一種指導硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種指導硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法，包括超純水，X溶液，10×PCR緩沖液，PCR引物，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶和陽性對照品，特點是PCR引物包括2個與硝酸甘油用藥及健康飲酒相關基因上的2個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其基因序列如SEQ?ID?NO.1～NO.8所示；其使用方法包括采集樣本并提取核酸的步驟；以提取的核酸為模板進行PCR反應的步驟；最后毛細電泳分離樣品的步驟，優點是特異性強、準確性高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果。
【專利說明】一種指導硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種多重基因檢測試劑盒及其檢測方法，尤其是涉及一種指導硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]硝酸甘油為硝基血管擴張藥，是防治冠心病心絞痛的特效常用藥品之一。硝酸甘油及其它含硝基藥物(如硝普鈉)在體內都可產生活性NO自由基，從而激活平滑肌和其他組織的鳥苷酸環化酶，增加cGMP的合成。cGMP激活cGMP依賴的蛋白激酶，改變平滑肌中不同蛋白的磷酸化，使肌球蛋白(myosin)輕鏈去磷酸化。已知肌球蛋白輕鏈的磷酸化與維持平滑肌的收縮狀態有關，實驗證據表明硝基血管擴張劑的藥理和生化作用與血壓內皮衍生舒張因子(EDRF)(已證明為NO或含NO的物質)相同。研究發現ALDH2基因與硝酸甘油轉化為NO密切相關。但如果病人ALDH2基因中發生Glu504Lys突變，就會影響ALDH2的酯酶活性，使硝酸甘油在體內的生物轉化過程受阻，從而不能有效代謝硝酸甘油，導致一氧化氮減少甚至無法產生一氧化氮，藥物也就難以有效發揮作用，長時間不能解除的心絞痛可能發展為急性心肌梗塞，引起生命危險。大約三分之一的東亞人具有ALDH2基因Glu504Lys突變，對ALDH2基因多態性的診斷能夠科學地指導心絞痛患者選擇藥物。
[0003]同時，ALDH2也是酒精代謝途徑中關鍵酶基因之一。酒精進入體內后，首先經乙醇脫氫酶IB (ADHlB)催化，代謝為乙醛。乙醛會進一步在乙醛脫氫酶2 (ALDH2)的作用下轉化為乙酸，乙酸最終代謝生成C02和水，排出體外。乙醛不穩定且容易產生自由基。乙醛蓄積將會造成許多組織和器官如肝、腎、心、腦嚴重傷害并可能致癌，如肝癌、胃癌等。世界衛生組織癌癥研究機構在2009年把酒精代謝物乙醛歸為一級致癌原(與黃曲霉素同級)。ALDH2基因發生Glu504Lys突變后，編碼得到的是沒有活性的蛋白，乙醛轉化為乙酸受阻，會造成乙醛堆積。ADHlB基因發生·Arg48His突變后，乙醇轉化成乙醛的速度是野生型的40到100倍，會導致乙醛迅速產生。對ALDH2和ADHlB基因多態性的診斷能夠科學地指導人們健康飲酒。
[0004]現有的用于單核苷酸多態性(SNP)檢測方法主要為基因芯片、熒光定量PCR及Sanger測序法。
[0005](I) qPCR檢測方法:采用熒光淬滅及雙末端標記技術，針對SNP位點變異設計特異性的探針。其優點是靈敏度高、準確性強。其缺點是(I)通量低:不適宜多SNP位點的檢測；難以設置內控基因。(2)成本較高:探針標記成本高；若需獲得所有相關SNP信息，需進行多個檢測試驗，疊加成本更加昂貴。
[0006](2)基因芯片法:基因芯片是通過微加工技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。DNA芯片:由于高通量等優點在SNP檢測中得到大量應用，依靠野生型與突變型基因雜交動力學的差異對突變位點進行檢測。其優點是:(1)高通量并行檢測；(2)操作簡便快速:整個檢測只需4-8小時基本可以出結果。缺點:1)不同SNP位點之間的雜交動力學差異不同，在進行多位點同時檢測時條件難以控制；2)技術成本昂貴、復雜:每個樣品需要一個芯片，成本大于YlOOO/樣品，不利于大規模推廣；探針的合成與固定比較復雜，特別是制作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟；3)重復性差，準確性低，易出現假陽性假陰性結果；4)靈敏度較低:芯片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴增，由于引物較多，容易自身產生二聚體，發夾結構，或由于Tm值不同，而導致擴增目的片段效率不同，進而影響檢測的靈敏度；5)由于芯片的種類較多，難以制定一個統一的質量控制標準。
[0007](3)Sanger (雙脫氧鏈終止法)測序法:Sanger法是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。其優點是SNP分析金標準，能發現已知SNP，也能發現未知SNP。缺點是每個樣本的每個位點均需要經PCR擴增，跑膠，然后切膠純化，再測序。步驟多而分散，成本較高，工作量大，周期長，多個SNP位點檢測累計價格相對昂貴。
[0008]多重SNP位點檢測方法基于多重PCR和毛細管電泳(CE)分離技術。采用多重PCR方法，在同一個反應管中同時加入≥1對特異性基因擴增引物及反應內參引物，根據基因擴增片段的大小用毛細管電泳分離分析多個SNP位點及基因型，能快速有效地檢測多個SNP位點，克服了傳統方法存在的缺陷，具有以下優勢:
