紅錐ssr4標記、引物對及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種紅錐SSR4標記、引物對及其制備方法和應用，發明人利用特定引物對HZ4對紅錐總DNA進行PCR擴增，得到簡單重復序列SSR4標記。該法簡單易行、操作簡便，得到的簡單重復序列在兩個紅錐天然群體的居群內和居群間檢測表明具有較高的多態性。紅錐SSR4標記是共顯性標記，較之其它分子標記，SSR標記重復性好、可靠性高，可應用于紅錐的遺傳多樣性評價、紅錐遺傳圖譜構建、紅錐種群遺傳變異空間分布格局和紅錐起源進化的研究，以及目標基因的標定，還可應用于紅錐的分子標記輔助育種和QTL研究。
【專利說明】紅錐SSR4標記、引物對及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物科學中的分子標記【技術領域】，尤其涉及一種紅錐SSR4標記、引物對及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]紅維(Castanopsishystrix)為殼斗科(Fagaceae)栲屬(Castanopsis)常綠喬木，是華南地區重要的鄉土闊葉、優質珍貴用材樹種。它生長快、適應廣、效益高，可用做建筑、造船、高檔家具等；萌芽力強，枝葉濃密，較耐蔭蔽，混生性能好，可純林種植，亦可混交造林，是針葉樹種混交造林的最理想的伴生樹種之一；紅錐對生境適應能力強，在群落中位于喬木層，為優勢種，對于維持群落穩定具有重要作用，特別適宜人工營造用材林和水源涵養林。由于紅錐木材非常珍貴，近些年遭到了大量采伐，其天然林遭受了嚴重破壞。
[0003]SSR標記(Simple sequence repeat),也叫微衛星序列重復,是由一類由幾個核苷酸為重復單位組成的長達幾十乃至數百個核苷酸的重復序列，長度較短，廣泛分布在染色體上。由于重復單位的次數的不同或重復程度的不完全相同，造成了 SSR長度的高度變異性，由此產生SSR標記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以用微衛星區域特定順序設計成對引物，通過PCR技術，經聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位點在不同個體間的多態性。SSR標記具有以下優點:(I)標記數量豐富，具有較多的等位變異，廣泛分布于各條染色體上；(2)是共顯性標記，呈孟德爾遺傳；(3)技術重復性好，易 于操作，結果可靠。
[0004]盡管國內外的學者已經使用ISSR、RAPD等多種標記研究了紅錐群體的遺傳多樣性，紅錐群體的遺傳結構和不同種源紅錐間的遺傳關系和距離，但是ISSR和RAro兩種標記均為顯性標記，穩定性差，且不能直接應用于分子標記輔助育種和QTL定位。因此，研究紅錐SSR標記、開發紅錐的SSR引物很有必要。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種紅錐SSR4標記、引物對及其制備方法和應用。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:紅錐SSR標記，具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列，微衛星標記編號為SSR4。
[0007]擴增上述紅錐SSR標記的引物對HZ4，包括具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的喊基序列。
[0008]上述紅錐SSR標記的制備方法，利用特定引物對HZ4對紅錐總DNA進行PCR擴增，得到簡單重復序列；引物對HZ4包括具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的堿基序列。
[0009]上述紅錐SSR標記的制備方法，包括以下步驟:
[0010]<1>紅錐總DNA提取與酶切
[0011]選取紅錐幼嫩的葉片，用CTAB法提取核基因組；用EcoRV在37°C下酶切3h，65°C下20min滅活內切酶；反應體系20 μ L，包括2.0 μ L的lOXBuffer，1.0 μ L的EcoRV內切酶,2 μ L的DNA，15.0 μ L的滅菌雙蒸水；
[0012]〈2>接頭的連接
[0013]將步驟〈DEcoRV酶切的紅錐基因組DNA連接上下接頭；60 μ L連接體系中含有酶切的紅錐基因組DNA9yL，上下接頭各IOOpmol ;連接反應在I倍T4連接酶緩沖條件下進行，于16°C連接過夜；連接后的混合物在65°C反應20min，滅活連接酶；
[0014]〈3>連接產物的擴增
[0015]過夜步驟〈2>連接后的混合物以AP2和復合SSR引物為上下引物對連接后的混合物進行PCR擴增；1.5%的瓊脂膠電泳，切膠回收500-1000bp的片段，試劑盒純化；
[0016]<4>克隆并篩選富集的微衛星DNA片段
