利用煙草的方法

利用煙草的方法
【專利摘要】本發明涉及由煙草生物質得到成分或產品的方法。具體而言，本發明涉及由單一煙草生物質原料取得兩種以上成分或產品的方法，其中，在所述方法中，至少一種成分或產品，例如煙堿，從液相中提取，并且至少一種成分或產品，例如醇等有機分子，由固相產生。本發明還涉及由源自生物質原料的有機分子合成的產品，特別是塑料。
【專利說明】利用煙草的方法
[0001] 本發明涉及由煙草生物質得到成分或產物的方法。具體而言，本發明涉及由單一 煙草生物質原料取得兩種以上成分或產物的方法，其中，在所述方法中，至少一種成分或產 品，例如煙堿，從液相中提取，并且至少一種成分或產品，例如醇等有機分子，由固相產生。 產生的任何有機分子均優選用于生產能夠結合至塑料中的聚合物。

【背景技術】
[0002] 吸煙是由于煙堿的刺激作用以及煙堿是高度成癮性物質所導致的常見活動。然 而，如一氧化碳和焦油等煙草煙霧的其他成分也嚴重損害人體健康。鑒于健康風險，吸煙的 趨勢在一些國家已經降低，而對能夠僅提供煙堿的產品的需求已經升高。已開發出許多煙 堿替代療法，包括煙堿皮膚貼、含煙堿口香糖、煙堿藥筒和煙堿吸入器。此外，仿真吸煙裝置 可以模擬吸煙活動，并具有在未來二十年間使用危害降低的替代物替代可燃煙草產品消費 的潛力。
[0003] 用于這些替代療法和吸煙裝置的煙堿可以通過加工煙草生物質以產生純化形式 的煙堿而獲得。從煙草植株提取煙堿的標準方法描述于US896, 124、US1，823, 554和US 2, 128, 043 中。
[0004] 源于植物的生物質是有價值的可再生資源，并能用于生產如乙醇或"生物乙醇" 等有機分子，所述有機分子可被用作生物燃料，或用作生產如生物塑料等材料及由其制造 的產品。木質纖維素材料是最豐富的植物生物質資源。該材料的纖維素和半纖維素部分 可以水解成如葡萄糖和木糖等糖，所述糖然后可通過發酵轉化為乙醇。與使用木質纖維素 植物材料相關的困難在于，纖維素和半纖維素通過木質素層而密堆積，這保護它們免于酶 解。因此，該材料必須進行"預處理"步驟，以破壞木質纖維素生物質的結構，并促進該材 料后續通過纖維素酶和半纖維素酶進行的水解。已研宄了各種預處理方法，包括利用高 溫、壓力爆破、利用酸和堿，和添加各種其他化學品。通常優選的是利用稀酸溶液，因為酸 的成本較低。由植物木質纖維素生物質產生醇類的示例性方法描述于US2010/0143974和 W02012/047832 中。
[0005] -些需要大量包裝材料的公司已經開始由植物生物質獲得其塑料。例如，作為 US2009/0246430的主題，Coca-ColaPlantBottle就是使用來自如甘蔗等植物的生物質。 在P印SiCo開發的可再生包裝中，將如玉米皮等農業廢品用作生物質來源。
[0006] 煙草植物以前被描述為用于生產燃料乙醇的木質纖維素生物質來源。在C.Martin etal·，WorldJ.Microb.Biot. 2002, 18, 857中描述了一種方法，其中通過蒸汽爆破預處 理的煙草梗暴露于纖維素酶，水解產物隨后發酵以獲得乙醇。在G.Shenetal.，J.Food ProcessEng. 2011，34, 905中，作者對于用于調查不同預處理條件對于后續煙草莖中纖維 素的酶水解效率的影響進行的研宄作了報道。發現與只用堿的預處理相比，過氧化氫的納 入提供了更高的纖維素回收率和更佳的木質素和半纖維素去除率。這使得由該生物質產生 的可發酵糖的收率增加。


【發明內容】

[0007] 本發明建立在以下觀察之上：現有的由煙草植株提取液相中的成分或產物的方 法、特別是煙堿提取方法產生極大量殘余固體材料，其通常被認作"廢料"。另外，加工煙草 植株以回收用于吸煙制品的葉子會留下包括莖、梗和根等植株類材料。
[0008] 將煙草植株作為整體考慮，其通常含有以干重計小于2重量％的煙堿。其余部分 包括木質纖維素材料，其適合用于生產附加值產品的加工。對于煙草植株，附加值產品的 回收僅在近來才開始被考慮，這主要是由于在用于吸煙制品時煙葉的歷史上的高價值。然 而，隨著這些吸煙制品市場的萎縮，由這些以前被認作"廢料"的成分中獲取價值變得越發 重要。
[0009] 煙堿提取方法通常獲得包含煙堿的液相和包含木質纖維素物質的固體成分。由于 用于提取方法的苛性堿溶液和有機溶劑所致，所產生的廢料中有一些是有毒的。此外，所述 固體物質通常被認為是廢品，并被再循環或銷售給農民作為肥料。
[0010] 此外，在例如US896, 124中所述的一些煙堿提取方法中，其目標是要保留煙葉的 完整性，以使煙葉之后可被用于吸煙應用。這些方法并未充分破壞木質素的結構以便有效 水解多糖。
[0011] 如上所述，使用植物纖維素物質作為可再生資源產生有機前體以供制造生物類材 料和包括生物燃料和生物塑料的產品，已因這類產品的環境效益而得到越來越多的關注。 然而，本發明人已經注意到，現有的由煙草生物質獲得如乙醇等有機分子的方法采用雖然 在破壞生物質結構時非常有效卻導致植物材料的半纖維素部分顯著溶解的預處理步驟。這 些溶解的糖和糖聚合物起到污染所產生的任何液體部分的作用，因此這類方法以前從未用 于如煙堿等所關注的水溶性分子的聯合提取。此外，US2002/0197688教導了一種利用減少 煙堿的重組煙草植株作為生物質來源通過發酵產生乙醇的方法，所述方法也降低了由生物 質產生多種成分的可能。
[0012] 因此，本發明的一個目的是提供可以使用煙草生物質原料得到超過一種有用的物 質或產品的方法。
[0013] 在第一方面中，本文提供一種由煙草生物質原料得到兩種以上成分或產物的方 法，其中，至少一種成分或產物從液相中提取，并且至少一種成分或產物由固相產生，其中， 所述方法包括以下步驟：
[0014] (a)使用堿水溶液處理該生物質原料，以產生液相和含有不溶的煙草纖維素材料 的固相；
[0015] (b)將該液相與該固相分咼；
[0016] (C)通過液-液或固相提取從液相中提取至少一種成分或產物；
[0017] (d)將該固相與一種或多種能夠水解該纖維素材料的酶接觸，以產生可發酵糖； 和
[0018] (e)使該可發酵糖發酵，以由該固相產生至少一種成分或產物。
[0019] 優選的是，從該液相中提取的成分或產物為水溶性成分或產物，其可選地選自由 生物堿、檸檬酸、果膠、類胡蘿卜素、果膠酶、部分1蛋白、部分2蛋白和酚類化合物組成的 組。作為另外一種選擇或補充，由該固相產生的成分或產物為選自由醇、醛、烷烴、烯烴、苯 甲酸類化合物、羧酸、酮、多元醇組成的組中的有機分子。在本發明的一個特別優選的實施 方式中，由該液相提取的成分或產物為煙堿，并且由該固相產生的成分或產物為乙醇。
[0020] 由本發明的方法產生的任何有機分子可以用于任何適當的下游應用。在本發明的 優選實施方式中，該方法用于產生如乙醇等有機分子，其可用于生產生物類塑料。本文中所 使用的術語"生物塑料"意指包含由生物類材料（包括但不限于源自植物生物質的醇、醛、 烷烴、烯烴、苯甲酸類化合物、羧酸、酮或多元醇）得到的聚合物的任何塑料。生物塑料越來 越受關注，因為它們代表著由如石油等不可再生天然資源得到的塑料的重要替代品。
[0021] 利用本發明的方法由煙草生物質生產的生物塑料可用于制造一系列不同產品。在 本發明的優選實施方式中，所生產的生物塑料用于制造含有煙堿的產品。含有煙堿的產品 包括煙堿吸入器，如描述于W02011/095781中的仿真吸煙裝置。
