一種湛江叉鞭金藻培養基和培養方法
【專利摘要】本發明屬于微藻養殖領域，公布了一種湛江叉鞭金藻改良培養基配方和簡易培養技術。湛江叉鞭金藻的培養傳統上使用f/2培養基并使用開放水泥池式培養，藻細胞倍增時間長，生長速度慢，投資大，產量低，易污染，操作麻煩。使用我發明的培養基并使用礦泉水桶培養湛江叉鞭金藻細胞不飽和脂肪酸含量高，成本低，不易污染，易于操作，大大降低了工作量，而且我在培養基中增加了碳酸氫鈉、檸檬酸鐵、山梨酸鉀、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液、絡合劑乙二胺四乙酸、牛糞和羊糞浸出液等營養成分，有機肥和無機肥混合使用，營養更加全面，湛江叉鞭金藻生長速度大幅度提高，培養周期縮短，產量提高92％。
【專利說明】一種湛江叉鞭金藻培養基和培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微藻養殖領域，尤其涉及一種湛江叉鞭金藻培養基和培養方法。
【背景技術】
[0002]湛江叉鞭金藻Dicrateria zhanjiangensis,隸屬金藻門 Chrysophyta,金藻目Chrysomonadales,等鞭藻科 Isochrysidaceae,叉鞭金藻屬 Dicrateria,為大小 2-7 微米的浮游單細胞藻類。因其無細胞壁，富含不飽和脂肪酸且生態適應性強，生長速度快，適于大規模繁殖，被認為是海產動物人工育苗的理想餌料，用作貽貝、牡蠣、泥蚶、對蝦等名貴水產品的優質開口飼料。
[0003]海水中無機碳的存在形式以HC03_為主(90% )，而游離的CO2不足I %。過去人們一直認為，水體中游離CO2是藻類利用外源無機碳的唯一形式。張學成的工作表明，螺旋藻培養基中添加50-100mmol/L NaHCO3，不僅可以滿足螺旋藻生長的需要，而且有助于保持藻體生長的PH值。林惠民認為，NaHCO3可作為藻類生長的碳源。我的研究表明叉鞭金藻可以利用HC03_作為碳源。
[0004]溫度、光照、鹽度、營養鹽等對湛江叉鞭金藻生長都有重要影響。氮在細胞代謝中是形成氨基酸、嘌呤、嘧啶、葉啉、氨基糖和胺化合物等的基本元素，因而氮是湛江叉鞭金藻生長最重要的營養元素。我的研究顯示尿素用作氮源無論對細胞密度的增加、不飽和脂肪酸的合成、蝦青素的積累等方面的效果均優于NaNO3和NH4Cl。人尿中95%是水，5%是可溶性無機鹽，其中約2%是尿素。在藻細胞的氮代謝中，氮必須以NH4+的形式與細胞內的碳水化合物衍生的酮酸作用生成氨基酸，再合成蛋白質。已經證實許多藻含有尿素酶，在它的催化作用下，尿素分解出氨被微藻利用，酶功能的差異是造成各種微藻利用尿素能力差異的主要原因。孫凌毅指出湛江叉鞭金藻對銨鹽和尿素的利用強于硝酸鹽。張貴杰等研究指出培養湛江叉鞭金藻以尿素效果最好，硝酸鈉次之，氯化銨最差。張青田等認為以尿素為氮源培養湛江叉鞭金藻效果強于氯化銨。本人研究證實每升培養液中添加l_2mL的尿液對湛江叉鞭金藻生長有較好促進作用。
[0005]湛江叉鞭金藻的培養傳統上使用f/2培養基并使用開放水泥池式培養，藻細胞倍增時間長，生長速度慢，投資大，產量低，容易污染，操作麻煩。使用我發明的培養基并使用礦泉水桶培養湛江叉鞭金藻細胞不飽和脂肪酸含量高，成本低，不易污染，易于操作，大大降低了工作量，而且我在培養基中增加了碳酸氫鈉、檸檬酸鐵、山梨酸鉀、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液、絡合劑乙二胺四乙酸、牛糞和羊糞浸出液等營養成分，有機肥和無機肥混合使用，營養更加全面，湛江叉鞭金藻生長速度大幅度提高，培養周期縮短，產量提高92 %。
【發明內容】
[0006]為了克服目前技術的不足，本發明提供了一種湛江叉鞭金藻培養基，其配方如下:
