馬鈴薯腐爛莖線蟲快速pcr分子檢測方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明為“馬鈴薯腐爛莖線蟲快速PCR分子檢測方法及其應用”，屬植物線蟲分子檢測【技術領域】。馬鈴薯腐爛莖線蟲快速PCR分子檢測方法，包括PCR反應體系，其特征在于所述PCR反應體系中有一組特異性引物，所述特異性引物為DdF1和DdR1，上述引物能夠從A型和B型的馬鈴薯腐爛莖線蟲中特異的擴增出長度為495bp的片段，從而實現對馬鈴薯腐爛莖線蟲的快速分子檢測。本發明具有靈敏度高，特異性強且快速準確，在作物腐爛莖線蟲病的早期診斷和田間監測預警等方面，具有很高的實際應用價值。
【專利說明】馬鈴薯腐爛莖線蟲快速PCR分子檢測方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬植物線蟲分子檢測【技術領域】，涉及馬鈴薯腐爛莖線蟲快速PCR分子檢測方法及其應用。
【背景技術】
[0002]馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor Thorne)是引起馬鈴薯和甘薯的的主要病原物之一，該線蟲是一種遷移性內寄生線蟲，主要危害作物的地下部分。我國早在1937年就報道發生甘薯莖線蟲病，曾一度認為是由D.dipsaci引起的(劉先寶，葛建軍，譚志瓊，曹愛新.馬鈴薯腐爛莖線蟲在國內危害馬鈴薯的首次報道.植物保護，2006，32(6): 157-158)，直至1979年，張香蓉認為病原是馬鈴薯腐爛莖線蟲(張香蓉.地瓜莖線蟲病.濟南:山東科技出版社，1979)，以后丁再福和林茂松、尹光德和張云美對病原進行了系統的鑒定，證實山東、江蘇甘薯上的莖線蟲病原為馬鈴薯腐爛莖線蟲(丁再福，林茂松.甘薯馬鈴薯和薄荷上的莖線蟲的鑒定.植物保護，1982，9 (3):169172;尹光德，張云美.甘薯莖線蟲病病原線蟲的訂正.山東農大學報(自然科學版)，1983，4，117-127)。陳品三等報道該線蟲引起當歸麻口病(陳品三，鄭經武.當歸麻口病致病莖線蟲的鑒定研究.植物保護，1988，14(6): 12-14)。馬鈴薯腐爛莖線蟲寄主范圍非常廣泛，包括馬鈴薯、甘薯、豌豆、花生等100多種寄主(Peng H, GaoB-l, Kong L-a, Yu Q,Huang ff-k, et al.(2013)Exploring the Host Parasitism of theMigratory PIant-ParasiticNematode Ditylenchus destuctor by Expressed SequenceTags Analysis.PLoS 0NE8 (7): e69579.)，每年帶來巨大的經濟損失，且危害在逐年上升，在我國和世界其他國家和地區將其劃為檢疫性有害生物(中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄，2OO7 ；EPP0, 2008Di·agnostics&Diagnostic: Ditylenchus destructorand Ditylenchus dipsaci)。除此之外，馬鈴薯腐爛莖線蟲也侵染花丼的塊根和塊莖；D.destructor在南非侵染花生，造成巨大的損失(林茂松，文玲，方中達.馬鈴薯腐爛線蟲與甘薯莖線蟲病.江蘇農業學報，1999，15 (3): 186-190)，除此之外，國內外還報道了馬鈴薯腐爛莖線蟲能夠危害馬鈴薯和花生(劉先寶，葛建軍，譚志瓊，曹愛新.馬鈴薯腐爛莖線蟲在國內危害馬鈴薯的首次報道.植物保護，2006，32 (6):157-158;程云，張紹升.腐爛莖線蟲對花生的致病性，福建農林大學學報(自然科學版)，2007，36 (5) 454-457)。