[0022] 如上所述，隨著吸煙的減少，對于如煙堿藥筒、煙堿吸入器和仿真吸煙裝置等煙堿 替代產品的需求趨勢在增強。但是，這些產品中許多需要大量塑料包裝和/或在其設計中 包含大量塑料。本發明的方法可使含有塑料的煙堿替代療法和裝置所需的煙堿和塑料的有 機前體均至少部分地由同一煙草生物質原料得到。
[0023] 因此，在本發明的第二方面中，本文提供一種煙堿替代產品，所述產品包含煙堿和 至少部分地由一種或多種有機前體合成的塑料，其中，煙堿和至少有一種有機前體均由同 一煙草生物質原料得到。
[0024] 在附加的環境效益方面，通過從煙草植株中得到除煙堿或吸用煙草之外的有用產 物，本發明將代表對于當前用于煙草種植的耕地的更有效利用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1.從單一煙草生物質原料中提取煙堿和產生乙醇的方法的示意圖。

【具體實施方式】
[0026] 本文提供一種由煙草生物質原料得到兩種以上成分或產物的方法，其中，至少一 種成分或產物由液相提取，并且至少一種成分或產物由固相產生。因此該方法可使兩種以 上成分或產物由同一初始材料（即，煙草生物質原料）獲得。
[0027] 本文中所使用的術語"煙草生物質"意指由任何煙草屬植物（包括但不限于普通 煙草（N.tabacum)、黃花煙草（N.rustica)和粘煙草（N.glutinosa))得到的生物質。可以使 用的具體煙草品種的實例包括：明葉（brightleaf)、白肋煙（burley)、板煙（cavendish)、 corojo、克里奧（criollo)、東方（oriental)、帕里克（perique)、佩蒂特哈瓦那（petite Havana)、薩姆松NN(SamsunNN)、SR1、老煙（thuoclao)、22 型（type22)、弗吉尼亞 (Virginia)、白白肋煙（whiteburley)、山煙草（wildtobacco)、珊西（Xanthi)和Yl。生 物質可以由整個植株或其任何部分得到，包括但不限于葉、芽、花、莖、梗、根或其組合。生物 質可以包括未加工煙草、煙草廢料、風干煙、火烤煙、熱風管烤煙、日曬煙或其組合。
[0028] "煙草生物質原料"或"煙草生物質投料"應被理解為指限定量的用作本發明的方 法中的初始材料的生物質。煙草生物質原料具有包含至少〇. 1重量％煙堿的干物質，并可 以由煙草生物質得到。然而，它可以還包括非煙草來源，如玉米秸桿、柳枝稷、甜菜、甘蔗渣、 小麥渣和任何種類的農業廢棄物。
[0029] 在一個優選實施方式中，煙草生物質原料具有包含至少0. 1重量％煙堿和至少25 重量％纖維素的干物質。在另一個優選實施方式中，煙草生物質原料具有包含至少25重 量％纖維素、至少15重量％半纖維素、至少10重量％木質素和至少0. 1重量％煙堿的干物 質。
[0030] 煙草生物質可以通過任何標準收獲技術獲得。生物質或生物質原料可以在用堿處 理之前進行洗滌，以除去任何殘留的泥土和/或種植過程中使用的水溶性非系統性試劑。 另外，可以將煙草生物質或生物質原料的尺寸減小，使其成為在所有維度均小于15mm、優選 在所有維度均小于IOmm的碎片，以便于更好地接觸該方法的后續步驟中所使用的試劑。任 何適當的減小尺寸的方法均可以采用，包括但不限于削、砍、切、碾、磨碎和撕碎。
[0031] 作為另外一種選擇或對洗滌和/或尺寸減小的補充，可以對用于本發明的方法的 煙草生物質進行預加工，例如在處理之前除去或提取某些產物或成分。在本發明的某些實 施方式中，生物質原料將進行預加工，以除去至少一種油溶性成分或產物，其可選地選自茄 尼醇和聚戊烯醇。這種預加工步驟可以包括在進行如下所述的本發明的方法的步驟（a)? (e)之前，將生物質原料浸泡在弱堿溶液中預定時間。
[0032] 本發明的方法包括以下步驟：
[0033] (a)使用堿水溶液處理該生物質原料，以產生液相和含有不溶的煙草纖維素材料 的固相；
[0034] (b)將該液相與該固相分咼；
[0035] (C)通過液-液或固相提取從液相中提取至少一種成分或產物；
[0036] (d)將該固相與一種或多種能夠水解該纖維素材料的酶接觸，以產生可發酵糖； 和
[0037] (e)使該可發酵糖發酵，以由該固相產生至少一種成分或產物。
[0038] 處理牛物質原料
[0039] 作為本發明的方法中的第一步驟，在可使生物質中可溶性成分溶解同時破壞該生 物質的木質纖維素結構的條件下使用堿水溶液處理該生物質原料。
[0040] 該處理步驟產生包含煙草生物質原料的可溶性成分的液相，和含有不溶的煙草纖 維素材料的固相。該生物質原料的可溶性成分可以是如下文中將進一步詳述的水溶性成 分。
[0041] 重要的是，在處理過程中，木質素充分降解，以使不溶的煙草纖維素材料在該方法 的后續步驟中被如纖維素酶和半纖維素酶等酶水解。本發明的方法通常除去至少30%存 在于該生物質中的木質素。該處理步驟中的條件優選為使得糖聚合物（如纖維素和半纖維 素）對于液相的溶解和后續損失最小化。重要的是，在生物質原料的處理過程中，煙草生物 質原料的盡可能多的含糖部分保持在固相中，以用于包括水解和發酵的下游加工步驟。
[0042] 所述堿水溶液可以具有約0.OlM?約2. 0M、優選約0.IM?約I.OM的濃度。可以 使用任何適當的堿溶液。可用于本發明的方法的堿的實例包括但不限于氨、氫氧化銨、氫氧 化媽、氧化媽、氫氧化鉀和氫氧化鈉。在一個優選實施方式中，堿溶液為濃度為約0.IM?約 I. 0M、優選0. 5M的氫氧化鈉溶液。
[0043] 在一個優選實施方式中，將堿溶液添加至該生物質，以實現約5重量％?約25重 量％固體含量、優選約10重量％?約20重量％、更優選約12重量％固體含量的最終稀釋。
[0044] 在該方法的第一步驟中，生物質-堿溶液可以在約100°C?約200°C的溫度、優 選約100°C?約150°C或者其間的任何溫度（包括但不限于100°C、105°C、110°C、115°C、 120°C、125°C、130°C、135°C、140°C、145°C或 150°C)處理約 2 分鐘?約 120 分鐘的時間，優 選約2分鐘?約20分鐘，優選約6分鐘?約20分鐘或者其間的任何時間，包括但不限于6 分鐘、8分鐘、10分鐘、12分鐘、14分鐘、16分鐘、18分鐘或20分鐘。溶液的溫度然后可以 降至約25°C?約50°C，以便于該處理材料的后續處置。
[0045] 在一個實施方式中，該處理在壓力容器中進行，并且在處理過程中攪拌生物 質-堿溶液。
[0046] 分離液相和固相
[0047] 在使用堿水溶液處理生物質原料之后，則生成兩相：包含堿溶液和來自存在于其 中的煙草生物質的可溶性成分或產物或水溶性產物的液相，和含有不溶的煙草纖維素材料 的經處理的固相。這兩相可以通過本領域技術人員所知的任何適當技術分離。例如，可以 單獨或組合利用任何以下裝置來進行液-固分離步驟：離心分離機、濾布、濾紙、壓濾機、多 孔漏斗、膜、網、篩濾器、分液漏斗、篩或撇渣器。分離技術可以利用重力流動、離心力或外部 施加的壓力。
[0048] 與最初的有機生物質原料相比，經處理的固相能夠被限定。經處理的固相將具有 降低的煙堿、多糖和木質素含量（與最初的生物質原料相比）。優選的是，經處理的固相的 煙堿減少至少70%，多糖減少小于20%，并且木質素減少至少30% (與最初的生物質原料 相比）。