[0007]NH4N0325 毫克，NaN035 毫克，尿素 5 毫克，KH2PO4L 8 毫克，Na2Si038 毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長刺激素8國際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克，海藻酸丙二醇酯15毫克，環己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，乳酸鈉-L5毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，牛糞浸出液1.5毫升，羊糞浸出液1.2毫升，f/2微量元素溶液I毫升，f/2維生素溶液I毫升，煮沸冷卻后的純凈海水1000毫升，
[0008]其中f/2微量元素溶液配方=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，FeC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升，
[0009]f/2維生素溶液配方:維生素B120.5毫克，維生素B1100毫克，維生素H0.5毫克，蒸餾水1000毫升。
[0010]一種湛江叉鞭金藻簡易培養方法，具體步驟如下:
[0011]培養容器為家庭用的礦泉水桶，容積約20升，無色透明或帶淺天藍色，洗刷干凈，后用蒸餾水潤洗3遍，用漏斗裝入所述的培養基12升，充分搖勻5分鐘，選擇生命力旺盛、無污染的藻液進行接種，接種密度10X 104-15X 104Cell/mL，瓶口插入兩根干凈玻璃管，一根較長，插入較深，離瓶底約6厘米，用以充氣；另一根較短，約15厘米，兩端露出瓶口即可，用以排氣；兩根玻璃管同樣粗細，直徑6毫米；最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干凈的透明膠帶封口并將兩根玻璃管固定；長的玻璃管上端露出瓶口 7-10厘米，用乳膠管或塑膠料管與空氣壓縮機或氣泵相連，充氣，充氣量不宜太大，以藻細胞浮起不下沉即可；室內培養，空調控溫，最佳溫度27±2°C，日光燈照射，光照強度10000-120001x，光/暗周期為16L/8D，即光照16小時，黑暗8小時；培養至第6天，停止充氣，揭開透明膠帶，用漏斗從瓶口加入3升新鮮培養基，膠帶重新封口，充氣，繼續培養，至第10天，密度增加至400 X 104-500 X IO4Cell/mL，即可停止培養，從瓶口倒出藻液，將礦泉水桶洗刷干凈后，加入中藥消毒液消毒10-30分鐘，后進入下一輪培養；
[0012]所述中藥消毒液:由以下重量比的物質組成:黃芩7~10份、黃秋葵粉3~5份、魚腥草3~5份、大黃5~10份、甘草5~10份；將上述藥材放入可加熱的容器中，加入3~5倍體積的純凈水，煮沸后持續煮30~50分鐘，后過濾，沉淀I~2小時，后取澄清液即可；所述黃秋葵粉是清洗干凈并烘干后的黃秋葵莖葉、花及籽粒經超微粉碎機粉碎至250目，然后攪勻、滅菌所得。
[0013]優選地，對選用的所述的礦泉水桶，洗刷干凈后進行消毒，使用紫外燈消毒，消毒10-20分鐘。
[0014]優選地，對選用的所述的礦泉水桶，洗刷干凈后進行消毒，使用高壓氮氣噴射消毒，消毒5-10分中。
[0015]優選地，對選用的所述的礦泉水桶，洗刷干凈后進行消毒，使用高壓二氧化碳噴射消毒，消毒5-6分鐘。
[0016]優選地，對選用的所述的礦泉水桶，洗刷干凈后分兩個階段消毒，先使用高壓氮氣噴射消毒，消毒2-3分鐘。使用高壓二氧化碳噴射消毒，消毒2-3分鐘。消毒完畢后再進行藻類培養。
[0017]有益效果:湛江叉鞭金藻的培養傳統上使用f/2培養基并使用開放水泥池式培養，生長速度慢，產量低，容易污染，操作麻煩。使用我發明的培養基并使用礦泉水桶培養湛江叉鞭金藻不飽和脂肪酸含量高、成本低，不易污染，易于操作，大大降低了工作量，而且我在培養基中增加了碳酸氫鈉、檸檬酸鐵、山梨酸鉀、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液、絡合劑乙二胺四乙酸、牛糞和羊糞浸出液等營養成分，有機肥和無機肥混合使用，營養更加全面，湛江叉鞭金藻生長速度大幅度提高，培養周期縮短，產量提高92 %。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1湛江叉鞭金藻簡易培養方法圖。
