式樣；以及
[0034]c)由步驟b)中的比較結果診斷多發性硬化、預測發展多發性硬化的風險或預測 多發性硬化的結果。
[0035] 本發明還涉及一種對患有多發性硬化或處于發展多發性硬化的風險的患者的樣 品進行歸類的方法，所述方法包括以下步驟：
[0036]a)在來自所述患者的所述樣品中確定至少一種選自由hsa-miR-16-2_3p、 hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、hsa-miR-100_5p、hsa-miR-20a_5p、 hsa-miR-151a_3p和hsa-miR-7-l_3p組成的組的miRNA的表達水平；
[0037]b)比較步驟a)中確定的一種或多種表達水平的式樣和一種或多種參照的表達水 平式樣；以及
[0038]c)依據步驟b)中的比較結果將所述患者的樣品歸類為至少兩個類別中的一個。[0039] 所述歸類能夠指示多發性硬化的診斷、發展多發性硬化的風險的預測和多發性硬 化的結果的預測。
[0040] 所述類別可以是健康的/患病的、低風險/高風險、發展疾病的低風險/高風險 等。
[0041] 優選地，在來自所述患者的所述樣品中能夠確定選自由hsa-miR-16-2_3p、 hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、hsa-miR-100_5p、hsa-miR-20a_5p、 hsa-miR-151a-3p和hsa-miR-7-l-3p組成的組的 2、3、4、5、6、7 或 8 種miRNA的表達水平。
[0042] 可以通過在至少一個健康受試者中確定至少一種選自由hsa-miR-16-2_3p、 hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、hsa-miR-100_5p、hsa-miR-20a_5p、 hsa-miR-151a-3p和hsa-miR-7-l_3p組成的組的miRNA的表達水平來獲得參照的表達水平 式樣。
[0043] 對步驟a)中確定的至少一種miRNA的表達水平分配數值落入本發明的范圍。
[0044] 通過使用算法以得到相對于參照的一種或多種表達水平式樣歸一化的表達水平 來運用算法實施步驟b)也落入本發明的范圍。
[0045] 將算法應用于在步驟a)中確定的至少一種miRNA的表達水平數值以得到能夠對 樣品進行歸類或發展多發性硬化的風險的診斷、預后或預測或多發性硬化的結果的預測的 疾病分數落入本發明的范圍。所述算法的非限定性實例是相對于閾值比較表達水平的數 值，以便將結果劃分為兩類中的一類，例如高風險/低風險、患病的/健康的等。所述算法 的另一個非限定性實例是例如通過加和將多個表達水平的數值組合以得到總分數。可以通 過乘以代表miRNA表達水平的因子或數值、代表臨床數據的數值或者其它因子將各個加和 歸一化或加權。
[0046] 應用判別函數來歸類結果、診斷疾病或者預測結果或風險落入本發明的范圍。
[0047] 根據本發明的一方面，所述樣品選自由血液樣品、血清樣品和血漿樣品組成的組。
[0048] 根據本發明的另一方面，所述樣品為血液樣品。
[0049] 根據本發明的一方面，本發明的方法包括在步驟a)中確定所述miRNA: hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-20a_5p和hsa-miR-7-l_3p的表達水平。
[0050] 根據本發明的一方面，本發明的方法包括在步驟a)中確定所述miRNA: hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-16-2_3p、hsa-miR-100_5p、hsa-miR-20a_5p、 hsa-miR-151a_3p和hsa-miR-7-l_3p的表達水平。
[0051] 根據本發明的一方面，本發明的方法包括在步驟a)中確定選自由 hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、hsa-miR-16-2_3p、hsa-miR-100_5p、 hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-151a-3p和hsa-miR-7-l_3p組成的組的全部miRNA的表達水平。
