一種用于檢測鹿流行性出血病病毒的引物對及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測鹿流行性出血病病毒的引物對，所述引物對的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；還公開了一種包含上述引物對的鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒及其檢測方法。本發明一種用于鹿流行性出血病病毒的引物對，在特異引物對的基礎上，優化了PCR條件，擴增出了鹿流行性出血病病毒的核苷酸序列，并優化了檢測條件和檢測體系制備了檢測該病毒的試劑盒。該試劑盒具有較高的特異性和穩定性，靈敏度達6pg，可以快速準確檢測鹿流行性出血病病毒。
【專利說明】—種用于檢測鹿流行性出血病病毒的引物對及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及病毒檢測領域，具體涉及一種用于檢測鹿流行性出血病病毒的引物對及其應用。
【背景技術】
[0002]鹿流行性出血病(epizootichaemorrhagic disease of deer, EHD)是一種季節性、非接觸性的病毒性傳染病。鹿流行性出血病病毒(EHDV)也是呼腸孤病毒科(Reoviridae)環狀病毒屬(Orbivirus)的成員，是通過節肢動物(主要是庫蠓)傳播的雙股RNA病毒。在自然條件下，鹿流行性出血病病毒可引起牛、綿羊等家畜及白尾鹿、糜、大角羚羊等多種馴養和野生反芻動物感染。臨床特征為體溫短暫升高，呈休克癥狀，粘膜和漿膜出血，于昏迷狀態下死亡。病變呈廣泛性充血、出血、嚴重水腫和血管壞死，有時出現腹膜水腫。目前 EHD 共發現 8 個血清型，分別是 EHDV-l、EHDV-2、EHDV-3、EHDV-4，EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8等。EHDV在形態結構上與藍舌病病毒極為相似，血清學上與藍舌病有明顯交叉，其VP7蛋白是病毒可溶性群特異性抗原，VP7基因也是EHDV群特異性分子檢測的靶基因。本病目前尚無有效疫苗和治療措施，控制和消滅EHD必須花費大量的人力物力，出口貿易也因此受限，給EHDV流行的國家帶來很大的經濟損失。EHDV的快速檢測方法和試劑是動物檢疫中急需解決的關鍵技術問題。
【發明內容】
[0003]發明目的:本發明所要解決的技術問題是一種用于鹿流行性出血病病毒的引物對。本發明還要解決的技術問題是提供一種鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒。
[0004]技術方案:為實現上述目的，本發明的一種用于檢測鹿流行性出血病病毒的引物對，所述引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
[0005]一種鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒，它包含所述的引物對。
[0006]上述的鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒，包括:
[0007]I)預混劑A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物P120 μ L，核苷酸序列如SEQ ID NO:2 的下游引物 Ρ220μ L，2XPCR pre_mix200 μ L，ddH20100 μ L 組成；
[0008]2)陰性對照:非鹿流行性出血病病毒的DNA片段600 μ L ;
[0009]3)陽性對照:鹿流行性出血病病毒的DNA片段600 μ L。
[0010]上述的鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
[0011]I)抽提鹿流行性出血病病毒的質粒；
[0012]2 )PCR擴增:PCR反應體系為50 μ L體系，反應體系中含PCR pre-mix 12yL，上下游Primer各I μ L，上述病毒質粒2yL，H20 34yL，瞬時離心混勻；PCR工作程序為:94°C預變性 3min ;94°C變性 30 s，58°C退火 lmin30 s，72°C延伸 lmin，15 個循環；72°C再延伸 10min。
[0013]3) PCR擴增產物分析。[0014]有益效果:與現有技術相比，本發明的優點如下:本發明一種用于鹿流行性出血病病毒的引物對，在特異引物對的基礎上，優化了 PCR條件，擴增出了鹿流行性出血病病毒的核苷酸序列，并優化了檢測條件和檢測體系制備了檢測該病毒的試劑盒。該試劑盒具有較高的特異性和穩定性，靈敏度達6pg，可以快速準確檢測鹿流行性出血病病毒。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1:PCR方法特異性實驗的電泳圖；其中，泳道I為DNAmaker，泳道2和3分別為豬和雞相關病毒的質粒擴增后產物，泳道3為本發明的鹿流行性出血病病毒的DNA擴增產物。
