目標核酸的檢測方法

目標核酸的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了即使減少檢測探針的使用量，也不降低檢測靈敏度(S/N比)，能夠高靈敏度地檢測目標核酸的目標核酸的檢測方法。通過使用與目標核酸雜交的檢測探針以及固定于支持體的捕捉探針的夾心雜交法來進行的目標核酸的檢測方法中，檢測探針和/或捕捉探針的核酸分子中的至少一個核酸堿基被替換為光反應性基團，具有對目標核酸與檢測探針和/或捕捉探針雜交而形成的復合體進行光照射，從而在光反應性基團與目標核酸中的核酸堿基之間形成共價鍵的工序。
【專利說明】目標核酸的檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及利用夾心雜交法的目標核酸的檢測方法。

【背景技術】
[0002] 各種生物的遺傳信息分析的研究已經開始，關于以人類基因為首的大量基因及其 堿基序列、還有由基因序列所編碼的蛋白質和由這些蛋白質二次加工成的糖鏈的信息正在 迅速被闡明。對于序列被闡明的基因、蛋白質、糖鏈等高分子體的功能，可以通過各種方法 來調查。作為主要的方法，對于核酸，可以利用RNA印跡（northernbloting)、或者DNA印 跡（southernbloting)這樣的各種核酸/核酸間的互補性來調查各種基因與其生物體功 能表達的關系。對于蛋白質，可以利用以蛋白質印跡（westernbloting)為代表的蛋白質 /蛋白質間的反應來調查蛋白質的功能和表達。
[0003] 作為核酸檢測方法之一，已知夾心雜交法。夾心雜交法使用被固定于過濾器上的 捕捉探針。捕捉探針與目標核酸的第1部分互補。在一個階段中，使結合于過濾器的捕捉 探針暴露于應對于目標核酸序列進行調查的樣品，進一步暴露于與目標核酸的第2部分互 補的帶有標記的檢測探針，但前述的第2部分與第1探針所互補的目標部分不同（S卩，與它 們不重復）（專利文獻1、2、非專利文獻1)。該方法消除了在過濾器上固定化樣品所需的工 夫，另外可以選擇第1探針使其適合支持體。
[0004] 現有技術文獻
[0005] 專利文獻
[0006] 專利文獻1 :美國專利第4, 486, 539號
[0007] 專利文獻2 :日本特開平7-75600號公報
[0008] 非專利文獻
[0009] 非專利文獻I:Sinikka Parkkinen et al.，Journal of Medical Virology20:279-288 (1986)


【發明內容】

[0010] 發明要解決的課題
[0011]目前，在捕捉探針固定化支持體上使用夾心雜交法來檢測目標核酸時，為了提高 檢測靈敏度，必須使用相對于目標核酸量為過量的檢測探針。例如，根據文獻（日本特開 2001-69997號公報），相對于目標核酸量，需要25萬倍當量的檢測探針。但是，如果使用過 量的檢測探針，則剩余的檢測探針與用于捕捉其他目標核酸的捕捉探針交叉雜交（非特異 性吸附），其結果存在檢測靈敏度（S/N比）降低這樣的課題。
[0012] 本發明的目的是提供即使減小檢測探針的使用量，也不降低檢測靈敏度（S/N 比），能夠高靈敏度地檢測目標核酸的目標核酸的檢測方法。
[0013] 用于解決課題的方法
[0014] 本申請
【發明者】們進行深入研究的結果發現，在夾心雜交法中，通過在目標核酸與 檢測探針和/或捕捉探針雜交而形成的復合體中，在檢測探針和/或捕捉探針中替換了核 酸堿基的光反應性基團與目標核酸中的核酸堿基之間通過光照射而形成共價鍵，從而不使 用過量的檢測探針也能夠高靈敏度地檢測目標核酸，于是完成了本發明。
[0015] 即，本發明提供以下（1)?（4)。
[0016] (1)目標核酸的檢測方法，是通過夾心雜交法來檢測目標核酸的方法，所述夾心雜 交法使用與目標核酸雜交的檢測探針以及固定于支持體的捕捉探針，
[0017] 檢測探針和/或捕捉探針的核酸分子中的至少一個核酸堿基被替換為光反應性 基團，
[0018] 該檢測方法具有對目標核酸與檢測探針和/或捕捉探針雜交而形成的復合體進 行光照射，從而在光反應性基團與目標核酸中的核酸堿基之間形成共價鍵的工序。
[0019] (2)根據（1)所述的檢測方法，檢測探針的核酸分子中的至少一個核酸堿基被替 換為光反應性基團。
[0020] (3)根據（2)所述的檢測方法，捕捉探針的核酸分子中的至少一個核酸堿基被替 換為光反應性基團。
[0021] (4)根據（1)?（3)的任一項所述的檢測方法，光反應性基團是選自3-氰基乙烯 基咔唑基、對氨基甲酰基乙烯基苯酚基、4, 5'，8-三甲基補骨脂素基以及N3-甲基-5-氰基 乙烯基尿嘧啶基中的至少1種。
[0022] 發明的效果
[0023] 根據本發明，能夠降低使用的檢測探針的量，因而能夠抑制與捕捉探針的交叉雜 交（非特異性吸附）。其結果能夠提高檢測靈敏度（S/N比），所以能夠高靈敏度地檢測微 量的目標核酸。

