一種霍亂弧菌分析分型試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種霍亂弧菌分子分型試劑盒，用熒光標記復合引物分別擴增霍亂弧菌6個VNTR基因座。本發明將6個基因座分為3組，共涉及4中熒光標記；經毛細管電泳檢測之后，與等位基因分型標準物比對，可快速準確的得出霍亂弧菌的分型。
【專利說明】一種霍亂弧菌分析分型試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種霍亂弧菌分子分型檢測試劑盒，具體是涉及一種同時分析6個霍亂弧菌VNTR基因座的熒光標記復合擴增系統及等位基因分型標準物，該系統可以應用于霍亂弧菌的溯源。
【背景技術】
[0002]細菌性疾病一直危害著人類健康和畜牧業的健康發展，隨著生活水平的提高、人口流動的日漸頻繁，食源性細菌引起的食品安全問題已成為全球共同面對的社會公共衛生問題。而人口的增長、科技飛速發展、介入性醫療器械的普及等因素使得院內感染發生率持高不下，成為目前臨床最為棘手的難題。
[0003]細菌的鑒定、分型技術能夠根據細菌的生化特征或基因組成，分析不同來源菌株間的關系。它在了解細菌在人群中的傳播動力學、查找食物中毒的感染源，以及判定院內感染的暴發、尋找感染源和識別一些特殊的致病菌等方面有著重要的作用，所以成為流行病學調查的有力工具。
[0004]霍亂弧菌(V.cholera)是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高。屬于國際檢疫傳染病。霍亂弧菌分型檢測的技術有很多，目前使用最多的檢測技術是脈沖場凝膠電泳檢測(pulsed field gel electrophoresis, PFGE),這種檢測方法對操作人員要求極高，操作繁瑣，做不到自動化、高通量檢測，所以推廣不易，只有省級疾病預防控制中心區域中心實驗室的具分型監測能力。Heidelberg JF等在2000年，以菌株N16961為模板，完成了霍亂弧菌全序列的測定，基因組序列Vibrio cholerae Olbiovar El Tor str.N16961RefSeq Genome (Heidelberg JF，et al.DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae.Nature2000Aug3)，。
[0005]Jaran S.01 sen 等(01 sen et al.Journal of MicrobiologicalMethods78 (2009) 271 - 285)用兩個復合擴增體系擴增6個霍亂弧菌VNTR基因座，通過ABI310自動測序儀，對擴增結果進行檢測。數據分析結果表明，6個VNTR基因座分型結果與PFGE分型結果類似，具很好的分型能力，并且操作更簡便、快捷。多個VNTR復合擴增檢測英文縮寫為 MLVA (multiple locus VNTR analysis, MLVA)。
[0006]Yael Danin-Poleg 等(Yael Danin-Poleg et al.Vibrio cholerae StrainTyping and PhylogenyStudy Based on Simple Sequence Repeats Journal of ClinicalMicrobiology, Mar.2007, p.736 - 746)對霍亂弧菌基因組的VNTR基因座進行了分析，其中9個VNTR基因座具多態性。
[0007]表1Yael Danin-Poleg等統計的霍亂弧菌VNTR基因座及多態性
[0008]
【權利要求】
1.一種霍亂弧菌分析分型試劑盒，其特征在于，包括有擴增如下霍亂弧菌的VNTR基因座所設計的引物:VC1650、VC0437、VC0147、VCA0171、VCA0283 和 VC1457。
2.根據權利要求1所述的霍亂弧菌分析分型試劑盒，其特征在于:各個基因座對應的引物是進行分組標記，第I組，VC1650、VC0437 ;第2組，VC0147、VCA0171 ;第3組，VCA0283、VC1457。
3.根據權利要求2所述的霍亂弧菌分析分型試劑盒，其特征在于:各組分別使用FAM、HEX、TAMRA中的一種進行標記，且各個組之間的標記色不同。
4.根據權利要求1所述的霍亂弧菌分析分型試劑盒，其特征在于，各個基因座對應的引物是:VC1650, SEQ ID N0.1 ~2 ；VC0437, SEQ ID N0.3 ~4 ;VCO147，SEQ ID N0.5 ~6 ;VCA0171, SEQ ID N0.7 ~8 ；VCA0283, SEQ ID N0.9 ~10 ；VC1457, SEQ ID N0.11 ~12。
5.根據權利要求4所述的霍亂弧菌分析分型試劑盒，其特征在于，各個基因座對應的引物在最終的擴增體系中的濃度是:SEQ ID N0.1~2，0.10yM;SEQ ID N0.3~4，0.15μΜ ；SEQ ID N0.5 ~6，0.12 μ M ;SEQ ID N0.7 ~8，0.21 μ M ;SEQ ID N0.11 ~12，0.15 μ Μ。
6.根據權利要求1所述的霍亂弧菌分析分型試劑盒，其特征在于:還包括有等位基因分型標準物。
7.根據權利要求1所述的霍亂弧菌分析分型試劑盒，其特征在于:還包括有反應混合物10.0 μ L、熱啟動Taq酶0.5 μ L、SdH2O補足至25.0 μ L ;所述的反應混合物中包括有:MgCl2 7.5mM, Tris-HCl buffer 125mM, KCl 125mM, dNTPs 7.5mM, BSA 2mg/ml。
【文檔編號】C12R1/63GK103757110SQ201410014783
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月13日 優先權日:2014年1月13日
【發明者】葛斌文, 羅蕓, 盧青, 金大智, 張政, 周麗萍, 葛海鵬, 郭育林 申請人:無錫中德美聯生物技術有限公司, 浙江省疾病預防控制中心