[0019]其中附圖標記為:1礦泉水桶；2充氣管；3排氣管。
【具體實施方式】
[0020]I)接種用的湛江叉鞭金藻預先進行提純(本領域常規方法，只要可實現提純即可，例如索氏提取法)，以確保接種時藻種處于指數生長期；
[0021]2)九二 O植物生長刺激素為白色結晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解I小時以上)，再按所需濃度兌水稀釋；
[0022]3)因檸檬酸鐵(FeC6H5O7.5H20)較難溶解，可加少量自來水在火爐上微熱至80-90°C，并不斷攪拌至全部融化；
[0023]4)各種營養鹽要按配方中提供的順序加入，以免發生化學反應；
[0024]5)各種營 養鹽特別是f/2微量元素溶液和f/2維生素溶液均需預先配成母液且置于4°C冰箱冷藏保存備用，放置時間不要超過7天；
[0025]6)全部營養鹽加完后要搖動水桶15分鐘，使營養鹽混合均勻后即可接種；接種密度 10X 104-15X 104cell/mL ；
[0026]7)人尿制備方法:取人尿1000毫升，燒瓶煮沸后冷卻備用；
[0027]8)羊糞浸出液制備方法:取新鮮羊糞10公斤，加入麩皮I公斤，玉米面0.5公斤，自來水I升，充分攪拌，裝入塑料袋發酵10天，后取2公斤放入盆中，加入6升蒸餾水，充分攪拌15分鐘，靜置，7天后500目篩絹過濾，取濾液加熱煮沸30分鐘，以殺死其中的微生物，冷卻，靜置72小時，取上清液，即為羊糞浸出液，裝入磨口塞試劑瓶，密封，置于4°C冰箱備用；
[0028]9)牛糞浸出液制備方法:取牛糞50公斤，加入麩皮3公斤，玉米面I公斤，自來水4升，充分攪拌，堆成圓錐狀，自然發酵15天，后攤成薄層，陽光下暴曬3天，后取3公斤放入水桶中，加入10升蒸餾水，充分攪勻，靜置，48小時后400目篩絹過濾，取濾液加熱，煮沸45分鐘，殺死其中的細菌、霉菌、病毒等，冷卻，沉淀48小時，取上清液，即得牛糞浸出液，裝入磨口塞試劑瓶，密封，置于4°C冰箱備用。
[0029]10)海泥抽取液制備方法:取比較肥沃又不於黑的海泥，以1份泥加2分淡水，充分攪拌均勻，靜置1-2分鐘，取上層泥漿于鋁鍋中，按每1000毫升泥漿加I克NaOH的量加入NaOH,煮沸20-30分鐘。煮時需不斷攪拌均勻，煮后靜置24小時取上清液備用；
[0030]11) 土壤抽出液制備方法:取土壤I公斤，加蒸餾水1000毫升，再加入Na0H2_3克，煮沸120分鐘，冷卻后過濾，將清液置于暗處靜置48小時，取上清液備用；
[0031]12)所用化學藥品純度均需化學純級別。[0032]一種湛江叉鞭金藻培養基，其配方如下:
[0033]NH4N0325 毫克，NaN035 毫克，尿素 5 毫克，KH2PO4L 8 毫克，Na2Si038 毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長刺激素8國際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克，海藻酸丙二醇酯15毫克，環己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，乳酸鈉-L5毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，牛糞浸出液1.5毫升，羊糞浸出液1.2毫升，f/2微量元素溶液I毫升，f/2維生素溶液I毫升，煮沸冷卻后的純凈海水1000毫升，
