一種提高生物指示劑菌片指示菌回收率的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高生物指示劑菌片指示菌回收率的方法。本發明所提供的方法，包括如下步驟：1）將生物指示劑菌片置于裝有洗脫液的離心管中，并加入不銹鋼珠，用組織破碎儀進行破碎處理，得到破碎后樣品；2）將所述破碎后樣品進行渦旋震蕩，振蕩后用所述洗脫液進行稀釋，得到稀釋后樣品；3）將所述稀釋后樣品用100-400目細胞篩過濾，除去菌片碎屑，所得濾液為從所述生物指示劑菌片中獲得的指示菌的菌懸液。實驗證明，本發明方法指示菌回收率高達83.2%，且平板間和稀釋度間的誤差率均小于10%，結果穩定、重復性好，完全符合《消毒技術規范》的相關要求；且該方法簡便、可靠、易行。本發明為正確評價和判斷消毒滅菌效果提供了可靠且實用的解決方案。
【專利說明】一種提高生物指示劑菌片指示菌回收率的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物領域，涉及一種提高生物指示劑菌片指示菌回收率的方法。
【背景技術】
[0002]目前國內外公認，消毒滅菌有效性的驗證方法應能證明殘留的污染微生物的概率和可能性應低于 ICT6 [United States Environmental Protection Agency.Assessment of Liquid and Physical Decontamination Methods for EnvironmentalSurfaces Contaminated with Bacterial Spores Development and Evaluation of theDecontamination Procedural Steps [S].EPAj 2012.]，利用生物指不劑驗證消毒滅菌效果是國際公認的方法。
[0003]生物指示劑(bio-1ndicator, BI)是將適當載體染以一定量的特定微生物,用于指示消毒或滅菌效果的制品。我國衛生部2002年頒布的《消毒技術規范》規定，在進行消毒滅菌效果驗證或生物指示劑自身評價時，生物指示劑菌片的載菌量應為IX IO6~5 X IO6Cfu/片，回收菌數應在5X105~5X IO6Cfu/片，即要求BI菌片指示菌的回收率在50%~100%[衛生部衛生法治與監督司.消毒技術規范[S].中華人民共和國衛生部，2002.]。但是，采用該規范推薦的震蕩洗脫方法，在實際工作中對生物指示劑菌片上指示菌的洗脫效果較差，回收率遠達不到50%~100%。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種提高生物指示劑菌片指示菌回收率的方法。
[0005]本發明所提供的提聞生物指不劑菌片指不菌回收率的方法(或者為:從生物指不劑菌片中回收指示菌的方法)，具體可包括如下步驟:
[0006](I)將生物指示劑菌片置于裝有洗脫液的離心管中，并加入不銹鋼珠，用組織破碎儀進行破碎處理，得到破碎后樣品；
[0007](2)將所述破碎后樣品進行渦旋震蕩，振蕩后用所述洗脫液進行稀釋，得到稀釋后樣品；
[0008](3)將所述稀釋后樣品用100-400目(如200目)細胞篩過濾，除去菌片碎屑，所得濾液為從所述生物指示劑菌片中獲得的指示菌的菌懸液。
[0009]在步驟(1)中，所述進行破碎處理可為于10-30HZ (如30Hz)下震蕩2_5min (如5min)。
[0010]在步驟(1)中，所述生物指示劑菌片與所述洗脫液的配比可為I片:(1-1.5ml)，如
I片:1ml。
[0011]在步驟(1)中，所述不銹鋼珠的直徑為所述離心管管口直徑的25%-58% (如41.7%) ο
[0012]在步驟(1)中，向所述離心管中加入的所述不銹鋼珠的個數為I個。
[0013]在本發明中，步驟(1)中所述的組織破碎儀具體為德國QIAGEN公司生產的Tissuelyser II型組織破碎儀。
[0014]在本發明中，步驟(1)中所述的離心管為2ml PE圓底離心管，其管口直徑為12mm，管長為40mm ;對應采用的所述不銹鋼珠的直徑為3-7mm (如5mm)。
[0015]在步驟(1)中，在所述“將生物指示劑菌片置于裝有洗脫液的離心管中，并加入不銹鋼珠”后還包括將所述離心管加蓋后用封口膜將封閉管口的步驟。