[0017]將步驟<3>PCR產物連接到載體pMD18-T Vectors上，然后轉化到感受態細胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培養基上，37°C培養過夜；用M13引物進行PCR擴增檢測，選取400-1000bp左右的片段；
[0018]〈5>測序、引物設計與擴增分析
[0019]將步驟<4>PCR產物送測序；利用Primer5.0軟件對測序結果進行SSR引物設計并送合成，得引物對HZ4 ;利用引物對HZ4在紅錐基因組中擴增出片段SSR4標記。
[0020]步驟〈2>中上下接頭分別具有序列表SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5的堿基序列；步驟〈3>中AP2和復合SSR引物分別具有序列表SEQ.1D.N0.6和SEQ.1D.N0.7的堿基序列；步驟<4>中M13引物對具有序列·表SEQ.1D.N0.8和SEQ.1D.N0.9的堿基序列；步驟<5>中引物對HZ4分別具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的堿基序列。
[0021]上述紅錐SSR標記的制備方法，步驟〈5>中擴增按以下操作進行:
[0022]擴增體系:反應體系1(^1^，包括30-50叩的模板0嫩，0.25個單位的0嫩聚合酶(TaKaRa)，1.Ομ L 的 lOXBuffer，2.5mM MgCl2I μ I, 2.5mM dNTPsl μ I, 0.1 μ I bovineserum albumin (BSA)；
[0023]擴增程序:95°C預變性 5min;95°C變性 30s，52°C 復性 45s，72°C 延伸 lmin30s，30個循環；最后72°C延伸IOmin。
[0024]上述紅錐SSR4標記在紅錐的分子標記輔助育種方面的應用。
[0025]上述紅錐SSR4標記在紅錐的QTL (數量性狀基因座)研究方面的應用。
[0026]經過對紅錐的深入研究，發明人利用特定引物對HZ4對紅錐總DNA進行PCR擴增，得到簡單重復序列SSR4標記。具體制備方法包括以下步驟:〈1>紅錐總DNA提取與酶切；<2>接頭的連接；〈3>連接產物的擴增；〈4>克隆并篩選富集的微衛星DNA片段；〈5>測序、引物設計與擴增分析。該法簡單易行、操作簡便，得到的簡單重復序列在兩個紅錐天然群體的居群內和居群間檢測表明具有較高的多態性。紅錐SSR4標記是共顯性標記，較之其它分子標記，SSR標記重復性好、可靠性高，可應用于紅錐的遺傳多樣性評價、紅錐遺傳圖譜構建、紅錐種群遺傳變異空間分布格局和紅錐起源進化的研究，以及目標基因的標定，還可應用于紅錐的分子標記輔助育種和QTL研究。
【具體實施方式】
[0027]實施例[0028]<1>紅錐總DNA提取與酶切
[0029]選取紅錐幼嫩的葉片，用CTAB法提取核基因組；用EcoRV在37°C下酶切3h，65°C下20min滅活內切酶；反應體系20yL，包括2.0yL的lOXBuffer，1.0 μ L的EcoRV內切酶,2 μ L的DNA，15.0 μ L的滅菌雙蒸水；
[0030]〈2>接頭的連接
[0031 ] 將步驟〈DEcoRV酶切的紅錐基因組DNA連接上下接頭(上接頭序列GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT,序列表 SEQ.1D.N0.4 ;下接頭序列ACCAGCCC-NH2，序列表SEQ.1D.N0.5);60μ L連接體系中含有酶切的紅錐基因組DNA9u L，上下接頭各IOOpmol ;連接反應在I倍T4連接酶緩沖條件下進行，于16°C連接過夜；連接后的混合物在65°C反應20min，滅活連接酶；
[0032]〈3>連接產物的擴增
[0033]過夜步驟〈2>連接后的混合物以AP2 (序列表SEQ.1D.N0.6)和復合SSR引物(序列表SEQ.1D.N0.7)為上下引物對連接后的混合物進行PCR擴增；1.5%的瓊脂膠電泳，切膠回收500-1000bp的片段，試劑盒純化； [0034]<4>克隆并篩選富集的微衛星DNA片段
[0035]將步驟<3>PCR產物連接到載體pMD18-T Vectors (Takara)上，然后轉化到感受態細胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培養基上，37°C培養過夜；用M13引物對(M13F和M13R，序列表SEQ.1D.N0.8和SEQ.1D.N0.9)進行PCR擴增檢測，選取400_1000bp左右的片段；
[0036]〈5>測序、引物設計與擴增分析
[0037]將步驟<4>PCR產物送至上海英駿生物技術有限公司測序；利用Primer5.0軟件對測序結果進行SSR引物設計并送上海英駿生物公司合成，得引物對HZ4 (序列表SEQ.1D.N0.2和序列表SEQ.1D.N0.3);利用引物對HZ4在紅錐基因組中擴增出片段SSR4標記(序列表 SEQ.1D.N0.l)o