[0052] 本發明還涉及一種在患有多發性硬化或處于發展多發性硬化的風險的患者中診 斷多發性硬化、預測發展多發性硬化的風險或預測多發性硬化的結果的試劑盒，所述試劑 盒包括：
[0053]-用于在來自所述患者的樣品中確定至少一種miRNA的表達水平的裝置，所述 miRNA選自由hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、hsa-miR-16-2_3p、 hsa-miR-100-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-151a_3p和hsa-miR-7-l_3p組成的組；以及
[0054]-至少一種用于和來自所述樣品的至少一種miRNA的表達水平進行比較的參照的 表達水平式樣。
[0055] 用于確定所述至少一種miRNA的表達水平的裝置可以包括：用于檢測或擴增所述 至少一種miRNA的寡核苷酸探針，用于基于陣列的方法、基于PCR的方法、基于測序的方法 確定表達水平的裝置，或適合用于確定表達水平的任何其它裝置。
[0056] 可以以數值信息、特別是以在任何合適信息載體上的計算機編碼信息的形式提供 所述參照的表達水平式樣。
[0057] 本發明還涉及一種在患有多發性硬化或處于發展多發性硬化的風險的患者中診 斷多發性硬化、預測發展多發性硬化的風險或預測多發性硬化的結果的計算機程序產品， 其包括：
[0058]-用于接收代表在患者樣品中的至少一種miRNA表達水平的數據的裝置，所述 miRNA選自由hsa-miR-16-2_3p、hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、 hsa-miR-100-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-151a_3p和hsa-miR-7-l_3p組成的組，
[0059] -用于接收代表至少一種用于和來自所述樣品的至少一種miRNA的表達水平進行 比較的參照的表達水平式樣的數據的裝置，
[0060] -用于比較代表在所述患者樣品中的至少一種miRNA的表達水平的所述數據的裝 置，和
[0061] -用于由步驟b)中的比較結果確定多發性硬化的診斷、發展多發性硬化的風險的 預測或多發性硬化的結果的預測的裝置。
[0062] 計算機程序產品可以在存儲式電子介質例如固態存儲器、磁盤、CD等上提供。它 可以本地存儲在計算機上。它可以以基于網絡的程序或應用（包括基于網絡或互聯網的應 用）的形式運行。它可以在診斷設備例如分析器儀器上運行。它可以可操作地連接用于輸 出信息的設備，例如顯示器、打印機等。
[0063] 本文進一步公開了一種用于確定miRNA生物標志的方法，所述miRNA生物標志用 于在患者中診斷疾病、預測發展所述疾病的風險或預測所述疾病的結果，所述方法包括以 下步驟：
[0064] a)通過使用高通量測序方法，對照至少一個參照樣品來確定在患有所述疾病的患 者的至少一個樣品中差異表達的多種miRNA,
[0065]b)通過使用核酸陣列，對照另一個參照樣品來確定在另一個患有所述疾病的患者 的另一個樣品中差異表達的另外多種miRNA，
[0066] c)比較在步驟（a)中確定的所述多種miRNA和在步驟（b)中確定的所述另外多種 miRNA以確定至少一種在步驟（a)和（b)中均差異表達的miRNA，以及任選地
[0067] d)通過PCR方法確認所述至少一種miRNA的差異表達。

【具體實施方式】
[0068] 在下文的說明書和各個實施例的附圖中進一步公開了本發明目的的額外細節、特 點、特征和優點，這些實施例以示例性的方式說明了本發明的優選實施方式。然而，無論如 何這些實施例都不應該理解為對本發明范圍的限定。
[0069] 本發明涉及用miRNA標志診斷多發性硬化的方法。
[0070] 在具有非典型表象的患者中和在可能涉及炎癥脫髓鞘的第一神經缺欠期間，多發 性硬化的診斷是挑戰性的。具體地，難于診斷通常呈現疾病早期階段的CIS/RRMS。然而，特 別希望具有針對該疾病階段的可靠的診斷測試，因為在這一早期疾病階段期間治療介入的 時機更好。診斷RRMS因其能夠呈現多種不同神經癥狀而是挑戰性的。為了確定用于診斷 MS的生物標記，通過使用下一代測序、微陣列分析和qRT-PCR獲得了來自患有臨床孤立綜 合征（CIS)或復發-緩解MS(RRMS)的初次治療（treatment-naive)的患者的全血樣品中的 miRNA表達式樣的綜合分析。在患有CIS/RRMS的患者中，確定了明顯失調（deregulated) 的miRNA，根據微RNA疾病數據庫過去沒有將明顯失控的miRNA和MS聯系起來。這些miRNA 能夠潛在地充當用于MS的未來診斷生物標志，并有助于在患有MS的患者中診斷、監測疾病 活性和評估治療應答。
