一種青蝦眼柄rna的提取方法
【專利摘要】本發明提供了一種青蝦眼柄RNA的提取方法，先將青蝦眼柄組織放入RNA保存液中，將眼柄色素部分夾破、漂洗；再將處理后的眼柄組織放入裝有RNA保存液的離心管中漂洗后離心；再取眼柄組織放入DEPC水中漂洗后在液氮中將其研磨成粉末，然后加入RNAisoPlus，混合均勻后離心；然后取上清液，加入氯仿，震蕩后靜置、離心；再取水相加入異丙醇，靜置后離心，棄上清；在所得沉淀中加入乙醇，離心后將所得沉淀干燥，再用DEPC水溶解，即得青蝦眼柄RNA。本發明消除了RNA提取過程中色素的干擾和降解，步驟簡便，成本低廉，克服了常規方法提取青蝦眼柄RNA質量不能保證的問題。
【專利說明】一種青蝦眼柄RNA的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學核酸提取領域，特別涉及一種青蝦眼柄RNA的提取方法。【背景技術】
[0002]青蝦是我國重要的淡水經濟蝦類，目前開展的青蝦分子輔助育種工作主要集中于重要功能基因的研究。甲殼動物眼柄的X器竇腺綜復合體能夠分泌多種重要神經激素如性腺抑制激素(gonad-1nhibting hormone, GIH)、甲殼動物高血糖激素(crustaceanhyperglycemic hormone,(]冊)、脫皮抑制激素(molt-1nhibiting hormone ,MIH)等，這些激素在蛻皮、生殖、發育、色素移動、滲透壓調節和糖代謝等生理過程發揮關鍵作用。然而由于眼柄組織含有色素這一特殊性，常規方法提取的眼柄RNA往往因為色素的存在發生降解，無法達到基因克隆和表達研究的要求，嚴重阻礙了對這些重要基因的研究。有學者針對青蟲下眼柄RNA提取方法進行了改進,在提取過程中，采用RNAiso/Unizol結合RNeasy MiniKit (均為試劑盒)，該方法雖然能提取出質量較好的RNA，但是操作步驟復雜，而且試劑盒成本很高，同時由于在提取過程中反復過柱而造成RNA大量流失。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是克服現有技術的不足而提供一種青蝦眼柄RNA的提取方法，該方法能消除RNA提取過程中大量黑色素的干擾并防止降解，得到高質量的RNA。
[0004]一種青蝦眼柄RNA的提取方法，包括以下步驟:
步驟1，取青蝦眼柄組織放入RNA保存液中，將眼柄色素部分夾破、漂洗；
步驟2，將經過步驟I處理所得的眼柄組織放入裝有RNA保存液的離心管中漂洗后離心，去掉上清液，取眼柄組織；
步驟3，將步驟2所得眼柄組織放入DEPC水中漂洗后在液氮中將其研磨成粉末，然后加ARNAiso Plus，混合均勻后離心，取上清液；
步驟4，在步驟3所得上清液中加入氯仿，所述氯仿的體積是上清液的1/5，震蕩后靜置、離心，取水相；
步驟5，在步驟4所得水相中加入等體積的異丙醇，靜置后離心，棄上清，保留沉淀；步驟6，在步驟5所得沉淀中加入乙醇，離心后將所得沉淀干燥，再用DEPC水溶解，即得青蟲下眼柄RNA。
[0005]上述青蝦眼柄RNA的提取方法中，步驟2中RNA保存液用量為每20mg眼柄組織加入1000 μ LRNA保存液。
[0006]上述青蝦眼柄RNA的提取方法中，步驟3中RNAiso Plus的加入量為每20mg眼柄組織加入 1500 μ L RNAiso Plus。
[0007]上述青蝦眼柄RNA的提取方法中，步驟2至步驟6中離心條件為3~5°C，11000~13000g 離心 5 ~20min。
[0008]上述青蝦眼柄RNA的提取方法中，步驟6中加入乙醇體積濃度為75%，加入量為500 μ L。
[0009]青蝦眼柄RNA提取的關鍵是提取過程中消除黑色素的干擾，RNA保存液能對組織RNA起到良好的保護效果，在4°C條件下能保存一個月，-20°C可以長期保存，因此在RNA保存液中對青蝦眼柄組織進行預處理能保證組織中的RNA不被降解或污染。通過夾破眼柄，充分釋放出色素；再經過離心將剩余的少量色素沉淀下來，將懸浮的眼柄組織經過DEPC水的漂洗后提取能得到高質量的眼柄RNA。通過本發明處理后的眼柄組織進一步用常規方法提取RNA，無論是標準的瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計以及反轉錄PCR對比的結果，均顯示質量很好。
[0010]本發明與現有技術相比，其顯著優點在于:第一，消除了 RNA提取過程中色素的干擾和降解的問題，步驟簡便，成本低廉，克服了常規方法提取青蝦眼柄RNA質量不能保證的問題；第二，為青蝦眼柄重要基因的克隆表達解決了前期關鍵問題；第三，為其他甲殼類動物眼柄RNA的提取提供了參考，本發明簡便有效的前處理方法在甲殼動物分子生物學研究中具有良好而廣泛的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1中泳道I為標記的電泳圖，泳道2為本發明所得產物的電泳圖，泳道3為Trizol法提取產物的電泳圖。
[0012]圖2中泳道I為標記的電泳圖，泳道2為本發明所得產物通過反轉錄及PCR擴增青蝦蛻皮抑制激素(MIH)基因的電泳圖，泳道3為Trizol法提取產物通過反轉錄及PCR擴增青蝦蛻皮抑制激素(MIH)基因的電泳圖。