[0016]在步驟(2)中，所述進行渦旋震蕩可為于1000-2500rpm (如25rpm)渦旋震蕩l_3min (如 2min)。
[0017]在步驟(2)中，振蕩后用所述洗脫液進行稀釋，為用所述洗脫液進行5-20倍(如10倍)稀釋。
[0018]進一步，所述洗脫液的溶劑為0.03mol/L磷酸鹽緩沖液，溶質及濃度如下:硫代硫酸鈉10g/L、吐溫-801.0g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉8.5g/L。
[0019]其中，所述0.03mol/L磷酸鹽緩沖液的溶劑為水，溶質及濃度如下:無水磷酸氫二鈉 2.83g/L ;磷酸二氫鉀 1.36g/L，ρΗ7.2-7.4。
[0020]在本發明中，步驟(2)中所述進行渦旋振蕩時采用的震蕩器為德國IKA公司生產的Vortex GENIUS3型渦旋震蕩器。
[0021 ] 在上述方法中，所述生物指示劑菌片的載菌介質為濾紙。
[0022]更加具體的，在本發明的一個實施例中，所述生物指示劑菌片為美國SGM BiotechInc.公司生產的二氧化氯氣體滅菌專用生物指示劑，其產品目錄號為SGMG/6 ;或北京四環衛生藥械廠有限公司生產的四環牌生物指示劑。以上兩生物指示劑菌片的指示菌均為枯草芽孢桿菌黑色變種(ATCC9372)`。
[0023]組織破碎儀在提高生物指示劑菌片指示菌回收率中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0024]在本發明中，所述組織破碎儀具體為德國QIAGEN公司生產的Tissuelyser II型組織破碎儀。
[0025]在上述方法中，所述生物指示劑菌片的載菌介質為濾紙。
[0026]更加具體的，在本發明的一個實施例中，所述生物指示劑菌片為美國SGM BiotechInc.公司生產的二氧化氯氣體滅菌專用生物指示劑，其產品目錄號為SGMG/6 ;或北京四環衛生藥械廠有限公司生產的四環牌生物指示劑。以上兩生物指示劑菌片的指示菌均為枯草芽孢桿菌黑色變種(ATCC9372)。
[0027]實驗證明，本發明采用QIAGEN組織破碎儀，利用不銹鋼珠在離心管中的高速震蕩使生物指示劑菌片完全破碎，結果獲得高達83.2%的指示菌回收率，遠高于傳統震蕩法指示菌的平均< 1.0%的回收率，且本發明方法平板間和稀釋度間的誤差率均小于10%，結果穩定、重復性好，完全符合《消毒技術規范》的相關要求。這說明本發明所建立的菌片破碎法簡便、可靠、易行。由于采取了破碎菌片的新思路，可以適用于所有以濾紙為載體的生物指示劑菌片，為正確評價和判斷消毒滅菌效果提供了可靠且實用的解決方案，對于不斷提高和完善我國的消毒技術規范具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1為采用本發明菌片破碎法(實驗組)指示菌的回收率。其中，SGM-U SGM-2和SGM-3為3個以進口 SGM生物指示劑菌片為供試生物指示劑菌片的平行樣本。
[0029]圖2為活菌培養計數操作計算誤差率。其中，SGM-U SGM-2和SGM-3為3個以進口 SGM生物指示劑菌片為供試生物指示劑菌片的平行樣本。
[0030]圖3為3種方法對指示菌回收率的影響。其中，CSV代表菌片破碎法(實驗組)；SV代表浸泡加渦旋震蕩法(對照組I) ;v代表僅渦旋震蕩法(對照組2)。
【具體實施方式】
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033]組織破碎儀:德國QIAGEN公司生產的Tissuelyser II型組織破碎儀。
[0034]渦旋震蕩器:德國IKA公司生產的Vortex GENIUS3型渦旋震蕩器。
[0035]洗脫液:溶劑為0.03mol/L磷酸鹽緩沖液，溶質及濃度如下:硫代硫酸鈉10g/L、吐溫-801.0g/L、蛋白胨 10g/L、氯化鈉 8.5g/L。
[0036]其中，所述0.03mol/L磷酸鹽緩沖液的溶劑為水，溶質及濃度如下:無水磷酸氫二鈉 2.83g/L ;磷酸二氫鉀 1.36g/L，ρΗ7.2-7.4。
[0037]胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA):溶劑為水，溶質及濃度如下:胰蛋白胨