[0071] 在附圖中，
[0072] 圖1示出了用于確定miRNA標志的方法的概述；
[0073] 圖2示出了miRNA的數目和檢測到這些miRNA的樣品的頻率；
[0074] 圖3示出了通過NGS確定的8種最失調的miRNA;
[0075] 圖4示出了通過微陣列分析確定的8種最失調的miRNA;
[0076] 圖5示出了表明通過NGS和微陣列確定的明顯失調的miRNA的Venn圖；
[0077] 圖 6 示出了 8 種miRNA的qRT-PCR驗證；
[0078] 圖7示出了使用NGS、微陣列和qRT-PCR的8種miRNA的表達分析的比較；
[0079] 圖8示出了經審查的miRNA標志的疾病關聯的頻率。
[0080] 圖1 :方案概述。采用包括NGS、微陣列和qRT-PCR的三種實驗方法在患有CIS/ RRMS的患者中綜合分析miRNA的表達。
[0081] 圖2 :miRNA的數目和檢測到這些miRNA的樣品的頻率。藍色曲線表示NGS的結 果，而紅色曲線表示微陣列的結果。借助NGS，353種miRNA在全部研究的樣品的至少半數 中是可檢測的，而借助微陣列分析，228種miRNA在全部研究的樣品的至少半數中是可檢測 的（參見虛線）。
[0082] 圖3:由NGS確定的8種最失調的miRNA(p值<0.01)。在X軸上，示出了 8種不 同miRNA的對照樣品（黑色）的中位值和MS樣品（淺灰色）的中位值及其標準偏差的柱 (bar)，y軸呈現讀數。
[0083] 圖4 :由微陣列分析確定的8種最失調的miRNA(p值< 0. 01)。在X軸上，示出了 8種不同miRNA的對照樣品（黑色）的中位值和MS樣品（淺灰色）的中位值及其標準偏差 的柱，y軸呈現信號強度。
[0084] 圖5 :示出了通過NGS和微陣列確定的明顯失調的miRNA的Venn圖。通過微陣列分 析我們確定了 8種miRNA，而通過NGS我們確定了 38種在MS中明顯失調的miRNA。使用這 兩種方法都確定了三種miRNA，即hsa-miR-16-2_3p、hsa-miR-20a_3p和hsa-miR-7-l_3p。
[0085] 圖6 :8種miRNA的qRT-PCR驗證。柱狀圖示出了 8種經測試的候選MS標志的ACT 值和標準偏差。
[0086] 圖7 :使用NGS、微陣列和qRT-PCR的8種miRNA的表達分析的比較。柱的高度代 表每種miRNA和所使用的每種分析方法（NGS=黑色柱，微陣列=白色柱，qRT-PCR=陰影 柱）的對數化的倍數變化。我們得到了除一個miRNA(hsa-miR-629-5p)外的全部miRNA的 一致結果。
[0087] 圖8 :疾病關聯的頻率。該圖示出了存儲于HMDD數據庫中的全部miRNA的疾病相 關的頻率。
[0088] 為了在患有CIS/RRMS的患者中綜合分析miRNA的概況，正如圖1所具體示出的， 采用三個實驗階段。第一，在38個患者和對照者的組中實施使用NGS的篩選，然后實施使 用96個年齡和性別匹配的病例和對照者的擴充組的微陣列篩選。分析兩組高通量數據組 得到了 8種miRNA候選者，通過qRT-PCR在20個個體（5個CIS、5個RRMS和10個年齡和 性別匹配的對照）中分析這8種miRNA候選者。患有CIS/RRMS的患者和健康對照者的詳 細特征記載于表1中。為了排除作為致混淆因素的免疫調制或免疫抑制治療，只有初次治 療的患者包括在本工作中。
[0089] 患者和樣品制備
[0090] 從根據McDonald2005標準診斷為CIS(η= 25)或RRMS(η= 25)的50個患者中 收集大約5mL的血液于PAXgeneBloodRNA試管（Becton，Dickinson,海德堡，德國）。涵 蓋50個年齡（+/-4年）和性別匹配的健康成年者作為對照（表1)。
[0091] 使用PAXgeneBloodmiRNA試劑盒（Qiagen)按照廠家推薦分離包括miRNA的全 部RNA。分離后的RNA儲存于-80°C下。使用生物分析儀2100 (Agilent)分析RNA的完整 性，并使用NanoDrop2000(thermoScientific)測量濃度和純度。總共四個樣品（三個對 照和一個RRMS)不滿足質量標準，并從研究中排除。