[0013]圖3中泳道I為標記的電泳圖，泳道2為本發明所得產物通過反轉錄及PCR擴增青蝦性腺抑制激素(GIH)基因的電泳圖，泳道3為Trizol法提取產物通過反轉錄及PCR擴增青蝦性腺抑制激素(GIH)基因的電泳圖。
[0014]其中，標記的分子量從上到下依次為2000bp，1000bp，750 bp, 500 bp, 250 bp, 100
bp ο
【具體實施方式】
[0015]實施例1
取著紙' QMacmbrachium nipponense )進行實驗。
[0016](1)在無菌培養皿中加入少量RNA保存液(TaKaRa Bio Inc.Japan),取無菌手術剪剪取兩只青蝦眼柄，放入培養皿中用無菌鑷子將眼柄色素部分夾破，漂洗，盡量釋放出其中的黑色素；
(2)將處理后的眼柄加入裝有RNA保存液(TaKaRaBio Inc.Japan)的離心管中漂洗，40C 12000g離心5min，共分為三相，上層液相，中層眼柄基部組織，下層少量色素相，去掉上清液；
(3)用鑷子小心挑取中層眼柄基部組織，用DEPC水中漂洗一遍，在液氮中將其研磨成粉末狀；加入750yL RNAiso Plus (TaKaRa Bio Inc.Japan),研磨成粉末狀,加入兩個預先冷凍的離心管中，用一次性注射器吹打20次左右；
(4)4°C,12000g離心10 min，將上清液轉移至新的離心管中，室溫靜置5min ；(5)加入150μ L的氯仿，劇烈震蕩15s，靜置3min, 4°C，12000g離心20 min,取上層水相加入新的離心管中；
(6)在上述水相中加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，-20°C靜置10min，4°C，12OOOg離心20 min,棄上清,保留沉淀；
(7)在離心管中加入500μ L 75%的酒精，4°C，12 OOOg離心5min，棄上清，保留沉淀;
(8)將離心管在4°C，12OOOg離心30s，用移液槍吸出酒精；
(9)在無菌操作臺干燥沉淀，加入25μ L DEPC水，得青蝦眼柄RNA。
[0017]通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察相關條帶，并驗證提取產物是否為RNA。通過圖1可以看到本發明所得結果有明顯的rRNA的條帶，而常規Trizol法基本無明顯的rRNA的條帶。
[0018]通過紫外分光光度計檢測產物的質量。0D260 nm /0D280nm的檢測結果中，本發明方法獲取的RNA測量值平均數為1.87，在1.8^2.0間，說明獲得的產物為較為純凈的核酸，而常規Trizol法獲取的RNA其測量平均值為1.46，說明獲得產物存在其他雜質的污染。
[0019]通過OnePrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒,根據青奸moltinhibiting hormone (MnMIH)和 gonad-1nhibting hormone (MnGIH)設計的引物進行反轉錄及擴增，引物序列見表1:
表1青蝦兩個眼柄中特異表達的基因的PCR擴增反應所用引物序列
引物名稱I序列(5’到3’)'
【權利要求】
1.一種青蝦眼柄RNA的提取方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟1，取青蝦眼柄組織放入RNA保存液中，將眼柄色素部分夾破、漂洗； 步驟2，將經過步驟I處理所得的眼柄組織放入裝有RNA保存液的離心管中漂洗后離心，去掉上清液，取眼柄組織； 步驟3，將步驟2所得眼柄組織放入DEPC水中漂洗后在液氮中將其研磨成粉末，然后加ARNAiso Plus，混合均勻后離心，取上清液； 步驟4，在步驟3所得上清液中加入氯仿，所述氯仿的體積是上清液的1/5，震蕩后靜置、離心，取水相； 步驟5，在步驟4所得水相中加入等體積的異丙醇，靜置后離心，棄上清，保留沉淀； 步驟6，在步驟5所得沉淀中加入乙醇，離心后將所得沉淀干燥，再用DEPC水溶解，即得青蟲下眼柄RNA。
2.根據權利要求1所述的一種青蝦眼柄RNA的提取方法，其特征在于:所述步驟2中RNA保存液用量為每20mg眼柄組織加入1000 μ LRNA保存液。
3.根據權利要求1所述的一種青蝦眼柄RNA的提取方法，其特征在于:所述步驟3中RNAiso Plus的加入量為每20mg眼柄組織加入1500 μ L RNAiso Plus。
4.根據權利要求1所述的一種青蝦眼柄RNA的提取方法，其特征在于:所述步驟2至步驟6中離心條件為3~5°C，11000~13000g離心5~20min。
5.根據權利要求4所述的一種青蝦眼柄RNA的提取方法，其特征在于:所述步驟6中加入乙醇體積濃度為75%，加入量為500 μ L。
【文檔編號】C12N15/10GK103773758SQ201410030427
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】江豐偉, 傅洪拓, 喬慧, 張文宜, 蔣速飛, 熊貽偉, 龔永生, 金舒博 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心