【具體實施方式】
[0024] 作為供于本發明的檢測方法的目標核酸，可列舉例如，病原菌和/或病毒等的基 因、遺傳病的病原基因等及其一部分等，但不限于這些。另外，作為包含這些目標核酸的樣 本，可列舉血液、血清、血漿、尿、糞便、腦脊液、唾液、粘液、各種組織液等體液、和/或各種 組織、石蠟包埋樣本（FFPE)及其切片、各種飲食物以及它們的稀釋物等，但不限于這些。另 夕卜，成為被檢物質的目標核酸可以是從血液和/或細胞通過常規方法提取的樣本核酸，也 可以使用從樣本提取的DNA和/或RNA等。作為DNA，可以使用染色體DNA、病毒DNA、細菌、 霉等的DNA、將RNA進行逆轉錄而得的cDNA、作為它們的一部分的片段等，但不限于這些。作 為RNA，可以使用信使RNA、核糖體RNA、小RNA(smallRNA)和/或作為它們的一部分的片段 等，但不限于這些。另外，化學合成的DNA或者RNA等也可以作為目標核酸使用。
[0025] 所述樣本核酸有時還包含除了作為測定對象的目標核酸以外的核酸成分（非目 標核酸）。這些非目標核酸既可以考慮與目標核酸的性狀的差而除去，也可以不除去地作為 被檢物質使用。
[0026] 目標核酸也可以是以該目標核酸作為模板通過PCR等核酸擴增法進行擴增而得 的，這種情況下，可以大幅提高測定靈敏度。在以核酸擴增產物作為目標核酸的情況下， 通過在用熒光物質等進行了標記的核苷三磷酸的存在下進行擴增，可以將擴增核酸進行標 記。
[0027] 本發明的方法可以在區別目標核酸的有無、病毒的基因型、細菌的種和株、霉的種 和株等的檢測、SNP(單堿基多態性）的檢測、信使RNA的檢測、miRNA的檢測、CGH、拷貝數 變化、基因組DNA序列的缺失?重復?融合、或者轉錄產物的缺失?重復?融合的檢測中使 用。另外，通過測定來自檢測探針的信號強度，還可以應用于目標核酸的定量。此外，如果 進行目標核酸的定量，則必然要進行目標核酸的檢測，因此本發明的"檢測方法"也包含伴 隨定量的情況。
[0028] 本發明的方法中可以直接應用目標核酸，也可以應用目標核酸的片段化處理物。 對于目標核酸的長度，只要捕捉探針、檢測探針能雜交就不特別限制，在目標核酸較長的情 況（1500個堿基以上、特別是4000個堿基以上的情況）下，優選應用通過片段化處理而片 段化成如后述那樣適當的長度而得的片段化處理物。片段化處理物不需要從產生的核酸片 段中選擇特定的核酸片段，可以將片段化處理物直接供于本發明的方法，從而可以提高檢 測靈敏度。
[0029] 作為為了片段化而將目標核酸切斷的方法，可以使用照射超聲波而切斷的方法、 用酶切斷的方法、用限制性酶切斷的方法、使用霧化器的方法、用酸和/或堿切斷的方法 等。在用超聲波切斷的方法的情況下，可以通過控制照射于目標核酸的超聲波的輸出強度 和照射時間來切斷成所期望的長度。
[0030] 支持體可以使用載玻片、膜、珠等。對支持體的材質不特別限定，可列舉玻璃、陶 瓷、硅等無機材料、聚對苯二甲酸乙二醇酯、醋酸纖維素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯 酸甲酯、硅膠等聚合物等。通過使用將多種捕捉探針固定于支持體上而成的微陣列，能夠同 時檢測多種目標核酸。
[0031] 本發明的目標核酸的檢測方法優選應用夾心雜交法。在夾心雜交法中，使用固定 于支持體的捕捉探針、以及檢測探針。捕捉探針、檢測探針是通常分別具有與目標核酸的不 同部分互補的堿基序列，能與目標核酸雜交而選擇性地結合的物質。目標核酸與檢測探針 和/或捕捉探針雜交，形成復合體。通過檢測（測定）與該復合體中的檢測探針結合的標 記體，能夠檢測目標核酸。
[0032] 在本發明中，作為捕捉探針，具體可以使用DNA、RNA、PNA(肽核酸）、LNA(鎖核酸， LockedNucleicAcid)等的核酸衍生物。這里衍生物在核酸的情況下，是指利用突光基團 等形成的標識化衍生物、包含修飾核苷酸（例如受到了包含鹵素、甲基等烷基、甲氧基等烷 氧基、硫代、竣甲基等基團的核昔酸和喊基的再構成、雙鍵的飽和、脫氣基化、氧分子向硫分 子的替換等的核苷酸等）的衍生物等化學修飾衍生物。
[0033] 具有特定堿基序列的單鏈核酸，與具有與該堿基序列或其一部分互補的堿基序列 的單鏈核酸選擇性地雜交而結合，因此相當于本發明中所說的捕捉探針。本發明中使用捕 捉探針可以是市售的，另外，也可以是從活細胞等得到的。作為捕捉探針，特別優選的是核 酸。該核酸中，被稱為寡核酸的長度為200個堿基以下的核酸可以用合成儀容易地人工合 成。
[0034]捕捉探針可以含有與目標核酸序列互補的序列，也可以選擇任何區域。優選與以 下所述的檢測探針的序列不重復。另外，還可以使用與目標核酸的不同區域雜交的多種捕 捉探針。
[0035]在目標核酸是雙鏈DNA或雙鏈RNA的情況下，可以選擇與正義鏈、反義鏈的任一鏈 互補的序列作為捕捉探針。這種情況下，以下所述的檢測探針與捕捉探針優選選擇同一鏈 的序列。
[0036] 在將樣本核酸所含的不同目標核酸進行區別檢測的情況下，例如，將感染患者的 病毒的型進行區別檢測等，優選從樣本核酸所能包含的核酸序列中選擇特異性高的序列區 域。即，是指，選作捕捉探針的序列，在樣本核酸所含的全部序列中，在除了該區域以外不存 在同源性高的序列。
[0037] 本發明中使用的檢測探針、捕捉探針中的任一核酸分子中的至少一個核酸堿基被 替換為光反應性基團，或者檢測探針、捕捉探針兩者的核酸分子中的各有至少一個核酸堿 基被替換為光反應性基團。
[0038] 這里，光反應性基團是通過特定波長的光照射而有機合成反應中的反應性被激活 的有機基團（光反應性部位）。探針中的核酸堿基被替換為光反應性基團后的探針，能夠與 替換前的核酸堿基同樣地與目標核酸雜交而形成復合體。對核酸堿基被替換為光反應性基 團后的捕捉探針和/或檢測探針與目標核酸雜交而形成的復合體照射能激活該光反應性 基團的光反應性部位的波長的光，則該光反應性部位被激活，在該光反應性基團與目標核 酸中的核酸堿基之間形成共價鍵。
[0039] 作為這樣的光反應性基團，可列舉3_氰基乙烯基咔唑基及其衍生物 (W02009/066447(EP2216338,US2010-274000A),YoshinagaYoshimuraetal. ,Organic Letters10:3227-3230(2008))、對氨基甲酰基乙烯基苯酚基（TakehiroAmiet al. ,Organic&BiomolecularChemistry5:2583-2586 (2007))、4, 5'，8-三甲基補骨脂素基 (AkioKoborietal·,ChemistryLetters38:272-273(2009))以及N3-甲基 _5_ 氰基 乙烯基尿啼陡基（KenzoFujimotoetal·,ChemicalCommunications:3177_3179(2005) 等。這些文獻通過參照而被引入本說明書中。其中，優選3-氰基乙烯基咔唑基及其衍生物 (W02009/066447)，特別優選3-氰基乙烯基咔唑基。
[0040] 這里，3-氰基乙烯基咔唑基及其衍生物如W02009/066447所記載的那樣，是下述 式⑴所示的基團。
[0041]