[0092]NGS篩選
[0093] 最初，對取自16個患有CIS/RRMS的患者和22個對照者的38個樣品進行高通 量篩選。總的來說，發現總共835種miRNA在至少單一樣品中表達。圖2示出了miRNA 的數目和檢測到這些miRNA的樣品的頻率（藍色曲線）。如圖所示，在全部研究樣品中 的至少半數中353種miRNA是可檢測的，證明了在研究的血液樣品中各種miRNA的高豐 度。后續的歸一化t-測試示出了總共38種明顯地（未調整的（non-adjusted))失調的 miRNA。8種最失調的miRNA(P-值<0.01)示于圖3中。然而，在針對多重測試的調整之 后，沒有miRNA保持顯著的，因為諸多特征（最小P-值為0. 155)。這8種miRNA包括5 種下調miRNA，即hsa-miR-361_5p、hsa-miR-7-l_3p、hsa_miR-548〇-3p、hsa-miR-151a_3p 和hsa-miR-548am_3p,以及 3 種上調miRNA,即hsa-miR-22_5p、hsa-miR-27a_5p、 hsa-miR-4677-3p。總的來說，在CIS/RRMS中38種失調的miRNA中16種是下調的而22種 是上調的。
[0094]TruSeqSmallRNA制備試劑盒（Illumina)用于產生多路測序文庫，其隨后使用 50bp片段測序方案（fragmentsequencingprotocol)在HiSeq2000 系統（Illumina)上測 序。使用CASAVA1.8軟件包（Illumina)多路解編所得到的測序讀數，并且使用FastQC工 具（Babraham公司）檢驗質量。使用miRDeep2流水線（miRDeep2pipeline)進行最初測繪 分析以確保已經測序大部分的miRNA。
[0095] 總的來說，在兩組多路庫（pool)中分析來自η= 16個患者（5個RRMS，11個CIS) 和η= 22個對照者的38個樣品。平均來說，每個樣品得到了 150?200萬個高質量的測 序讀數（共計9500萬個讀數），其中高達70 %包含miRNA信息。
[0096] 首先通過切下3 '接頭序列預加工原始illumina讀數。這通過來自 FASTX-Toolkit的fastx_clipper程序來完成。除去剪切后短于18個核苷酸的讀數。使剩 余的讀數驟減，即該步驟后只得到了每個樣品獨特的讀數及其頻率。該步驟縮短了用于大 量測繪讀數的時間。對于剩余步驟，使用miRDe印2流水線。這些步驟包括測繪相對于基因 組（hgl9)的讀數、測繪相對于來自miRBase發布vl8的miRNA前體序列的讀數、總結樣品 的計數以及預測新穎性miRNA。
[0097] 微陣列篩選
[0098] 接下來，使用包含1205種miRNA的微陣列（代表miRBasevl6的內容），篩選來自 49個患有CIS/RRMS的患者和47個對照者的96個年齡和性別匹配的樣品的擴充組。對于 測序結果，首先評價所檢測的miRNA的數目。正如圖2中紅色曲線所示，微陣列研究比NGS 檢測到明顯更少的miRNA(p= 6. 5*1(Γ7)。在至少一個樣品中，檢測到382種miRNA(通過 NGS至少在單一樣品中檢測到835種miRNA中的46 % )，在全部樣品中的至少50 %中檢測到 228種miRNA(相比于測序方法中的353種miRNA)。不希望受限于該理論，據認為這可能是 由于兩個不同原因：第一，微陣列實驗受限于miRBasevie的內容，而測序可以發現全部存 在的人類miRNA;以及，測序方法還通常比微陣列實驗更靈敏。38種由測序確定的明顯（未 調整的）失調的miRNA的更深入分析也反映了這一點。當然，7種（18.4%)沒有包含于 SurePrint8x60KHumanvl6miRNA微陣列，而還有14種（36. 8%)包含于該微陣列中但是沒 有被檢測出。在微陣列實驗中，檢測到總共8種明顯失調的miRNA。對于NGS實驗，沒有調整 多重測試的P值以使得數值在不同方法之間是可比較的。圖4示出了各種標志。對于測序 方法，在患有CIS/RRMS的患者中 5 種miRNA是下調的（hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-7-l-3p、 hsa_miR-20a、hsa-miR-3653 和hsa_miR-20b),而 3 種是上調miRNA(hsa-miR-16-2_3p、 hsa-miR-574-5p、hsa_miR-1202)〇