[0003]由馬鈴薯腐爛莖線蟲引起的甘薯莖線蟲病是我國甘薯產區的重要病害之一，一般發病田塊減產20%~50%，重病田炔基本上絕產無收(陳品三.甘薯糠腐莖線蟲病.1995，512-517)。在我國的北京、天津、山東、山西、河北、河南、江蘇、浙江、福建、遼寧、甘肅等省市均有發生，以山東、河北兩省發生最為嚴重，部分地區的甘薯產區發病面積達25%，發病率在30%左右，嚴重者發病率可高達80%，發病地塊一般減產20-30%，嚴重者達50%以上，甚至絕產；該病不僅在田間為害直接造成減產，而且還引起儲藏后期爛窖(陳發煒，韓祥紅，李祥升.甘薯莖線蟲病的綜合防治技術.植保技術與推廣，1996:16 (6):12)。1977年山東調查，全省該病害已遍及9個地區(市)57個縣。有的地區田間種薯腐爛減產達80%以上，儲藏爛窖的損失在50%以上(李建中，彭德良，劉淑艷，黃文坤.馬鈴薯腐爛莖線蟲在中國的適生性風險分析.廖金鈴，彭德良，鄭經武等.中國線蟲學研究(第二卷).北京:中國農業科學技術出版社，20082:137-142)。因此，馬鈴薯腐爛莖線蟲已成為我國華北和華東甘薯上毀滅性線蟲病害，嚴重制約了我國甘薯產業的發展(范文中，孫淑云，孫艷梅.警惕甘薯莖線蟲病流行.吉林農業科學，1999，24 (4): 32;葉松枝，李躍杰，劉海元.甘薯莖線蟲病的發生與防治技術.植保技術與推廣，1997，17 (3)，20-21)。該線蟲侵入甘薯后，食道腺分泌一些果膠酶、淀粉酶和蛋白酶等細胞壁降解酶類，通過口針注入甘薯體內，使甘薯細胞崩潰、組織腐爛，伴隨著其它真菌和細菌加劇危害，常形成“糠心”或龜裂，使甘薯失去食用價值(林茂松，文玲，方中達.馬鈴薯腐爛線蟲與甘薯莖線蟲病.江蘇農業學報，1999，15(3): 186-190.)。
[0004]以PCR為基礎的分子生物學技術的快速發展為植物線蟲的快速診斷和檢測提供了強有力的工具。特異性引物PCR分子檢測技術在植物線蟲的分子檢測中取得了很大的發展，通過一次PCR擴增即可檢測出樣本中的一個或多個植物線蟲的種群，極大的縮短了檢測時間，提高了檢測效率。在植物線蟲的快速分子檢測中，基于植物線蟲的核糖體DNA(rDNA)為祀標而構建的特異性檢測方法取得了巨大的進展。Bulman&Marshall (BulmanSR,Marshall Jff.Differentiation of Australasian potato cyst nematode (PCN)populations using the polymerase chain reaction (PCR) New Zealand Journal of Cropand Horticultural Science.1997; 25:123 - 129)在分析了馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的rDNA-1TS的序列結構基礎上，構建了馬鈴薯金線蟲的特異性引物PITSr3和馬鈴薯白線蟲的特異性引物PITSp4，通用引 物ITS5與PITSr3可以擴增343bp馬鈴薯金線蟲的特異性片段，與PITSp4可以擴增出265bp特異性識別馬鈴薯白線蟲的DNA片段。在一個PCR反應中，使用PITSr3，PITSp4和ITS5這3個引物，即使復合種群中金線蟲DNA的含量僅為白線蟲的百分之一，也能從復合種群檢測出馬鈴薯金線蟲。Subbotin等(Subbotin, S.A., Peng, D.and Moens, Μ.2001Α rapid method for the identification of the soybeancyst nematode Heterodera glycines using duplex PCR.Nematology3, 365 - 370)構建了基于rDNA-1TS區域上的大豆孢囊線蟲特異性引物GlyFl，應用兩組引物D3A和D3B及大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyFl和引物rDNA2成功地對大豆孢囊線蟲進行了分子診斷研究。大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyFl靈敏性非常高，能從單條幼蟲的微量DNA中擴增出大豆孢囊線蟲種特異性片段。彭德良等(彭德良，王瓊，耿麗鳳，李佳，彭煥，張東升.一種香蕉穿孔線蟲早期分子檢測方法，專利號ZL201010113930.X)根據香蕉穿孔線蟲ITS的序列差異設計了香蕉穿孔線蟲的特異性引物RsFl/RsRl，結合28S區的D3擴展區的通用引物(D3A/D3B)作為內標，采用一步雙重PCR方法能夠特異地檢測出香蕉穿孔線蟲，同時該方法能夠用于土壤樣本和罹病植物的直接檢測。