【具體實施方式】
[0016]實施例1:試劑盒的制備。
[0017]1、病毒及病料的來源和處理
[0018]鹿流行性出血臨床病料于2009年10月采自河南鹿內臟器官。取0.6g內臟組織于無菌研缽，加生理鹽水研磨，反復凍溶3次后6000 rmp離心4min,取上清于_20°C保存。
[0019]2、試劑
[0020]PCR pre-mix、蛋白酶 K 購自大連 Takara 公司；DNA Marker、GoldView 購自南京上高生物公司；引物由Sigma公司合成。其它試劑均為進口或國產分析純試劑。
[0021]1、引物的設計 與合成
[0022]根據GenBank中EHD的全基因序列，使用引物設計軟件Primer5.0設計一對檢測引物。EHD VP7 上游引物 Pl 為:5’-GGCAGCGCCAGAAGTTACC-3’ ；
[0023]下游引物P2 (5，-CCGCTGCATTCGAAAAA GTC-3’)，預期擴增片段大小約為 536bp。
[0024]2、陽性對照:即含有鹿流行性出血病病毒的DNA片段
[0025]3、陰性對照:非鹿流行性出血病病毒的DNA片段
[0026]實施例2:檢測方法
[0027]按照以下步驟進行檢測:
[0028](I)樣品處理:取鹿流行性出血臨床病料于2009年10月采自河南鹿內臟器官。取
0.6g內臟組織于無菌研缽,加生理鹽水研磨，反復凍溶3次后6000rmp離心4min,取上清于-20°C保存。
[0029](2)病毒DNA的提取:將可疑病料組織懸浮液凍融3次，離心取上清450 μ L，加入蛋白酶K至終濃度500μ g/mL，加入SDS至終濃度10g/L，55°C水浴30min，用苯酚、苯酚-氯仿(體積比1:1)混合液及氯仿各抽提I次，吸取水相，加入1/10體積的3mol/LNaAc (pH5.2)及2.5倍體積的無水乙醇沉淀，12000r/min4°C離心15min,沉淀懸浮于超純水中，-20°C保存備用。
[0030](3)PCR擴增:PCR反應體系為50 μ L體系，反應體系中含PCR pre_mixl2 μ L，上下游Primer各I μ L，上述病毒質粒2 μ L，Η2034 μ L，瞬時離心混勻；PCR工作程序為:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s, 58°C退火 lmin30s, 72°C延伸 lmin, 15 個循環；72°C再延伸 IOmin,
4°C保存。
[0031](4)PCR擴增產物分析:結束后取6 μ L PCR擴增產物加于1%瓊脂糖凝膠孔中放于電壓為150V的電泳槽里電泳15min，于紫外投射儀中觀察結果。
[0032]從圖1可以看出:鹿流行性出血病病毒擴增出了一條約536bp的片段。
[0033]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出:對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的 保護范圍。
【權利要求】
1.一種用于檢測鹿流行性出血病病毒的引物對，其特征在于，所述引物對的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2。
2.一種鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒,它包含權利要求1所述的引物對。
3.根據權利要求2所述的鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒，其特征在于包括: 1)預混劑A:由核苷酸序列如SEQ ID N0:1的上游引物Pl 20 μ L，核苷酸序列如SEQID ΝΟ:2 的下游引物 Ρ2 20μ L,2XPCR pre-mix 200 μ L, ddH20 100 μ L 組成; 2)陰性對照:非鹿流行性出血病病毒的DNA片段600μ L ； 3)陽性對照:鹿流行性出血病病毒的DNA片段600μ L0
4.權利要求3所述的鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)抽提鹿流行性出血病病毒的質粒； 2)PCR擴增:PCR反應體系為50 μ L體系，反應體系中含PCR pre-mix 12 μ L，上下游Primer各I μ L，上述病毒質粒2 μ L7H2O 34 μ L，瞬時離心混勻；PCR工作程序為:94°C預變性 3min ;94°C變性 30 s，58°C退火 lmin30 s，72°C延伸 lmin，15個循環；72°C再延伸 10 min。 3)PCR擴增產物分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789456SQ201410076081
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年3月3日 優先權日:2014年3月3日
【發明者】詹愛軍 申請人:江蘇博愛生物科技有限公司