[0049] 可從液相中得到的成分或產物通常包括生物堿、類胡蘿卜素、檸檬酸、部分1蛋 白、部分2蛋白、木質素、煙堿、果膠酶、果膠和酚類化合物。在某些實施方式中，本發明的 方法的一個目的是提取或分離選自包括生物堿、類胡蘿卜素、檸檬酸、部分1蛋白、部分2蛋 白、木質素、煙堿、果膠酶、果膠、酚類化合物的組中的至少一種水溶性成分或產物或者來自 包括聚戊烯醇和茄尼醇的組中的油提取化合物。在本發明的一個優選實施方式中，要提取 的水溶性成分為煙堿。
[0050] 在本發明的一個實施方式中，通過過濾堿處理的生物質、優選通過濾布層過濾而 將液相與固相分離。含有不溶的煙草纖維素材料的固相隨后可以例如用水洗滌。洗滌可 以根據需要重復一次或多次，以在液相中回收盡可能多的來自生物質的所期望的可溶性成 分。
[0051] 提取可溶件成分
[0052] 所關注的可溶性成分或產物、優選水溶性成分或產物，可以通過任何適當的 液-液或固相提取技術而從液相中提取。在某些實施方式中，從液相中提取目標產物可以 通過將該液體與有機溶劑接觸而實現。適當的有機溶劑包括但不限于長碳鏈烴，如己烷、 煤油、石蠟和甲苯或其混合物。該有機-水混合物可以進行離心分離，或在重力下沉降，以 實現相分離。有機相可以通過分液漏斗分離，或者通過泵吸或重力從反應容器中移出。可 選的是，可以進行對所收集的水相的進一步加工，以提取殘留的可溶性或水溶性成分，或者 在所述方法的發酵階段或任何其他階段將成分再循環回方法中。隨后可以使有機相與PH 1.0?7.0的酸化溶液接觸。適當的酸包括但不限于乙酸、檸檬酸、鹽酸、磷酸或硫酸。該 有機-水混合物可以進行離心分離，或在重力下沉降，以實現相分離。有機相可以通過分液 漏斗分離，或者通過泵吸或重力從反應容器中移出。然后可選的是該有機相可以被回收和 再循環以用于該方法。可選的是，可以使用任何適當的堿來中和含有目標產物的酸化溶液。 適當的堿的實例包括但不限于氨、碳酸鈣和碳酸鈉。作為另外一種選擇，可以在無需中和與 進一步純化的情況下將目標成分或產物濃縮并就這樣銷售，以提供至少40%目標可溶性分 子的濃度。可選的是，然后可以利用并未窮舉的以下方法，進一步純化被中和的水相，以提 供90%?99. 9%、優選95%?99. 9%、進而更優選98%?99. 9%的純度：稀釋回收含有目 標化合物的部分，例如利用在大氣壓下的蒸餾及其后的真空蒸餾，或者利用高壓蒸汽蒸餾 來進行。
[0053] 作為另外一種選擇，目標成分或產物、優選水溶性產物可以通過利用固相提取或 超臨界流體提取，例如通過將色譜柱用于固相提取和將超臨界二氧化碳用于超臨界流體提 取，從液相中提取。
[0054] 其中，要提取的可溶性成分或產物為煙堿，該提取可以通過下述方式進行：使該液 相與石蠟接觸、離心分離該混合物、收集含石蠟的相和與〇.IM硫酸接觸、離心分離該混合 物、收集含硫酸相并用堿中和、在約125°C蒸餾直至除去水、在約125°C和約1.6kPa真空蒸 餾，并收集含煙堿餾分。
[0055] 相對于干生物質中所含煙堿的重量百分比算出的煙堿收率通常為至少70 %，優選 至少80%，更優選至少90%。本發明的方法通常將獲得純度為至少40%、優選至少95%、 更優選至少99 %的煙堿。
[0056] 水解纖維素材料
[0057] 使用能夠將固相中的纖維素材料轉化為可發酵糖的水解酶處理由液相-固相分 離獲得的固相。此處所使用的術語"可發酵糖"應被理解為指能夠在發酵過程中通過微生 物而用作碳源的任何寡糖或單糖。
[0058] 可選的是，由液相-固相分離獲得的固相可以在與水解酶接觸之前進行蒸壓。在 一個實施方式中，該固相在與水解酶接觸之前在約121°C蒸壓約15分鐘。該固相可以在溶 液中稀釋至約5重量％?約25重量％，優選約10重量％?20重量％。
[0059] 此處所使用的術語"水解酶"應被理解為指能夠水解半纖維素（半纖維素酶）和 /或纖維素（纖維素酶）的任何酶或酶混合物。纖維素酶可以包括下述種類的酶：內切葡 聚糖酶、外切纖維素酶和纖維二糖酶。半纖維素酶包括木聚糖酶、半乳糖苷酶、甘露聚糖 酶、阿拉伯糖酶等。例如，適當的商品酶包括但不限于cellicCtec2?、cellicCtec3?、 cellicHtec2?、cellicHtec33i(NovozymesBagsvaerd，丹麥）、accelleraseduet?、 accellerasetrio?(GenencorPaloAlto,CAUSA)、celustarCL、celustarXL、 cellulaseplus、xylanaseplus(DyadicJupiter,FLUSA)。對于本方法，所使用的 酶可以來自任何來源，適當來源的實例包括但不限于曲霉（AspergiIlus)和木霉屬 (Trichoderma)。纖維素酶和半纖維素酶用于反應的劑量取決于具體酶菌株將纖維素和半 纖維素轉化為可發酵糖的能力，例如，其范圍可以為約1:20?約1:5的酶與固體生物質之 重量比，其中纖維素酶：半纖維素酶之比根據所使用的具體種類的生物質確定，例如纖維 素酶：半纖維素酶之比為1:5?5:1。
[0060] 在所述方法的水解步驟中通常調整固相的pH和溫度，以使其處于最適合所使用 的水解酶的范圍之內。在一個實施方式中，該固相的pH被調節在約pH2.0?約pH8.0范 圍內，優選在約pH2. 0?約pH7. 0范圍內，更優選在約pH4. 0?約pH6. 0范圍內，或者 為其間的任何pH。作為另外一種選擇或補充，溫度可以在約30°C?約75°C范圍內，優選在 約40 °C?約60 °C范圍內，或者其間的任何溫度，包括但不限于40 °C、45 °C、50 °C或55 °C。可 以將該固相與酶在本領域技術人員已知的任何適當緩沖液中混合，所述緩沖液包括但不限 于檸檬酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液。在一個優選實施方式中，使該固相與水解酶在具有所 期望的PH和溫度的約0.IM檸檬酸鹽緩沖液存在下接觸，使得混合物的固體成分不超過20 重量％。酶與固體成分的重量比可以為1/20?1/5。
[0061] 可以使該固相與水解酶接觸任何適當長度的時間，以實現纖維素材料向可發酵糖 的轉化。可發酵糖可以包括：葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖、葡糖醛酸、甘露糖或這 些單糖的任何寡糖形式。
[0062] 在本發明的一個優選實施方式中，至少50%、優選至少60%、更優選至少70%、 80%的多糖將降解，并且所獲得的包含可發酵糖的降解產物可以采用本文所述的方法在水 解產物中回收。
[0063] 在一個實施方式中，溫育該混合物（可選地在攪拌下）約0. 5天?約5天的時間。
[0064] 發醛