[0005]在馬鈴薯腐爛莖線蟲的分子檢測中，Wendt等(Wendt, K., Vrain, T.C.&ffebster, J.Μ.1993.Separation of three species of Ditylenchus and some hostraces of D.dipsaci by Restriction Fragment Length Polymorphism.Journal ofNematology25, 555-563)開發了 ITS-RFLP的技術，利用多種限制性內切酶酶切ITS序列，能夠準確的區分馬鈴薯腐爛莖線蟲和鱗球莖線蟲。本實驗室在前期的研究中發現，馬鈴薯腐爛莖線蟲的ITS具有明顯差異，可以分為明顯的2種類型:A型和B型，據此設計出2對特異性引物檢測A型和B型，A型馬鈴薯腐爛莖線蟲特異引物為DDS1/DDS2，特異擴增片段為252bp ；B型馬鈴薯腐爛莖線蟲特異引物為DDL1/DDL2，特異擴增片段為485bp ;引入線蟲通用引物D3A/D3B作內標，研究出一步雙重PCR特異性檢測馬鈴薯腐爛莖線蟲不同類型群體的分子技術和方法，該分子檢測技術具有特異性強、方法可靠、靈敏性高、操作簡便，檢測的精確度達到單條線蟲的水平。(宛菲，彭德良，楊玉文，何月秋.馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性分子檢測技術研究.2008 植物病理學報，38 (3): 263-270) ο Marek 等(M.Marek, M.Zouhar, 0.Douda, J.Mazakova and P.Rysanek 2010.Bioinformatics-assisted characterizationof the ITS1-5.8S_ITS2segments of nuclear rRNA gene clusters,and itsexploitation in molecular diagnostics of European crop-parasitic nematodes ofthe genus Ditylenchus.Plant Pathology59, 931-943)等根據D.destructor和D.dipsaci的差異開發出能夠同時檢測上述兩種線蟲的特異性引物DipU-F/DipU-R，Des2-F/Desl-R,其中DipU-F/DipU-R能夠特異的從D.dipsaci檢測出333bp的片段，Des2-F/Desl-R能夠特異的從馬鈴薯腐爛莖線蟲中檢測出453bp的片段。但后期的研究結果表明Des2-F/Desl-R只能夠檢測B型的馬鈴薯腐爛莖線蟲(Subbotin S.A., Inserra R.N., MaraisM.,Mullin P., Powers T., Roberts P.A., Van den Berg E., Yeates G.ff.&Baldwin, J.G.2011.Diversity and phylogenetic relationships within the spiral nematodesof Helicotylenchus Steiner, 1945 (Tylenchida:Hoplolaimidae) as inferredfrom analysis of the D2-D3expansion segments of28S rRNA gene sequences.Nematology，13:773-785)。劉斌等(劉斌，梅圓圓，鄭經武.2007.腐爛莖線蟲種內群體特異性檢測研究.浙江大學學報(農業與生命科學版)，33(5):490-496)根據馬鈴薯腐爛莖線蟲的ITS序列設計了一組特異性引物，能夠擴增出346bp的片段，但是檢測的樣本只包括了馬鈴薯腐爛莖線蟲。劉倩等(劉倩，牛俊海，簡恒，郭全新，陳昌龍.基于環介導等溫擴增檢測甘薯腐爛莖線蟲的試劑盒及其應用，CN102260746A)開發了馬鈴薯腐爛莖線蟲的LAMP檢測技術。
[0006]國內外已有馬鈴薯腐爛莖線蟲核糖體DNA的ITS區域的研究報道，但是目前已開發的引物大部分只能夠檢測馬鈴薯腐爛莖線蟲某一種類型，目前還沒有能夠同時檢測A類和B型馬鈴薯腐爛莖線蟲的特異性PCR檢測方法。
【發明內容】
[0007]本發明的主要