[0099] 使用SurePrint8x60KHumanv16miRNA微陣列（Agilent,CatNoG4870A)按照 使用說明實施微陣列分析，所述SurePrint8x60KHumanv16miRNA微陣列包括40份1205 種miRBasevl6 的miRNA( http://www.mirbase.org/)。簡而言之，使用miRNAComplete Labeling和Hyb試劑盒處理全部IOOng的總RNA以產生熒光標記的miRNA。標記反應后，在 真空離心管中干燥該混合物并將其重新懸浮于包含雜交緩沖液和封閉劑的雜交混合物中。 然后，裝填并培養微陣列。為了驗證標記和雜交是否成功，以合適的步驟加入標記和雜交的 外標對照（spike-incontrol)。在幾個洗漆步驟后，用AgilentMicroarrayScanner在 3 微米下以雙通路模式掃描微陣列。使用FeatureExtraction軟件進一步處理微陣列掃描 數據。
[0100] NGS和微陣列分析之間明顯失調的miRNA的交集
[0101] 如上所述，通過NGS檢測到38種明顯失調的（未調整的）miRNA，而用微陣列分析 檢測到8種明顯失調的（未調整的）miRNA。這些分別對應于所測量的miRNA的1. 9%和 0. 7%，因此這兩組之間的偶然交集是極不可能的。然而，值得一提的是，有三種miRNA的 交集，包括hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-7-l-3p(參見圖 5)。一百萬次置 換測試確認這種交集是高度顯著的（P= 0. 004)。此外，通過NGS確定的38種miRNA中的 5種在微陣列分析中表現出相同的調節趨勢。然而，這五種miRNA(包括hsa-miR-22a-5p、 hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-629-5p、hsa-miR-100_5p和hsa-miR-151_5p)的調節并非是統 計顯著的（P>〇.05)。通過這兩種方法確定的3種明顯失調的miRNA和另外5種miRNA以及 在這兩組實驗中它們的表達值和顯著值列于表2中。
[0102] qRT-PCR分析
[0103] 使用qRT-PCR進一步分析這8種miRNA。能夠確認這8種miRNA中的七種，然而， 根據qRT-PCR的結果，4種miRNA(hsa-miR-22-5p、hsa-miR-629-5p、hsa-miR-20a-5p和 hsa-miR-151-3p)并非明顯地失調。與NGS和微陣列分析相反，對照中hsa-miR-629-5p 比MS患者表現出稍微的但不是顯著（p=0. 71)更高的表達。表2還包括qRT-PCR驗證 (qRT-PCR validation)的結果。圖6示出了qRT-PCR驗證的Λ CT值和標準偏差。圖7使 得使用NGS、微陣列和qRT-PCR的8種miRNA的表達分析的對比直觀化。
[0104] 組成一組20個年齡和性別相匹配的患者和對照樣品，其也用于微陣列和NGS分 析。患者組包括5個CIS患者和5個RRMS患者。對于qRT-PCR驗證，選擇3種在微陣列和 NGS中均明顯失調的miRNA，和5種根據NGS顯示是失調的并表現出相同調節趨勢的但是在 微陣列分析中不是明顯失調的miRNA。使用TaqmanqRT-PCR體系（AppliedBiosystems) 進行qRT-PCR。使用小RNARNU6B和RNU48作為內源性對照。
[0105] 8種miRNA的關聯性
[0106] 對于8種一致的miRNA，從HMDD數據庫中提取（即公開物描述了在所考慮的疾病 中活性失調（dys-regulated)的各種miRNA)已知疾病的相互聯系（圖8)。計算8種miRNA 中每一種的疾病相互聯系的數目并將它們和8種miRNA疾病相互聯系的平均值進行比較， 發現本文所描述的miRNA的明顯增加的數目，即所檢測到的miRNA通常和不同的疾病相關 聯。除1種miRNA外的8種全部miRNA與超過8種疾病相關聯，暗示不同的miRNA對CIS/ RRMS不是特異性的（參見圖8)。然而，沒有發現具有和CIS/RRMSmiRNA組相同式樣的疾病， 說明這種miRNA組具有增加的CIS/RRMS的特異性。