[0065] 在酶水解后，使含有可發酵糖的水解產物發酵，以產生至少一種成分或產物，通 常為有機分子。可以在用于發酵之前先將水解產物稀釋。發酵可以通過添加能夠將該可 發酵糖轉化為有機分子的任何天然存在或基因改造的微生物來進行。此處所使用的術語 "有機分子"應被理解為指選自由以下分子組成的組中的分子：醇、醛、烷烴、烯烴、苯甲酸 類化合物、羧酸、酮或多元醇。例如，可以產生如乙醇和丁醇等醇、如丁二醇和丙二醇等多 元醇、如甲烷等烷烴、如乙烯和丙烯等烯烴和如檸檬酸和乳酸等羧酸。在某些實施方式中， 有機分子可以選自由以下分子組成的組：甲烷、甲醇、乙烷、乙烯、乙醇、正丙烷、1-丙烯、 1-丙醇、丙醛、丙酮、丙酸酯、正丁烷、1-丁烯、1-丁醇、丁醛、丁酸酯、異丁醛、異丁醇、2-甲 基丁醛、2-甲基丁醇、3-甲基丁醛、3-甲基丁醇、2- 丁烯、2- 丁醇、2- 丁酮、2, 3- 丁二醇、 3- 羥基-2- 丁酮、2, 3- 丁二酮、乙基苯、乙烯基苯、2-苯基乙醇、苯基乙醛、1-苯基丁烷、 4- 苯基-1- 丁烯、4-苯基-2- 丁烯、1-苯基-2- 丁烯、1-苯基-2- 丁醇、4-苯基-2- 丁 醇、1-苯基-2- 丁酮、4-苯基-2- 丁酮、1-苯基-2, 3- 丁二醇、1-苯基-3-羥基-2- 丁酮、 4_苯基_3_輕基_2_ 丁酬、1-苯基_2, 3_ 丁二酬、正戊燒、乙基苯酷、乙條基苯酷、2_ (4_輕 基苯基）乙醇、4-羥基苯基乙醛、1-(4-羥基苯基）丁烷、4-(4-羥基苯基）-1-丁烯、 4- (4-羥基苯基）-2- 丁烯、1- (4-羥基苯基）-1- 丁烯、1- (4-羥基苯基）-2- 丁醇、4- (4-羥 基苯基）-2-丁醇、1-(4-羥基苯基）-2-丁酮、4-(4-羥基苯基）-2-丁酮、1-(4-羥基苯 基）-2, 3- 丁二醇、1- (4-羥基苯基）-3-羥基-2- 丁酮、4- (4-羥基苯基）-3-羥基-2- 丁 酮、1-(4-羥基苯基基）_2, 3-丁二酮、吲哚基乙烷、吲哚基乙烯、2-(吲哚-3-)乙醇、正戊 烷、1-戊烯、1-戊醇、戊醛、戊酸酯、2-戊烯、2-戊醇、3-戊醇、2-戊酮、3-戊酮、4-甲基戊 醛、4-甲基戊醇、2, 3-戊二醇、2-羥基-3-戊酮、3-羥基-2-戊酮、2, 3-戊二酮、2-甲基戊 烷、4-甲基-1-戊烯、4-甲基-2-戊烯、4-甲基-3-戊烯、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊 醇、4-甲基-2-戊酮、2-甲基3-戊酮、4-甲基-2, 3-戊二醇、4-甲基-2-羥基-3-戊酮、 4-甲基-3-羥基-2-戊酮、4-甲基-2, 3-戊二酮、1-苯基戊烷、1-苯基-1-戊烯、1-苯 基-2-戊烯、1-苯基-3-戊烯、1-苯基-2-戊醇、1-苯基-3-戊醇、1-苯基-2-戊酮、1-苯 基-3-戊酮、1-苯基-2, 3-戊二醇、1-苯基-2-羥基-3-戊酮、1-苯基-3-羥基-2-戊酮、 1-苯基-2, 3-戊二酮、4-甲基-1-苯基戊烷、4-甲基-1-苯基-1-戊烯、4-甲基-1-苯 基-2-戊烯、4-甲基-1-苯基-3-戊烯、4-甲基-1-苯基-3-戊醇、4-甲基-1-苯基-2-戊 醇、4-甲基-1-苯基-3-戊酮、4-甲基-1-苯基-2-戊酮、4-甲基-1-苯基-2, 3-戊二醇、 4-甲基-1-苯基-2, 3-戊二酮、4-甲基-1-苯基-3-羥基2-戊酮、4-甲基-1-苯基-2-羥 基_3_戊酮、1_(4_輕基苯基）戊燒、1_(4_輕基苯基）_1_戊稀、1_(4_輕苯基）_2_戊稀、 1- (4-羥基苯基）-3-戊烯、1- (4-羥基苯基）-2-戊醇、1- (4-羥基苯基）-3-戊醇、1- (4-羥 基苯基）-2-戊酮、1- (4-羥基苯基）-3-戊酮、1- (4-羥基苯基）-2, 3-戊二醇、1- (4-羥基 苯基）-2-羥基-3-戊酮、1- (4-羥基苯基）-3-羥基-2-戊酮、1- (4-羥基苯基）-2, 3-戊二 酮、4-甲基-1-(4-羥苯基）戊烷、4-甲基-1-(4-羥基苯基）-2-戊烯、4-甲基-1-(4-羥 苯基）-3_戊烯、4-甲基-1-(4-羥基苯基）-1-戊烯、4-甲基-1-(4-羥苯基）-3-戊醇、 4-甲基-1-(4-羥苯基）-2-戊醇、4-甲基-1-(4-羥苯基）-3-戊酮、4-甲基-1-(4-羥苯 基）-2-戊酮、4-甲基-1- (4-羥基苯基）-2, 3-戊二醇、4-甲基-1- (4-羥基苯基）-2, 3-戊二 酮、4-甲基-1- (4-羥基苯基）-3-羥基-2-戊酮、4-甲基-1- (4-羥基苯基）-2-羥基-3-戊 酮、1-吲哚-3-戊烷、1-(吲哚-3) -1-戊烯、1-(吲哚-3) -2-戊烯、1-(吲哚-3) -3-戊烯、 1-(吲哚-3) -2-戊醇、1-(吲哚-3) -3-戊醇、1 -(吲哚-3) -2-戊酮、1-(吲哚-3) -3-戊酮、 1-(吲哚-3) -2, 3-戊二醇、1-(吲哚-3) -2-羥基-3-戊酮、1-(吲哚-3) -3-羥基-2-戊酮、 1_(吲哚-3)-2,3-戊二酮、4-甲基-1-(吲哚-3)戊烷、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊烯、4-甲 基-1-(吲哚-3) -3-戊烯、4-甲基-1-(吲哚-3) -1-戊烯、4-甲基-2-(吲哚-3) -3-戊醇、 4-甲基-1-(吲哚-3) -2-戊醇、4-甲基-1-(吲哚-3) -3-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3) -2-戊 酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2, 3-戊二醇、4-甲基-1-(吲哚-3-基）-2, 3-戊二酮、4-甲 基-1-(吲哚-3)-3-羥基-2-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-羥基-3-戊酮、正己烷、1-己 烯、1-己醇、己醛、己酸酯、2-己烯、3-己烯、2-己醇、3-己醇、2-己酮、3-己酮、2, 3-己二醇、 2, 3-己二酮、3, 4-己二醇、3, 4-己二酮、2-輕基-3-己酮、3-輕基-2-己酮、3-輕基-4-己 酮、4-羥基-3-己酮、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2-甲基-2-己烯、2-甲基-3-己烯、5-甲 基_1_己條、5-甲基己條、4-甲基己條、4-甲基己條、3-甲基己條、3-甲 基-2-己烯、3-甲基-1-己烯、2-甲基-3-己醇、5-甲基-2-己醇、5-甲基-3-己醇、2-甲 基-3-己酮、5-甲基-2-己酮、5-甲基-3-己酮、2-甲基-3,4-己二醇、2-甲基-3,4-己二 酮、5-甲基-2,3-己二醇、5-甲基-2,3-己二酮、4-甲基-2,3-己二醇、4-甲基-2,3-己二 酮、2-甲基-3-羥基-4-己酮、2-甲基-4-羥基-3-己酮、5-甲基-2-羥基-3-己酮、5-甲 基-3-羥基-2-己酮、4-甲基-2-羥基-3-己酮、4-甲基-3-羥基-2-己酮、2,5-二甲基己 燒、2, 5-二甲基己條、2, 5-二甲基己條、2, 5-二甲基己醇、2, 5-二甲基己 酮、2,5-二甲基-3,4-己二醇、2,5-二甲基-3,4-己二酮、2,5-二甲基-3-羥基-4-己酮、 5-甲基-1-苯基己烷、4-甲基-1-苯基己烷、5-甲基-1-苯基-1-己烯、5-甲基-1-苯 基-2-己烯、5-甲基-1-苯基-3-己烯、4-甲基-1-苯基-1-己烯、4-甲基-1-苯基-2-己 烯、4-甲基-1-苯基3-己烯、5-甲基-1-苯基-2-己醇、5-甲基-1-苯基-3-己醇、4-甲 