【發明內容】
是提供一種基于ITS序列差異的馬鈴薯腐爛莖線蟲快速PCR分子檢測方法及其應用，為制定線蟲的快速分子檢測、作物腐爛莖線蟲病的早期診斷和輔助鑒定等服務。
[0008]馬鈴薯腐爛莖線蟲快速PCR分子檢測方法，包括PCR反應體系，其特征在于所述PCR反應體系中有一組特異性引物，所述特異性引物為DdFl和DdRl，
[0009]DdF1:5 ’ -GCTCTGTGCCTGGCTAATTTGTG-3，，
[0010]DdRl: 5，-ACCAAACACTGGACAGCATTATC-3，。
[0011]所述PCR反應體系中還含有通用引物D2A和D3B， [0012]D2A: 5 ’ -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3，，
[0013]D3B: 5 ’ -TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3 ’。[0014]所述的PCR 反應體系為 2.5μ I 的 10XPCR 含 Mg2+的 Buffer ;2μ IlOmM dNTP ；1.5μ I引物對DdFl/DdRl ;0.2μ I Taq DNA聚合酶；2 μ I模板DNA ;滅菌ddH20補足至25 μ I。
[0015]PCR 反應條件為 95°C 預變性 8min，95°C，45s，55°C，30s，72°C，lmin，35 個循環；72°C，10min，4°C 保存。
[0016]上述馬鈴薯腐爛莖線蟲快速PCR分子檢測方法在送檢樣本中是否帶有馬鈴薯腐爛莖線蟲及輔助鑒定中的應用。
[0017]本發明利用ITS通用引物擴增獲得7個不同國家和地區的馬鈴薯腐爛莖線蟲，其中包括2個B型和5個A型種群。從Genbank下載多個莖線蟲屬的ITS序列比對后，在馬鈴薯腐爛莖線蟲ITS特異性區域設計引物，用于馬鈴薯腐爛莖線蟲的快速分子檢測。
[0018]本發明開發了馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性引物DdFl和DdRl，構建了快速PCR分子檢測PCR體系。采用特異性引物DdFl和DdRl能夠同時對A型和B型馬鈴薯腐爛莖線蟲進行特異性擴增，擴增片段長度均為495bp，而其他7類莖線蟲屬14個種群均沒有檢測到495bp的特異性片段。為了降低檢測的假陰性結果，在特異性檢測的同時加入28S的通用引物D2A和D3B，用于DNA質量的檢測，通用引物D2A和D3B能夠從所有的有效的DNA中擴增出長度為780bp左右的片段，陽性的樣本將同時出現了 495bp的特異性片段和780bp的片段，而非馬鈴薯腐爛莖線蟲只有780bp的片段，從而增加了檢測結果的準確性。同時，不同稀釋濃度的單頭馬鈴薯腐爛莖線蟲DNA和濃度確定的一系列稀釋濃度的馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA用于本研究開發的馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性引物DdFl和DdRl的靈敏度檢測，從而確定馬鈴薯腐爛莖線蟲的特異性引物和檢測方法的檢測閾值為lng/ul和1/128頭線蟲DNA。具有很高的靈敏度。由此可以確定本發明構建的特異性引物DdFl和DdRl及其檢測方法特異性強、靈敏度高、快速、準確。
[0019]本發明待測的植物線蟲包括A型馬鈴薯腐爛莖線蟲、B型馬鈴薯腐爛莖線蟲、2個國外馬鈴薯腐爛莖線蟲種群、鱗球莖線蟲、非洲莖線蟲、D.gagis、D.weischeri和3個莖線蟲未知種。
[0020]本發明采用通用引物TW81和AB28擴增出馬鈴薯腐爛莖線蟲的ITS序列，通過和其他莖線蟲的ITS序列比對設計出一對特異性引物DdFl和DdRl，，實現了對A型和B型馬鈴薯莖線蟲的同時檢測和診斷。具有極高的特異性和靈敏度，降低了對檢測樣本的誤判。同時該方法將可以應用于馬鈴薯腐爛莖線蟲的田間樣品檢測和發生分布的監測預警等方面，具有實際的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1:不同莖線蟲種的ITS序列比對及特異性引物設計，