[0107] 通過采用用于前體分子的miRNA富集分析，發現8種miRNA中的4種，即 hsa-miR-20a、hsa-miR-100、hsa-miR-125b和hsa-miR-16-2,和免疫應答相關。類似地，4 種 miRNA，即hsa_miR-20a、hsa-miR-7-l、hsa-miR-22 和hsa-miR-16-2,和激素調節相關。考 慮到疾病關聯，早先將hsa-miR-100、hsa-miR-125b、hsa-miR-7-l和hsa-miR-16-2 與腎上 腺皮質癌相關。根據HMDD，迄今為止在CIS/RRMS中沒有記載這8種miRNA中的任一種。然 而，先前已經報道相比于對照，hsa-miR-22 (在本篩選中5種miRNA中的一種）在患有MS的 患者的血漿和⑶4+⑶25+調節性T細胞中上調。而且，當比較當前結果和我們自身關于多 發性硬化的最初研究時，發現顯著的交集。具體而言，我們確認hsa-miR-629(p= 0. 0009) 以及hsa-miR_100(p= 0.04)在MS中為顯著上調，而我們發現hsa-miR_20a為下調（p= 0. 0009)。類似地，hsa-miR-125b是上調的，盡管幾乎偏離了 0. 05的顯著閾值（p= 0. 06)。 最初的研究和本工作之間的交集似乎是非常有意義的，考慮到使用了不同的實驗裝置（不 同的微陣列平臺）并研究了完全獨立的群組（并非全部患者初次治療，沒有年齡和性別匹 配的對照）。
[0108] 總的來說，本文給出了相比于年齡和性別匹配的對照個體，在包括CIS患者和 RRMS患者的初次治療MS患者的血液中的miRNA表達的綜合分析。采用NGS和微陣列分析， 確定了一組8種miRNA，其中在MS患者的血液中，5種miRNA是上調的（hsa-miR-22-5p、 hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、hsa-miR-16-2_3p和hsa-miR-100_5p)，3 種miRNA是 下調的（hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-151a_3p和hsa-miR-7-l_3p)。使用qRT-PCR，我們能夠 針對除一種miRNA(hsa-miR-629-5p)外的全部miRNA確認這些結果。根據HMDD，迄今為止， 這8種miRNA從未和MS相關聯。然而，過去已經報道一種miRNA在MS患者的血漿和調節 性T細胞中上調。和我們先前關于MS的數據進行比較，我們檢測到顯著的交集。富集分析 揭示了miRNA中的半數分別和免疫應答、激素調節或腎上腺皮質癌相關。這些結果發現了 一組有望充當潛在有用生物標記的miRNA，其在患有MS的患者中用于診斷、用于監測疾病 活動或用于評估治療應答。已經確認的標記組合允許簡單、直接、可靠的診斷測試。針對這 些miRNA的進一步分子生物學分析可能有助于加深對這種多因素疾病的理解。
[0109] 表1 :對該研究所涉及的患者的表征。最后三列使用"X"指明使用了微陣列、NGS 和/或qRT-PCR的樣品。最后兩行表明患者和對照的總體分布。按照CIS和RRMS單獨給 出MS患者。
[0110]

【權利要求】
1. 一種在患有多發性硬化或處于發展多發性硬化的風險的患者中診斷多發性硬化、預 測發展多發性硬化的風險或預測多發性硬化的結果的方法，所述方法包括以下步驟： a) 確定來自所述患者的樣品中至少一種選自由hsa-miR-16-2_3p、hsa-miR-22_5p、 hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、hsa-miR-100_5p、hsa-miR-20a_5p、hsa-miR-151a_3p 和hsa-miR-7-l_3p組成的組的miRNA的表達水平； b) 比較步驟a)中確定的一種或多種表達水平的式樣和一種或多種參照的表達水平式 樣；以及 c) 由步驟b)中的比較結果診斷多發性硬化、預測發展多發性硬化的風險或預測多發 性硬化的結果。