基-1-苯基-2-己醇、4-甲基-1-苯基-3-己醇、5-甲基-1-苯基-2-己酮、5-甲基-1-苯 基-3_己酬、4_甲基-1-苯基_2_己酬、4_甲基-1-苯基_3_己酬、5_甲基-1-苯基_2,3_己 二醇、4-甲基-1-苯基-2,3-己二醇、5-甲基-1-苯基-3-羥基-2-己酮、5-甲基-1-苯 基-2-羥基-3-己酮、4-甲基1-苯基-3-羥基-2-己酮、4-甲基-1-苯基-2-羥基-3-己 酮、5-甲基-1-苯基-2, 3-己二酮、4-甲基-1-苯基2, 3-己二酮、4-甲基-1-(4-輕基苯 基）己烷、5-甲基-1-(4-羥基苯基）-1-己烯、5-甲基-1-(4-羥基苯基）-2-己烯、5-甲 基-1-(4-羥基苯基）-3-己烯、4-甲基-1-(4-羥基苯基）-1-己烯、4-甲基-1-(4-羥基苯 基）-2-己烯、4-甲基-1-(4-羥苯基）-3-己烯、5-甲基-1-(4-羥基苯基）-2-己醇、5-甲 基-1-(4-羥基苯基）-3-己醇、4-甲基-1-(4-羥基苯基）-2-己醇、4-甲基-1-(4-羥基 苯基）-3-己醇、5-甲基-1-(4-輕基苯基）-2_己酮、5-甲基-1-(4-輕基苯基）-3_己酮、 4-甲基-1- (4-羥基苯基）-2-己酮、4-甲基-1- (4-羥基苯基）-3-己酮、5-甲基-1- (4-羥 基苯基）-2, 3-己二醇、4-甲基-1-(4-羥基苯基）-2, 3-己二醇、5-甲基-1-(4-羥基苯 基）-3-羥基-2-己酮、5-甲基-1-(4-羥基苯基）-2-羥基-3-己酮、4-甲基-1-(4-羥基 苯基）-3-羥基-2-己酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基）-2-羥基-3-己酮、5-甲基-1-(4-羥 基苯基）-2, 3-己二酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基）-2, 3-己二酮、4-甲基-1-(吲哚-3-) 己烷、5-甲基-1-(吲哚-3-)-1-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-己烯、5-甲基-1-(吲 哚-3)-3-己烯、4-甲基1-(吲哚-3)-1-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己烯、4-甲 基-1-(吲哚-3)-3-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-己醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己醇、 4-甲基-1-(吲哚-3) -2-己醇、4-甲基-1-(吲哚-3) -3-己醇、5-甲基-1-(吲哚-3) -2-己 酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己酮、4-甲基-1-(吲 哚-3)-3-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2, 3-己二醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2, 3-己二 醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-羥基-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-羥基-3-己酮、 4-甲基-1-(吲哚-3) -3-羥基-2-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3) -2-羥基-3-己酮、5-甲 基-1-(吲哚-3)-2, 3-己二酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2, 3-己二酮、正庚烷、1-庚烯、1-庚 醇、庚醛、庚-2-庚烯、3-庚烯、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇、2-庚酮、3-庚酮、4-庚酮、2, 3-庚 二醇、2, 3-庚二酮、3, 4-庚二醇、3, 4-庚二酮、2-羥基-3-庚酮、3-羥基-2-庚酮、3-羥 基-4-庚酮、4-羥基-3-庚酮、2-甲基庚烷、3-甲基庚烷、6-甲基-2-庚烯、6-甲基3-庚 條、2_甲基_3_庚條、2_甲基_2_庚條、5_甲基_2_庚條、5_甲基_3_庚條、3_甲基_3_庚 烯、2-甲基-3-庚醇、2-甲基-4-庚醇、6-甲基-3-庚醇、5-甲基-3-庚醇、3-甲基-4-庚 醇、2-甲基-3-庚酮、2-甲基-4-庚酮、6-甲基-3-庚酮、5-甲基-3-庚酮、3-甲基-4-庚 酮、2-甲基-3, 4-庚二醇、2-甲基-3, 4-庚二酮、6-甲基-3, 4-庚二醇、6-甲基-3, 4-庚二 酮、5-甲基-3, 4-庚二醇、5-甲基-3, 4-庚二酮、2-甲基-3-羥基-4-庚酮、2-甲基4-羥 基-3-庚酮、6-甲基-3-羥基-4-庚酮、6-甲基-4-羥基-3-庚酮、5-甲基-3-羥基-4-庚 酮、5-甲基-4-羥基-3-庚酮、2, 6-二甲基庚烷、2, 5-二甲基庚烷、2, 6-二甲基-2-庚烯、 2, 6_二甲基_3_庚條、2, 5_二甲基_2_庚條、2、5_二甲基_3_庚條、3, 6_二甲基_3_庚條、 2, 6-二甲基-3-庚醇、2, 6-二甲基-4-庚醇、2, 5-二甲基-3-庚醇、2_，5-二甲基-4-庚醇、 2, 6-二甲基-3, 4-庚二醇、2, 6-二甲基-3, 4-庚二酮、2, 5-二甲基-3, 4-庚二醇、2, 5-二 甲基-3, 4-庚二酮、2, 6-二甲基-3-羥基-4-庚酮、2, 6-二甲基-4-羥基-3-庚酮、2, 5-二 甲基-3-羥基-4-庚酮、2,5-二甲基-4-羥基-3-庚酮、正辛烷、1-辛烯、2-辛烯、1-辛醇、 辛醛、辛酸酯、3-辛烯、4-辛烯、4-辛醇、4-辛酮、4,5-辛二醇、4,5-辛二酮、4-羥基-5-辛 酬、2_甲基辛燒、2_甲基_3_辛條、2_甲基_4_辛條、7_甲基_3_辛條、3_甲基_3_辛條、 3-甲基-4-辛烯、6-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛醇、7-甲基-4-辛醇、3-甲基-4-辛醇、 6-甲基-4-辛醇、2-甲基-4-辛酮、7-甲基-4-辛酮、3-甲基-4-辛酮、6-甲基-4-辛酮、 2-甲基-4, 5-辛二醇、2-甲基-4, 5-辛二酮、3-甲基-4, 5-辛二醇、3-甲基-4, 5-辛二酮、 2-甲基-4-羥基-5-辛酮、2-甲基-5-羥基-4-辛酮、3-甲基-4-羥基-5-辛酮、3-甲 基_5_輕基_4_辛酬、2, 7_二甲基辛燒、2, 7_二甲基_3_辛條、2, 7_二甲基_4_辛條、2, 7_二 甲基-4-辛醇、2, 7-二甲基-4-辛酮、2, 7-二甲基-4, 5-辛二醇、2, 7-二甲基-4, 5-辛二酮、 2, 7-二甲基-4-羥基-5-辛酮、2, 6-二甲基辛烷、2, 6-二甲基-3-辛烯、2, 6-二甲基-4-辛 烯、3, 7-二甲基-3-辛烯、2, 