[0009]1、高通量:本系統實現單個反應檢測30-40個位點。
[0010]2、準確性強:采用CE對PCR產物進行分離，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性；
[0011]3、敏感性高，結果重復性好:本系統克服了傳統PCR擴增方法的不均等擴增造成的偏差，提高了對一套目的基因進行定性的速度和敏感性，采用激光誘導熒光-PMT，具有超高靈敏度；
[0012]4、方法簡便，使用經濟:本發明提供從試劑、多重PCR引物設計、結果分析等全套實驗方案；每個樣品的檢測成本少于Y50,利于大規模推廣；
[0013]5、靈活性強:可隨時根據需求調整檢測的靶基因。
[0014]6、易于實現自動化。
[0015]目前，國內外還沒有關于基于多重PCR和CE分離的多重SNP檢測指導噻嗪類利尿藥用藥的試劑盒及其使用方法的相關報道。
【發明內容】
[0016]本發明所要解決的技術問題是提供一種特異性強、準確度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果的基于多重SNP檢測系統的指導硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物。
[0017]本發明所要解決的技術問題還在于提供包含上述引物組合物的試劑盒及其使用方法。
[0018]本發明解決上述技術問題所采用的技術手段是:一種指導硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物，包括以下2個與硝酸甘油用藥及健康飲酒相關基因上的2個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其核酸序列如下表1所示:
[0019]表1
【權利要求】
1.一種指導硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物，其特征在于，包括以下2個與硝酸甘油用藥及健康飲酒相關基因上的2個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其核酸序列如下:
2.一種指導硝酸甘油用藥及健康飲酒的多重基因檢測試劑盒，其特征在于，包括如權利要求I所述的引物組合物、PCR反應液和陽性對照品；所述PCR反應液包括以下組分:超純水，X溶液，10XPCR緩沖液，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶。
3.根據權利要求2所述的一種指導硝酸甘油用藥及健康飲酒的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATAJn SEQ ID N0.9所示；反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA,如SEQ ID N0.10所示；所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標記。
4.根據權利要求3所述的一種指導硝酸甘油用藥及健康飲酒的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的陽性對照品為上述2個與硝酸甘油用藥及健康飲酒相關基因上的2個SNP位點上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。
5.上述一種指導硝酸甘油用藥及健康飲酒的多重基因檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)采集樣本并提取核酸 采集患者口腔拭子或血液樣品的分離培養物，從分離培養物中提取核酸； (2)以提取的核酸為模板進行PCR反應 取DNA樣品2 μ L，10 X PCR緩沖液2 μ L，25mM的氯化鎂3.4 μ L，PCR弓丨物溶液2 μ L，DNA聚合酶0.6 μ L，X溶液2 μ L，超純水10 μ L混勻后加入到96孔樣品板上進行PCR反應，反應條件:95°C 2分鐘；94aC 30秒鐘，55°C 30秒鐘，70°C I分鐘，循環35次；70°C I分鐘；4°C直至收取PCR產物；其中所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATAJn SEQ ID N0.9所示；反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，如SEQ ID N0.10所示；所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標記；PCR引物溶液中各PCR引物濃度均為200nM，所述的PCR引物包括以下2個與硝酸甘油用藥及健康飲酒相關基因上的2個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，基因序列如序列表中SEQ ID N0.1~N0.8所示； (3)毛細電泳分離樣品取PCR產物0.1-1 μ L，上樣緩沖液38.75 μ L, DNA Marker0.5 μ L，礦物油一滴混合均勻后加入到96孔分離液板上進行毛細電泳分離樣品，將遺傳分析儀軟件獲得的圖譜與標準圖譜對比，獲得指 導硝酸甘油用藥及健康飲酒相關基因的SNP位點的等位基因型。
【文檔編號】C12Q1/68GK103849681SQ201410014274
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年1月13日 優先權日:2014年1月13日
【發明者】吳勇, 曾縣平, 南麗 申請人:寧波海爾施基因科技有限公司