2. -種對患有多發性硬化或處于發展多發性硬化的風險的患者的樣品進行歸類的方 法，所述方法包括以下步驟： a) 在來自所述患者的樣品中確定至少一種選自由hsa-miR-16-2_3p、hsa-miR-22_5p、 hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、hsa-miR-100_5p、hsa-miR-20a_5p、hsa-miR-151a_3p 和hsa-miR-7-l_3p組成的組的miRNA的表達水平； b) 比較步驟a)中確定的一種或多種表達水平的式樣和一種或多種參照的表達水平式 樣；以及 c) 依據步驟b)中的比較結果將所述患者的樣品歸類為至少兩個對以下進行指示的類 別中的一個：多發性硬化的診斷、發展多發性硬化的風險的預測或多發性硬化的結果的預 測。
3. 根據權利要求1或2的方法，其中所述樣品選自由血液樣品、血清樣品和血漿樣品組 成的組。
4. 根據前述權利要求中任一項的方法，其包括在步驟a)中確定所述miRNA: hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-20a_5p 和 hsa-miR-7-l_3p 的表達水平。
5. 根據前述權利要求中任一項的方法，其包括在步驟a)中確定所述miRNA: hsa-miR-16-2_3p、hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、has-miR-100_5p、hsa-miR-20a_5p、 hsa-miR-151a_3p 和 hsa-miR-7-l_3p 的表達水平。
6. 根據前述權利要求中任一項的方法，其包括在步驟a)中確定所述miRNA: miR-16-2_3p、hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、hsa-miR-100_5p、 hsa-miR-20a_5p、hsa-miR-151a_3p 和 hsa-miR-7-l_3p 的表達水平。
7. 根據前述權利要求中任一項的方法，其中在步驟（a)中確定表達水平通過使用選自 由以下組成的組的方法實現：基于測序的方法、基于陣列的方法和基于PCR的方法。
8. 根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述患者患有CIS和/或RRMS臨床亞型的 多發性硬化或者處于發展CIS和/或RRMS臨床亞型的多發性硬化的風險中。
9. 一種在患有多發性硬化或處于發展多發性硬化的風險的患者中診斷多發性硬化、預 測發展多發性硬化的風險或預測多發性硬化的結果的試劑盒，所述試劑盒包括： -用于在來自所述患者的樣品中確定至少一種選自由hsa-miR-16-2-3p、 hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、hsa-miR-100_5p、hsa-miR-20a_5p、 hsa-miR-151a_3p和hsa-miR-7-l_3p組成的組的miRNA的表達水平的裝置；以及 -至少一種用于和來自所述樣品的至少一種miRNA的表達水平進行比較的參照的表達 水平式樣。
10. -種在患有多發性硬化或處于發展多發性硬化的風險的患者中診斷多發性硬化、 預測發展多發性硬化的風險或預測多發性硬化的結果的計算機程序產品，其包括： -用于接收代表在患者樣品中的至少一種miRNA表達水平的數據的裝置，所述 miRNA 選自由 hsa-miR-16-2_3p、hsa-miR-22_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-629_5p、 hsa-miR-100_5p、hsa-miR-20a_5p、hsa-miR-151a_3p 和 hsa-miR-7-l_3p 組成的組， _用于接收代表至少一種用于和來自所述樣品的至少一種miRNA的表達水平進行比較 的參照的表達水平式樣的數據的裝置， -用于比較代表在患者樣品中的至少一種miRNA的表達水平的所述數據的裝置，和 -用于由步驟b)中的比較結果確定多發性硬化的診斷、發展多發性硬化的風險的預測 或多發性硬化的結果的預測的裝置。
【文檔編號】C12Q1/68GK104428426SQ201380034429
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年4月18日 優先權日:2012年4月27日
【發明者】A.凱勒, E.米斯, C.F.斯特勒, A.卡普爾, P.萊丁格, C.巴克斯 申請人:西門子公司, 西門子保健診斷控股有限責任公司