1.5%(1.5g/100ml)、大豆蛋白胨 0.5%(0.5g/100ml)、氯化鈉 0.5%(0.5g/100ml)、瓊脂
1.6%(1.6g/100ml)，ρΗ7.2±0.2。
[0038]實施例1、本發明菌片破碎法提高生物指示劑菌片指示菌回收率
[0039]一、實驗材料與方法
[0040]供試生物指示劑菌片:美國SGM Biotech Inc.公司生產的二氧化氯氣體滅菌專用生物指示劑(產品目錄號為SGMG/6)，指示菌為枯草芽孢桿菌黑色變種(ATCC9372)，載菌量為1.6 X IO6Cfu/片。生物指示劑均在有效期內。
[0041]1、本發明菌片破碎法(實驗組)
[0042]( I)破碎處理
[0043]取3片(即3個平行樣本)供試生物指示劑菌片，將每片分別置于含有Iml洗脫液的2ml PE圓底離心管(管口直徑為12mm，管長為40mm)中，同時放入I顆滅菌的不銹鋼珠(直徑為5mm)，加蓋后用封口膜封閉管口。將離心管裝在組織破碎儀上，于30Hz下震蕩5min，然后在渦旋振蕩器上于2500rpm下渦旋震蕩2min。
[0044](2)稀釋、過濾及檢測
[0045]將渦旋震蕩后離心管內菌片破碎混懸液移至50ml離心管中，用洗脫液作10倍稀釋；然后用200目細胞篩過濾除去菌片碎屑。將經過濾的菌懸液用洗脫液作梯度稀釋(稀釋度分別為:1.7X 10_3、3.3X 10_3、6.6X 10_3)，每樣品分別取3個稀釋度的菌懸液涂板(250 μ I/板，TSA固體培養基)，每樣品每稀釋度做6個重復。置37°C培養箱中培養12-18h后進行菌落計數并計算指示菌的回收菌數、回收率和誤差率(平板間誤差率和稀釋度間誤差率)。
[0046]其中，
[0047]
【權利要求】
1.一種提高生物指示劑菌片指示菌回收率的方法，包括如下步驟: (1)將生物指示劑菌片置于裝有洗脫液的離心管中，并加入不銹鋼珠，用組織破碎儀進行破碎處理，得到破碎后樣品； (2)將所述破碎后樣品進行渦旋震蕩，振蕩后用所述洗脫液進行稀釋，得到稀釋后樣品; (3)將所述稀釋后樣品用100-400目細胞篩過濾，除去菌片碎屑，所得濾液為從所述生物指不劑菌片中獲得的指不菌的菌懸液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述進行破碎處理為于10-30Hz 下震蕩 2-5min。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述生物指示劑菌片與所述洗脫液的配比為I片:(1-1.5ml)。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述不銹鋼珠的直徑為所述離心管管口直徑的25%-58%。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述進行渦旋震蕩為于 1000-2500rpm 渦旋震蕩 l_3min。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，振蕩后用所述洗脫液進行稀釋，為用所述洗脫液進行5-20倍稀釋。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述洗脫液的溶劑為0.03mol/L磷酸鹽緩沖液,溶質及濃度如下:硫代硫酸鈉10g/L、吐溫-801.0g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉 8.5g/L。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述生物指示劑菌片的載菌介質為濾紙。
9.組織破碎儀在提高生物指示劑菌片指示菌回收率中的應用。
10.根據權利要求9所述 的應用，其特征在于:所述生物指示劑菌片的載菌介質為濾紙。
【文檔編號】C12N1/20GK103865848SQ201410080507
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月6日 優先權日:2014年3月6日
【發明者】朱以萍, 張瑞豐, 謝清, 黃力勤, 陸兵, 呂京 申請人:中國科學院微生物研究所