【權利要求】
1. 目標核酸的檢測方法，是通過夾心雜交法來檢測目標核酸的方法，所述夾心雜交法 使用與目標核酸雜交的檢測探針以及固定于支持體的捕捉探針， 檢測探針和/或捕捉探針的核酸分子中的至少一個核酸堿基被替換為光反應性基團， 該檢測方法具有對目標核酸與檢測探針和/或捕捉探針雜交而形成的復合體進行光 照射，從而在光反應性基團與目標核酸中的核酸堿基之間形成共價鍵的工序。
2. 根據權利要求1所述的檢測方法，檢測探針的核酸分子中的至少一個核酸堿基被替 換為光反應性基團。
3. 根據權利要求2所述的檢測方法，捕捉探針的核酸分子中的至少一個核酸堿基被替 換為光反應性基團。
4. 根據權利要求1?3的任一項所述的檢測方法，光反應性基團是選自3-氰基乙烯基 咔唑基、對氨基甲酰基乙烯基苯酚基、4, 5'，8-三甲基補骨脂素基以及N3-甲基-5-氰基乙 烯基尿嘧啶基中的至少1種。
【文檔編號】C12N15/09GK104428424SQ201380034120
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月29日 優先權日:2012年8月31日
【發明者】平野泰亮, 中村史夫, 上田洋二, 藤本健造 申請人:東麗株式會社