[0038]擴增按以下操作進行:
[0039]擴增體系:反應體系1(^1^，包括30-50叩的模板0嫩，0.25個單位的0嫩聚合酶(TaKaRa)，1.Ομ L 的 lOXBuffer，2.5mM MgCl2I μ I, 2.5mM dNTPsl μ I, 0.1 μ I bovineserum albumin (BSA)；
[0040]擴增程序:95°C預變性 5min;95°C變性 30s，52°C 復性 45s，72°C 延伸 lmin30s，30個循環；最后72°C延伸IOmin。
[0041]〈6>多態性分析
[0042]以30個來自2個不同種源的紅錐基因組DNA為材料檢測引物多態性；在30個紅錐個體中擴增出4條譜帶，說明HZ4為多態性引物。
【權利要求】
1.一種紅錐SSR標記，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列，微衛星標記編號為SSR4。
2.擴增權利要求1所述紅錐SSR標記的引物對HZ4，其特征在于包括具有序列表SEQ.1D.N0.2 和 SEQ.1D.N0.3 的堿基序列。
3.權利要求1所述紅錐SSR標記的制備方法，其特征在于利用特定引物對HZ4對紅錐總DNA進行PCR擴增，得到簡單重復序列；所述引物對HZ4包括具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的喊基序列。
4.根據權利要求3所述紅錐SSR標記的制備方法，其特征在于包括以下步驟: <1>紅錐總DNA提取與酶切 選取紅錐幼嫩的葉片，用CTAB法提取核基因組；用EcoRV在37°C下酶切3h，65°C下20min滅活內切酶；反應體系20 μ L，包括2.0 μ L的lOXBuffer, 1.0 μ L的EcoRV內切酶，2 μ L的DNA，15.0 μ L的滅菌雙蒸水； 〈2>接頭的連接 將步驟〈DEcoRV酶切的紅錐基因組DNA連接上下接頭；60 μ L連接體系中含有酶切的紅錐基因組DNA9 μ L，上 下接頭各IOOpmol ;連接反應在I倍Τ4連接酶緩沖條件下進行，于16°C連接過夜；連接后的混合物在65°C反應20min，滅活連接酶； <3>連接產物的擴增 過夜步驟〈2>連接后的混合物以AP2和復合SSR引物為上下引物對連接后的混合物進行PCR擴增；1.5%的瓊脂膠電泳，切膠回收500-1000bp的片段，試劑盒純化； <4>克隆并篩選富集的微衛星DNA片段 將步驟<3>PCR產物連接到載體pMD18-T Vectors上，然后轉化到感受態細胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培養基上，37°C培養過夜；用M13引物進行PCR擴增檢測，選取400-1000bp左右的片段； <5>測序、引物設計與擴增分析 將步驟<4>PCR產物送測序；利用Primerf.0軟件對測序結果進行SSR引物設計并送合成，得引物對HZ4 ;利用引物對HZ4在紅錐基因組中擴增出片段SSR4標記。
5.權利要求4所述紅錐SSR標記的制備方法，其特征在于: 步驟〈2>中上下接頭分別具有序列表SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5的堿基序列； 步驟<3>中AP2和復合SSR引物分別具有序列表SEQ.1D.N0.6和SEQ.1D.N0.7的堿基序列； 步驟<4>中M13引物對具有序列表SEQ.1D.N0.8和SEQ.1D.N0.9的堿基序列； 步驟<5>中引物對HZ4分別具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的堿基序列。
6.權利要求5所述紅錐SSR標記的制備方法，其特征在于步驟〈5>中擴增按以下操作進行:擴增體系:反應體系10 μ L，包括30-50ng的模板DNA，0.25個單位的DNA聚合酶(TaKaRa)，1.Ομ L 的 lOXBuffer，2.5mM MgCl2I μ I, 2.5mM dNTPsl μ I, 0.1 μ I bovineserum albumin (BSA)； 擴增程序:95°C預變性5min;95°C變性30s, 52°C復性45s, 72°C延伸lmin30s, 30個循環;最后72°C延伸IOrnin0
7.權利要求1所述紅錐SSR4標記在紅錐的分子標記輔助育種方面的應用。
8. 權利要求1所述紅錐SSR4標記在紅錐的QTL研究方面的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740704SQ201410029390
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月22日 優先權日:2014年1月22日
【發明者】蔣燚, 劉海龍, 朱積余, 黃榮林, 姜英, 何應會 申請人:廣西壯族自治區林業科學研究院