[0034]其中f/2微量元素溶液配方=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，FeC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升，
[0035]f/2維生素溶液配方:維生素B120.5毫克，維生素B1100毫克，維生素H0.5毫克，蒸餾水1000毫升。
[0036]一種湛江叉鞭金藻簡易培養方法，具體步驟如下:
[0037]培養容器為家庭用的礦泉水桶，容積約20升，無色透明或帶淺天藍色，洗刷干凈，后用蒸餾水潤洗3遍，用漏斗裝入所述的培養基12升，充分搖勻5分鐘，選擇生命力旺盛、無污染的藻液進行接種，接種密度10X 104-15X 104Cell/mL，瓶口插入兩根干凈玻璃管，一根較長，插入較深，離瓶底約6厘米，用以充氣；另一根較短，約15厘米，兩端露出瓶口即可，用以排氣；兩根玻璃管同樣粗細，直徑6毫米；最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干凈的透明膠帶封口并將兩根玻璃管 固定；長的玻璃管上端露出瓶口 7-10厘米，用乳膠管或塑膠料管與空氣壓縮機或氣泵相連，充氣，充氣量不宜太大，以藻細胞浮起不下沉即可；室內培養，空調控溫，最佳溫度27±2°C，日光燈照射，光照強度10000-120001x，光/暗周期為16L/8D，即光照16小時，黑暗8小時；培養至第6天，停止充氣，揭開透明膠帶，用漏斗從瓶口加入3升新鮮培養基，膠帶重新封口，充氣，繼續培養，至第10天，密度增加至400 X 104-500 X IO4Cell/mL，即可停止培養，從瓶口倒出藻液，將礦泉水桶洗刷干凈后，加入中藥消毒液消毒10-30分鐘，后進入下一輪培養；
[0038]所述中藥消毒液:由以下重量比的物質組成:黃芩7~10份、黃秋葵粉3~5份、魚腥草3~5份、大黃5~10份、甘草5~10份；將上述藥材放入可加熱的容器中，加入3~5倍體積的純凈水，煮沸后持續煮30~50分鐘，后過濾，沉淀I~2小時，后取澄清液即可；所述黃秋葵粉是清洗干凈并烘干后的黃秋葵莖葉、花及籽粒經超微粉碎機粉碎至250目，然后攪勻、滅菌所得。
[0039]優選地，對選用的所述的礦泉水桶，洗刷干凈后進行消毒，使用紫外燈消毒，消毒10-20分鐘。
[0040]優選地，對選用的所述的礦泉水桶，洗刷干凈后進行消毒，使用高壓氮氣噴射消毒，消毒5-10分鐘。
[0041]優選地，對選用的所述的礦泉水桶，洗刷干凈后進行消毒，使用高壓二氧化碳噴射消毒，消毒5-6分鐘。
[0042]優選地，對選用的所述的礦泉水桶，洗刷干凈后分兩個階段消毒，先使用高壓氮氣噴射消毒，消毒2-3分鐘。使用高壓二氧化碳噴射消毒，消毒2-3分鐘。消毒完畢后再進行藻類培養。
[0043]最后應說明的是:以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述實施例所 記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明實施例技術方案的精神和范圍。
【權利要求】
1.一種湛江叉鞭金藻培養基，其特征在于配方如下: NH4N0325 毫克，NaN035 毫克，尿素 5 毫克，KH2PO4L 8 毫克，Na2Si038 毫克，NaHC03500 毫克，九二 O植物生長刺激素8國際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克，海藻酸丙二醇酯15毫克，環己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，乳酸鈉-L5毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，牛糞浸出液1.5毫升，羊糞浸出液1.2毫升，f/2微量元素溶液I毫升，f/2維生素溶液I毫升，煮沸冷卻后的純凈海水1000毫升， 其中 f/2 微量元素溶液配方=ZnSO4.4H2023 毫克，MnCl2.4H20178 毫克，CuSO4.5H2010毫克，FeC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35 克，蒸餾水1000毫升， f/2維生素溶液配方:維生素B120.5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H0.5毫克，蒸餾水1000毫升。