6-二甲基-4-辛醇、3, 7-二甲基-4-辛醇、2, 6-二甲基-4-辛 酮、3, 7-二甲基4-辛酮、2, 6-二甲基-4, 5-辛二醇、2, 6-二甲基-4, 5-辛二酮、2, 6-二甲 基-4-羥基-5-辛酮、2, 6-二甲基-5-2-羥基-4-辛酮、3, 6-二甲基辛烷、3, 6-二甲基-3-辛 烯、3, 6-二甲基-4-辛烯、3, 6-二甲基-4-辛醇、3, 6-二甲基-4-辛酮、3, 6-二甲基-4, 5-辛 二醇、3, 6-二甲基-4, 5-辛二酮、3, 6-二甲基-4-羥基-5-辛酮、正壬烷、1-壬烯、1-壬 醇、壬醛、壬酸酯、2-甲基壬烷、2-甲基-4-壬烯、2-甲基-5-壬烯、8-甲基-4-壬烯、2-甲 基-5-壬醇、8-甲基-4-壬醇、2-甲基-5-壬酮、8-甲基-4-壬酮、8-甲基-4, 5-壬二醇、 8-甲基-4, 5-壬二酮、8-甲基-4-羥基-5-壬酮、8-甲基-5-羥基-4-壬酮、2, 8-二甲基壬 燒、2, 8_二甲基_3_壬條、2, 8_二甲基_4_壬條、2, 8_二甲基_5_壬條、2, 8_二甲基_4_壬 醇、2, 8-二甲基-5-壬醇、2, 8-二甲基-4-壬酮、2, 8-二甲基-5-壬酮、2, 8-二甲基-4, 5-壬 二醇、2, 8-二甲基-4, 5-壬二酮、2, 8-二甲基-4-羥基-5-壬酮、2, 8-二甲基-5-羥基-4-壬 酬、2, 7_二甲基壬燒、3, 8二甲基_3_壬條、3, 8_二甲基_4_壬條、3, 8_二甲基_5_壬條、 3, 8-二甲基-4-壬醇、3, 8-二甲基-5-壬醇、3, 8二甲基-4-壬酮、3, 8-二甲基-5-壬酮、 3, 8-二甲基-4, 5-壬二醇、3, 8-二甲基-4, 5-壬二酮、3, 8-二甲基-4-羥基-5-壬酮、 3, 8-二甲基-5-羥基-4-壬酮、正癸烷、1-癸烯、1-癸醇、癸酸酯、2, 9-二甲基硅烷、2, 9-二 甲基-3-癸烯、2, 9-二甲基-4-癸烯、2, 9-二甲基-5-癸醇、2, 9-二甲基-5-癸酮、2, 9-二 甲基-5, 6-癸二醇、2, 9-二甲基-6-羥基-5-癸酮、2, 9-二甲基-5, 6-癸二酮、正十一烷、 1-十一碳烯、1-十一烷醇、十一烷醛、十一烷酸酯、正十二烷、1-十二碳烯、1-十二烷醇、 十二烷醛、十二烷酸酯、正十二烷、1-十二碳烯、1-十二烷醇、十二烷醛、十二烷酸酯、正 十三烷、1-十三碳烯、1-十三烷醇、十三烷醛、十三烷酸酯、正十四烷、1-十四碳烯、1-十四 烷醇、十四烷醛、十四烷酸酯、正十五烷、1-十五烯、1-十五烷醇、十五烷醛、十五烷酸酯、正 十六烷、1-十六碳烯、1-十六烷醇、十六烷醛、十六烷酸酯、正十七烷、1-十七碳烯、1-十七 烷醇、十七烷醛、十七烷酸酯、正十八烷、1-十八碳烯、1-十八烷醇、十八烷醛、十八烷酸酯、 正十九燒、1-十九碳稀、1-十九燒醇、十九燒醛、十九燒酸醋、二十燒、1-二十碳稀、1-二十 烷醇、二十烷醛、二十烷酸酯、3-羥基丙醛、1，3-丙二醇、4-羥基丁醛、1，4- 丁二醇、3-羥 基-2-丁酮、2-，3-丁二醇、1，5-戊二醇、高檸檬酸酯、高異檸檬酸酯、b-羥基己二酸酯、戊二 酸酯、戊二半醛（glutarsemialdehyde)、戊二醛、2-羥基-1-環戊酮、1，2-環戊烷、環戊酮、 環戊醇、（S)-2-乙酰乳酸酯、（R)-2, 3-二羥基-異戊酸酯、2-氧異戊酸酯、異丁酰-CoA、異 丁酸酯、異丁醛、5-氨基戊醛、1，10-二氨基癸烷、1，10-二氨基-5-癸烯、1，10二氨基-5-羥 基癸烷、1，10-二氨基-5-癸酮、1，10-二氨基-5, 6-癸二醇、1，10-二氨基-6-羥基-5-癸 酬、苯乙酸、1，4_苯基丁燒、1，4_二苯基-1-丁條、1，4_二苯基_2_ 丁條、1，4_二苯基_2_ 丁 醇、1，4-二苯基-2- 丁酮、1，4-二苯基-2, 3- 丁 二醇、1，4-二苯基-3-羥基-2- 丁酮、 1- (4-羥基苯基）-4-苯基丁烷、1- (4-羥基苯基）-4-苯基-1- 丁烯、1- (4-羥基苯基）-4-苯 基-2- 丁烯、1-(4-羥基苯基）-4-苯基-2- 丁醇、1-(4-羥基苯基）-4-苯基-2- 丁酮、 1-(4-羥基苯基）-4-苯基-2, 3-丁二醇、1-(4-羥基苯基）-4-苯基-3-羥基-2-丁酮、1-(吲 哚-3) -4-苯基丁烷、1-(吲哚-3) -4-苯基-1- 丁烯、1-(吲哚-3) -4-苯基-2- 丁烯、1-(吲 哚-3) -4-苯基-2- 丁醇、1-(吲哚-3) -4-苯基-2- 丁酮、1-(吲哚-3) -4-苯基-2, 3- 丁 二醇、1-(吲哚-3)-4-苯基-3-羥基-2- 丁酮、4-羥基苯基乙酰乙醛、1，4-二（4-羥基苯 基）丁燒、1，4_二（4_輕基苯基）_1_ 丁條、1，4_二（4_輕基苯基）_2_ 丁條、1、4_二（4_輕 基苯基）-2- 丁醇、1，4-二（4-羥基苯基）-2- 丁酮、1，4-二（4-羥基苯基）-2, 3- 丁二醇、 1，4-二（4-羥基苯基）-3-羥基-2-丁酮、1-(4-羥基苯基）-4-(吲哚-3) 丁烷、1-(4-羥 基苯基）-4-(吲哚-3)-1-1-丁烯、1-二（4-羥基苯基）-4-(吲哚-3)-2-丁烯、1-(4-羥 基苯基）-4-(吲哚-3) -2- 丁醇、1 - (4-羥基苯基）-4-(吲哚-3) -2- 丁酮、1 - (4-羥基苯 基）-4-(吲哚-3) -2, 3- 丁二醇、1- (4-羥基苯基-4-(吲哚-3) -3-羥基-2- 丁酮、吲哚-3-乙 醛、1，4-二（吲哚-3) 丁烷、1，4-二（吲哚-3)-1-丁烯、1，4-二（吲哚 3)-2 丁烯、1，4-二 (吲哚-3) -2- 丁醇、1，4-二（吲哚-3) -2- 丁酮、1，4-二（吲哚-3) -2, 3- 丁二醇、1，4-二 (吲哚-3) -3-羥基-2- 丁酮、琥珀酸半醛、己烷-1，8-二羧酸、3-己烯-1，8-二羧酸、3-羥 基-己烷-1，8-二羧酸、3-己酮-1，8-二羧酸、3, 4-己二醇-1，8-二羧酸、4-羥基-3-己 酮-1，8-二羧酸、巖藻多糖或它們的混合物。
[0066] 用于進行發酵步驟的適當微生物對于本領域技術人員是已知的，并包括選自 酵母（Saccharomyces)、克魯維酵母（Kluyveromyces)、假絲酵母（Candida)、畢赤酵 母（Pichia)、裂殖酵母（Schizosaccharomyces)、漢遜酵母（Hansenula)、克勒克酵母 (Kloeckera)、許旺酵母（Schwanniomyces)、耶氏酵母（Yarrowia)、曲霉（Aspergillus)、 木霉（Trichoderma)、腐質霉（Humicola)、枝頂抱（Acremonium)、鏡抱（Fusarium)和青霉 (Penicillium)菌屬的酵母和/或絲狀真菌（filamentaousfungus)。也可以使用細菌，包 括但不限于梭狀芽胞桿菌（Clostridia)、產酸克雷伯菌（Klebsiellaoxytoca)菌株和大 腸桿菌（E.coli)菌株。
[0067] 發酵步驟優選在最適合發酵微生物的溫度和pH進行，它們能夠由本領域技術人 員確定。發酵步驟通常進行可充分獲得所期望的有機分子的所需量和/或收率的時間。在 某些實施方式中，發酵步驟進行至少12小時、優選約12小時?約48小時的時間。