[0022]圖2:馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性檢測結果，
[0023]M為標準DNA分子標記(DNA marker III); 1_7分別為馬鈴薯腐爛莖線蟲不同群體(編碼為0(101，0(102，0(103，0(104，0(105，0(106，0(107);8-14分別為鱗球莖線蟲不同群體(0?01，Dp02, Dp03, Dp04, Dp05, Dp06, Dp07) ；15 為非洲莖線蟲(編碼為 DaOI) ;16 為 D.weischeri群體(DwOl) 17為D.gagis群體(DgOl)，18-20為3個未知種的莖線蟲(DityOl，Dity02和Dity03) ;CK為陰性對照；[0024]圖3:不同稀釋濃度的單頭馬鈴薯腐爛莖線蟲DNA靈敏度檢測結果，
[0025]M為標準DNA分子標記(DNA marker III); 1-8 分別為 1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64,1/128條馬鈴薯腐爛莖線蟲；CK為陰性對照。
[0026]圖4:不同濃度的馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA靈敏度檢測結果，
[0027]M為標準DNA分子標記(DNA marker III) ;1_8為馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA(100 μ g/ μ 1、10 μ g/ μ 1、I μ g/ μ 1、IOOng/ μ 1、IOng/ μ 1、Ing/ μ 1、IOpg/ μ I 和 lpg/ μ I)；CK:陰性對照。
【具體實施方式】
[0028]下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0029]本發明的實驗選用的材料:
[0030]7個馬鈴薯腐爛莖線蟲群體為本實驗室從內蒙古、河南、吉林、山東和美國和加拿大等地收集，13個鱗球莖線蟲、非洲莖線蟲、D.weishceri, D.gagis和其他未知種的莖線蟲DNA為本實驗室工作人員從外國收集(見表1)。上述馬鈴薯腐爛莖線蟲DNA本實驗室均有保存，可以對公眾發放。
[0031]表1檢測的莖線蟲樣品代碼及群體來源
[0032]
【權利要求】
1.馬鈴薯腐爛莖線蟲快速PCR分子檢測方法，包括PCR反應體系，其特征在于所述PCR反應體系中有一組特異性引物，所述特異性引物為DdFl和DdRl，
DdFl:5’ -GCTCTGTGCCTGGCTAATTTGTG-3’，
DdRl:5’ -ACCAAACACTGGACAGCATTATC-3’。
2.根據權利要求1所述的分子檢測方法，所述PCR反應體系中還含有通用引物D2A和D3B,
D2A: 5 ’ -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3，，
D3B: 5 ’ -TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3，。
3.根據權利要求1所述的分子檢測方法，所述的PCR反應體系為2.5 μ I的10 X PCR含Mg2+ 的 Buffer ；2 μ IlOmM dNTP ;1.5 μ I 引物對 DdFl/DdRl ;0.2 μ I Taq DNA 聚合酶；2 μ I模板DNA ;滅菌ddH20補足至25 μ I。
4.根據權利要求3所述的分子檢測方法，其中PCR反應條件為95°C預變性8min，95°C，45s，55°C，30s，72°C，lmin，35 個循環；72°C，lOmin，4°C保存。
5.權利要求1-4任一馬鈴薯腐爛莖線蟲快速PCR分子檢測方法在送檢樣本中是否帶有馬鈴薯腐爛莖線蟲及輔助鑒定中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740857SQ201410050457
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年2月13日 優先權日:2014年2月13日
【發明者】彭德良, 彭煥, 賀文婷 申請人:中國農業科學院植物保護研究所