2.一種湛江叉鞭金藻培養方法，其特征在于具體步驟如下: 培養容器為家庭用的礦泉水桶，容積約20升，無色透明或帶淺天藍色，洗刷干凈，后用蒸餾水潤洗3遍，用漏斗裝入權利要求1所述的培養基12升，充分搖勻5分鐘，選擇生命力旺盛、無污染的藻液進行接種，接種密度10X 104-15X 104Cell/mL，瓶口插入兩根干凈玻璃管，一根較長，插入較深，離瓶底約6厘米，用以充氣；另一根較短，約15厘米，兩端露出瓶口即可，用以排氣；兩根玻璃管同樣粗細，直徑6毫米；最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干凈的透明膠帶封口并將兩根玻璃管固定；長的玻璃管上端露出瓶口 7-10厘米，用乳膠管或塑膠料管與空氣壓縮機或氣泵相連，充氣，充氣量不宜太大，以藻細胞浮起不下沉即可；室內培養，空調控溫，最佳溫度27±2°C，日光燈照射，光照強度10000-120001χ，光/暗周期為16L/8D，即光照16小時，黑暗8小時；培養至第6天，停止充氣，揭開透明膠帶，用漏斗從瓶口加入3升新鮮培養基，膠帶重新封口，充氣，繼續培養，至第10天，密度增加至400 X 104-500 X 104cell/mL，即可停止培養，從瓶口倒出藻液，將礦泉水桶洗刷干凈，重復上述操作，即進入下一輪培養。
3.一種湛江叉鞭金藻培養方法，其特征在于具體步驟如下:1)培養容器為家庭用的礦泉水桶，容積約20升，無色透明或帶淺天藍色，洗刷干凈，后用蒸餾水潤洗3遍，用漏斗裝入權利要求1所述的培養基12升，充分搖勻5分鐘，選擇生命力旺盛、無污染的藻液進行接種，接種密度10 X 104-15 X 104cell/mL,瓶口插入兩根干凈玻璃管，一根較長，插入較深，離瓶底約6厘米，用以充氣；另一根較短，約15厘米，兩端露出瓶口即可，用以排氣；兩根玻璃管同樣粗細，直徑6毫米；最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干凈的透明膠帶封口并將兩根玻璃管固定；長的玻璃管上端露出瓶口 7-10厘米，用乳膠管或塑膠料管與空氣壓縮機或氣泵相連，充氣，充 氣量不宜太大，以藻細胞浮起不下沉即可；室內培養，空調控溫，最佳溫度27±2°C，日光燈照射，光照強度10000-120001X，光/暗周期為16L/8D，即光照16小時，黑暗8小時；培養至第6天，停止充氣，揭開透明膠帶，用漏斗從瓶口加入3升新鮮培養基，膠帶重新封口，充氣，繼續培養，至第10天，密度增加至400 X 104-500 X IO4CelΙ/mL，即可停止培養，從瓶口倒出藻液，將礦泉水桶洗刷干凈后，加入中藥消毒液消毒10-30分鐘，后進入下一輪培養。所述中藥消毒液:由以下重量比的物質組成:黃芩7~10份、黃秋葵粉3~5份、魚腥草3~5份、大黃5~10份、甘草5~10份；將上述藥材放入可加熱的容器中，加入3~5倍體積的純凈水，煮沸后持續煮30~50分鐘，后過濾，沉淀I~2小時，后取澄清液即可；所述黃秋葵粉是清洗干凈并烘干后的黃秋葵莖葉、花及籽粒經超微粉碎機粉碎至250目，然后攪勻、滅菌 所得。
【文檔編號】C12N1/12GK103805515SQ201410075143
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月4日 優先權日:2014年3月4日
【發明者】王培磊 申請人:臨沂大學