[0068] 在一個優選實施方式中，將發酵菌劑添加至水解產物，其中所述菌劑包含干面包 酵母、lg/L酵母提取物、0· 5g/L磷酸二銨、0· 025g/L硫酸鎂和I. 38g/L磷酸二氫鈉。在另一 個優選實施方式中，將發酵菌劑添加至水解產物，其中所述菌劑包含濃度為每升水解產物 Ig?4g的干酵母。發酵步驟的溫度可以為約20°C?約75°C，并且pH可以為約pH3. 0? 約pH9.0。溶解的氧含量取決于菌株和發酵的類型，可以為小于10%飽和。補充營養物可 以可選地添加，取決于具體微生物的菌株和營養需求，這對本領域技術人員而言應是顯而 易見的。
[0069] 發酵后，通過本領域技術人員已知的任何適當技術，可以分離和/或純化所關注 的至少一種產物或成分。產物或成分通常是選自由醇、醛、烷烴、烯烴、苯甲酸類化合物、羧 酸、酮、多元醇組成的組中的有機分子。發酵的結果可以是富含有機分子的水相和固相。可 以將該混合物通入蒸餾單元中，所述蒸餾單元可以工作在大氣壓或高于或低于大氣壓的任 何其他壓力和有利于將目標有機分子與該工藝液流中的其他成分分離的溫度，可以由本領 域技術人員確定。該蒸餾單元可以具有多個部件，包括醪塔（beercolumn)、精餾塔和汽提 塔，并可以以獲得足夠高純度的目標有機分子的方式設置。可選的是，可以存在干燥步驟， 其中可以使用分子篩來從工藝液流中除去水，以提供約97%?約99. 9%、更優選約99%? 約99. 9%的純度。如果目標有機分子由于任何原因而不可蒸餾，則可以采用蒸餾的替代方 法來純化目標有機分子。其實例為可以通過利用固相分離和隨后的油-水相分離。
[0070]在一個實施方式中，純化步驟可以包括通過濾布過濾發酵的材料。可以在約80°C蒸餾濾液，并將所收集的含有純化產物的餾分用于后續通過分子篩進行的干燥。
[0071]其中所關注的有機分子為乙醇，本發明的方法將優選產生純度為至少99%、優選 純度為99. 9%的乙醇。
[0072] 下游應用
[0073]由本發明的方法產生的有機分子可以用于任何適當的下游應用。在本發明的優選 實施方式中，該方法用于產生如乙醇等有機分子，其可用于生產塑料或生物塑料。本文中 所使用的術語"生物塑料"意指包含由生物類材料（包括但不限于源自植物生物質的醇、二 醇、烷烴、烯烴、羧酸）得到的聚合物的任何塑料。生物塑料越來越受關注，因為它們代表著 由如石油等不可再生天然資源得到的塑料的重要替代物。
[0074]聚合物或生物塑料可以由包含使用任何本領域技術人員已知的適當技術通過本 發明的方法產生的至少一種有機分子的有機前體制造。在一個實施方式中，所生產的塑料 為聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET)，并且所述PET通過包括以下步驟的方法生產：
[0075] (a)取用通過本發明的方法產生的乙醇；
[0076] (b)與氧源在催化劑上反應以產生乙烯；
[0077] (C)與催化劑液流源反應以產生乙二醇；和
[0078] (d)與對苯二甲酸一起加熱以產生聚對苯二甲酸乙二醇酯。
[0079]利用本發明的方法由煙草生物質生產的生物塑料可用于制造一系列不同產品。在 本發明的優選實施方式中，所生產的生物塑料用于制造含有煙堿的產品或煙堿替代產品。 含有煙堿的產品包括煙堿吸入器，如描述于W02011/095781中的仿真吸煙裝置。
[0080]如上所述，隨著吸煙的減少，對于如煙堿藥筒、煙堿吸入器和仿真吸煙裝置等煙堿 替代產品的需求趨勢增長。但是，這些產品中許多需要大量塑料包裝和/或在其設計中包 括大量塑料。本發明的方法可使含有塑料的煙堿替代療法和裝置所需的煙堿和塑料的有機 前體均至少部分地由同一煙草生物質原料得到。
[0081]鑒于以上內容，本文提供一種煙堿替代產品，所述產品包含煙堿和至少部分地由 一種或多種有機前體合成的塑料，其中煙堿和至少有一種有機前體均由同一煙草生物質原 料得到。
[0082]由本要求保護的方法可以獲得顯著的經濟和環境效益。通過從煙草植株中得到有 用產物以及煙堿，本發明將減少用于吸煙制品的煙草種植的耕地損失。由于煙草植株、特別 是葉子的高價值，當結合至吸煙制品中時，從同一生物質原料中提取煙堿和得到用于生產 如塑料等生物類塑料產品的有機前體的方法在過去不被認為是經濟上可行的。然而，長期 來看，如煙堿替代療法等革新將潛在地降低煙草植株絕對意義上的和相對于純煙堿價值的 市場價值。利用整個煙草植株提取成分、特別是如煙堿等水溶性成分和產生如醇等有機分 子的本方法因此具有重大商業價值。
[0083]現在通過參照以下非限制性實施例來使本發明得到進一步了解。
[0084] 實施例
[0085] 實施例1利用煙草生物質提取煙堿和產生乙醇的方案
[0086] L 1材料
[0087] ?堿：0.5M氫氧化鈉（Sigma)。
[0088]?生物質：普通煙草（Nicotianatabacum)，其煙草生物質被限定為至少含有以下 成分的植物材料：25%纖維素、25%半纖維素、15%木質素和0. 1%?5%煙堿干物質。
[0089] ·0· IM硫酸（Sigma)
[0090] ?檸檬酸緩沖液（Sigma)
[0091] ?石賭（Sigma)
[0092] ?面包酵母（Scerevisiae)
[0093] ?菌劑培養基（IOx)
[0094]〇 6. 7g/L酵母氮源（YeastNitrogenBase) (Difco)
[0095] 〇 5g/L右旋糖（Difco)
[0096] ?酶：纖維素酶、CellicCtec2 和Htec2 (Novozyme)
[0097] ?培養基補充物，計算為使得最終發酵肉湯具有以下濃度。
[0098] 〇lg/L酵母提取物（Difco)
[0099]〇0· 5g/L磷酸二按（Sigma)。
[0100]〇0· 025g/L硫酸鎂（Sigma)。
[0101] 〇I. 38g/L磷酸二氫鈉（Sigma)。
[0102] ?濾布 / 紗布（Fisher)
[0103] ?熱電偶（ColeParmer)
[0104] ?水浴 + 加熱板（ColeParmer)
[0105] ·Ix壓力容器（MerrowScientific)
[0106] ·Ix發酵罐（ColeParmer)
[0107] ?通用實驗室設備：燒杯、吸管、攪拌器、pH計、天平
[0108] ?在無菌罩中的無菌天平
[0109] ?溶解氧探頭（MettlerToledo)
[0110] ?鎮流和真空蒸餾設備（Sigma)
[0111] ?個人防護裝備。
[0112] 1. 2牛物質收集
[0113] 由去頂成熟煙草植株獲得用于加工的煙草生物質。將該生物質用水徹底洗滌，以 除去殘留的泥土和種植過程中使用的水溶性非系統性試劑。
[0114] L3預處理
[0115] 在預處理之前，將該煙草生物質切成〈10mm的片，以便更好地接觸試劑和提取煙 堿。將稱重、切碎的生物質預加載至壓力容器中。向該壓力容器添加氫氧化鈉溶液（0.5M)， 以獲得12重量％固體含量的最終稀釋。在攪動該混合物的同時，將該壓力容器加熱至 120°C的運行溫度，并保持在此溫度10分鐘。將該反應器的溫度冷卻至50°C，以便于對該預 處理材料的安全處置。
[0116] L4煙堿分離
[0117] 通過數層濾布過濾該預處理材料，以分離固體。將濾液收集在容器中。將固體殘 渣用少量水洗滌三次，以將盡可能多的煙堿提取至該容器中。向濾液中添加石蠟并充分混 合。以3000g離心該混合物5分鐘，以分離兩相。收集疏水相（石蠟相）。
[0118] 將0.IM硫酸溶液添加至石蠟相中并充分混合。以3000g離心該混合物5分鐘，以 分離兩相。收集酸相并用〇.IM氫氧化鈉溶液中和。將該溶液在125°C、IOlkPa蒸餾以除去 水。然后將該溶液在125°C、1.6kPa真空蒸餾，并從冷凝器中收集純化的煙堿。產物的純度 可以通過HPLC確定。
[0119] 1. 5酶處理和發酵
[0120] 將來自濾液的固體材料在121 °C蒸壓15分鐘。在無菌罩中，對經蒸壓的固體材料 稱重，并將其無菌地轉移至發酵反應器中。向發酵反應器添加50°C水，以獲得10重量％固 體含量的最終稀釋。將溫度保持在50°C，同時用0.IM硫酸將該混合物調整至pH5。添加 50°C并且pH5的檸檬酸緩沖液，使其達到0.IM的最終濃度。將水解酶以I:lOw/w酶：固 體的比例添加。使反應進行24小時，同時在該反應的持續時間內進行攪拌。24小時后，將 反應器冷卻至30°C，并保持該溫度以發酵。
[0121] 發酵菌劑通過將干酵母重新懸浮在菌劑培養基中并使其在30°C生長4小時?12 小時而制備。然后將反應器接種相當于1?4g干酵母/L發酵肉湯的酵母菌劑。向該發酵 肉湯添加培養基補充物。發酵進行12小時?48小時，同時進行攪拌以實現適當的混合。監 測整個發酵過程中的pH，其應在pH4?5. 5范圍內。發酵過程中，檢查溶解氧，并且必要時 噴射空氣以保持缺氧條件（〈10%飽和溶解氧-飽和點為〇.2mM)。
[0122] L6乙醇純化
[0123] 使發酵肉湯通過濾布以除去所有固體。將濾液在101kPa、80°C蒸餾，并再循環直至 實現95%的純度。通過沸石、分子篩蒸餾，以除去主要餾分中存在的殘留水分，從而提供純 度為99. 9%的乙醇。
[0124] 乙醇的純度可以通過氣相色譜法確定。
[0125] 使99.9%純的乙醇與90%的氧于220°0?280°0在銀催化劑上反應，并隨后使其 與過量蒸汽一起通過氧化鋁催化劑，以產生乙二醇。然后可以將該乙二醇與對苯二甲酸在 加熱容器中混合，并加熱至270°C，以產生聚對苯二甲酸乙二醇酯。
[0126] 本發明在范圍上不應被本文所述的【具體實施方式】限制。實際上，由以上描述和附 圖，本文中所述以外的本發明的各種修改對于本領域技術人員將顯而易見。所述修改應落 在所附權利要求的范圍內。此外，本文所述的本發明的所有方面和實施方式被認為是廣泛 適用的，并在適當時可與任何和所有其他相一致的實施方式（包括取自本發明其他方面的 那些實施方式）結合（包括分開地結合）。
[0127] 本文引用了各種出版物，通過援引將其公開內容以整體并入本文中。
【權利要求】
1. 一種由煙草生物質原料得到兩種以上成分或產物的方法，其中，至少一種成分或產 物從液相中提取，并且至少一種成分或產物由固相產生，其中，所述方法包括以下步驟： (a) 使用堿水溶液處理所述生物質原料，以產生液相和含有不溶的煙草纖維素材料的 固相； (b) 將所述液相與所述固相分離； (c) 通過液_液或固相提取從所述液相中提取至少一種成分或產物； (d) 將所述固相與一種或多種能夠水解所述纖維素材料的酶接觸，以產生可發酵糖； 和 (e) 使所述可發酵糖發酵，以由所述固相產生至少一種成分或產物。
2. 如權利要求1所述的方法，其中，從所述液相中提取的所述成分或產物是水溶性的。
3. 如權利要求2所述的方法，其中，水溶性成分或產物選自由以下物質組成的組：生物 堿、檸檬酸、果膠、類胡蘿卜素、果膠酶、部分1蛋白、部分2蛋白和酚類化合物。
4. 如權利要求1?3中任一項所述的方法，其中，水溶性成分或產物為煙堿。
5. 如權利要求1?4中任一項所述的方法，其中，由所述固相產生的所述成分或產物為 選自由以下物質組成的組中的有機分子：醇、醛、烷烴、烯烴、苯甲酸類化合物、羧酸、酮、多 元醇。
6. 如權利要求5所述的方法，其中，所述有機分子為醇。
7. 如權利要求6所述的方法，其中，所述有機分子為乙醇。
8. 如權利要求1?7中任一項所述的方法，其中，在步驟（a)之前，處理所述生物質以 回收油溶性成分或產物。
9. 如權利要求8所述的方法，其中，所述油溶性成分或產物選自由以下物質組成的組： 茄尼醇和聚戊烯醇。
10. 如權利要求1?9中任一項所述的方法，其中，所述煙草生物質原料包含來自煙草 屬物種的植株或其部分。
11. 如權利要求1?10中任一項所述的方法，其中，所述煙草生物質原料包含至少0. 1 重量％煙堿。
12. 如權利要求11所述的方法，其中，所述煙草生物質原料還包含至少25重量％纖維 素。
13. 如權利要求12所述的方法，其中，所述煙草生物質原料還包含至少15重量％半纖 維素和至少10重量％木質素。
14. 如權利要求1?13中任一項所述的方法，其中，所述堿水溶液具有約0. 1M?約 1. 0M的濃度。
15. 如權利要求1?14中任一項所述的方法，其中，在步驟（a)中，所述生物質-堿水 溶液在約l〇〇°C?約200°C的溫度進行處理。
16. 如權利要求15所述的方法，其中，所述溶液在約120°C的溫度進行處理。
17. 如權利要求1?16中任一項所述的方法，其中，在步驟（a)中，處理進行約2分鐘? 約120分鐘的時間。
18. 如權利要求17所述的方法，其中，處理進行約10分鐘。
19. 如權利要求1?18中任一項所述的方法，其中，所述堿水溶液添加至所述生物質中 以實現約5重量％?約25重量％固體含量的最終稀釋。
20. 如權利要求1?19中任一項所述的方法，其中，所述堿水溶液為氫氧化鈉溶液。
21. 如權利要求1?20中任一項所述的方法，其中，在步驟（b)中，通過過濾被處理的 煙草生物質原料將所述液相與所述固相分離。
22. 如權利要求1?21中任一項所述的方法，其中，在步驟（c)中提取的至少一種成分 或產物為煙堿，并且在步驟（e)中產生的至少一種成分或產物為乙醇。
23. 如權利要求22所述的方法，其中，提取的煙堿具有至少95%的純度，并且產生的乙 醇具有至少99 %的純度。
24. -種聚對苯二甲酸乙二醇酯的生產方法，其中，所述方法包括以下步驟： (a) 取用通過權利要求1?23中任一項所述的方法產生的乙醇； (b) 與氧源在催化劑上反應以產生乙烯； (c) 與催化劑液流源反應以產生乙二醇；和 (d) 與對苯二甲酸一起加熱以產生聚對苯二甲酸乙二醇酯。
25. -種聚合物，所述聚合物至少部分地由一種或多種有機前體合成，所述有機前體包 含通過權利要求1?23中任一項所述的方法產生的至少一種有機分子。
26. -種塑料，所述塑料由權利要求25所述的聚合物合成。
27. -種煙堿替代產品，所述產品包含權利要求26的塑料。
28. -種煙堿替代產品，所述產品包含煙堿和塑料，所述塑料至少部分地由一種或多種 有機前體合成，其中所述煙堿和至少一種有機前體均由同一煙草生物質原料得到。
【文檔編號】C12P19/14GK104428421SQ201380036859
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年7月12日 優先權日:2012年7月13日
【發明者】亞歷克斯·赫恩, R·古普塔, S·B·洛, H·K·陳 申請人:親切消費者有限公司